Articolo metodologico

Un modello di asfissia perinatale da maialino per studiare la lesione cardiaca e l'emodinamica dopo l'arresto cardiaco, la rianimazione e il ritorno della circolazione spontanea

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DOI:

10.3791/64788

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13 gennaio 2023

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1Institute of Clinical Medicine, Faculty of Medicine, University of Oslo, 2Department of Neonatal Intensive Care, Division of Pediatric and Adolescent Medicine, Oslo University Hospital Rikshospitalet, 3Department of Pediatric Research, Division of Paediatric and Adolescent Medicine, Oslo University Hospital Rikshospitalet, 4Department of Pediatrics, Vestfold Hospital Trust, 5Department of Anesthesiology, Oslo University Hospital Rikshospitalet, 6Department of Pediatrics, Faculty of Medicine and Dentistry, University of Alberta, 7Centre for the Studies of Asphyxia and Resuscitation, Neonatal Research Unit, Royal Alexandra Hospital, 8Division of Paediatric and Adolescent Medicine, Institute of Clinical Medicine, University of Oslo, 9Department of Paediatrics and Adolescent Health, University of Botswana, 10Department of Pediatric Research, Oslo University Hospital, University of Oslo, 11Department of Pediatrics, Robert H Lurie Medical Research Center, Northwestern University Chicago

In questo articolo

Sommario

Questo modello di suinetto prevede strumentazione chirurgica, asfissia fino all'arresto cardiaco, rianimazione e osservazione post-rianimazione. Il modello consente il campionamento multiplo per animale e, utilizzando la pressione arteriosa invasiva continua, l'ECG e il monitoraggio non invasivo della gittata cardiaca, fornisce conoscenze sull'emodinamica e sulla fisiopatologia cardiaca nell'asfissia perinatale e nella rianimazione cardiopolmonare neonatale.

Abstract

I suinetti neonatali sono stati ampiamente utilizzati come modelli traslazionali per l'asfissia perinatale. Nel 2007, abbiamo adattato un modello consolidato di asfissia dei suinetti introducendo l'arresto cardiaco. Questo ci ha permesso di studiare l'impatto dell'asfissia grave sugli esiti chiave, incluso il tempo impiegato per il ritorno della circolazione spontanea (ROSC), nonché l'effetto delle compressioni toraciche secondo protocolli alternativi per la rianimazione cardiopolmonare. A causa delle somiglianze anatomiche e fisiologiche tra suinetti e neonati umani, i suinetti fungono da buoni modelli negli studi di rianimazione cardiopolmonare e monitoraggio emodinamico. In effetti, questo modello di arresto cardiaco ha fornito prove per lo sviluppo di linee guida attraverso la ricerca su protocolli di rianimazione, fisiopatologia, biomarcatori e nuovi metodi per il monitoraggio emodinamico. In particolare, la scoperta incidentale che una frazione sostanziale di suinetti ha attività elettrica senza polso (PEA) durante l'arresto cardiaco può aumentare l'applicabilità del modello (cioè, può essere utilizzato per studiare la fisiopatologia che si estende oltre il periodo perinatale). Tuttavia, la generazione del modello è tecnicamente impegnativa e richiede vari set di competenze, personale dedicato e un buon equilibrio delle misure, compresi i protocolli chirurgici e l'uso di sedativi / analgesici, per garantire un ragionevole tasso di sopravvivenza. In questo documento, il protocollo è descritto in dettaglio, così come le esperienze con gli adattamenti al protocollo nel corso degli anni.

Introduzione

L'asfissia perinatale è causata da uno scambio gassoso compromesso (ipossiemia e ipercapnia) prima, durante e/o dopo la nascita. Si traduce in riduzione del flusso sanguigno (ischemia) agli organi vitali e conseguente acidosi respiratoria e metabolica mista. L'asfissia perinatale è una complicanza comune alla nascita che ogni anno causa 580.000 morti infantili in tutto il mondo1. Diminuire questo numero è essenziale per ridurre le morti nei neonati e nei bambini sotto i 5 anni di età, come indicato nell'obiettivo di sviluppo sostenibile delle Nazioni Unite numero 3.2 (cioè mortalità neonatale <12 per 1.000 nati vivi e mortalità sotto i 5 anni <25 per 1.000 nati vivi)2.

Dal punto di vista clinico, l'asfissia si presenta come encefalopatia ipossico-ischemica (HIE), depressione respiratoria e insufficienza circolatoria nel neonato3 (cioè sintomi e segni di ipossia e ischemia degli organi vitali)4. Di conseguenza, un bambino asfissiato può aver bisogno di un trattamento per l'encefalopatia, comprese le convulsioni, e supporto respiratorio e circolatorio avanzato. A livello globale, ogni anno, ben 10 milioni di bambini richiedono una qualche forma di intervento, come la stimolazione tattile, e 6-7 milioni di bambini richiedono ventilazione assistita alla nascita5. Pertanto, l'asfissia perinatale mette a dura prova il sistema sanitario, con implicazioni socioeconomiche associate. Per ridurre il carico globale di malattia attribuito all'asfissia perinatale, i nostri gruppi di ricerca ritengono che le seguenti aree di interesse dovrebbero essere studiate negli studi scientifici: prevenzione, compreso il miglioramento delle cure prenatali e ostetriche e del follow-up; biomarcatori prognostici; e rianimazione e stabilizzazione ottimizzate della sala parto6.

I suinetti appena nati e i neonati umani a breve termine hanno anatomia e fisiopatologia simili7. Sebbene nessun modello animale di asfissia perinatale e arresto cardiaco possa creare l'aspetto completo della transizione perinatale fallita che porta all'asfissia e all'arresto cardiaco, i suinetti sono buoni modelli traslazionali.

Già nel 1970, abbiamo sviluppato un modello di ipossia nei suini adulti8. È stato perfezionato con successo dai gruppi di ricerca9, fornendo così un modello suinetto di asfissia perinatale 10,11,12,13,14,15,16,17,18. Nel 2007, i primi esperimenti con arresto cardiaco nei suinetti sono stati eseguiti presso l'Istituto per la ricerca chirurgica presso l'Ospedale universitario di Oslo11,13,15,16. Il modello di arresto ha fornito prove per lo sviluppo di linee guida 10,13,15,16,19,20, nonché vaste opportunità per studi fisiologici e test di attrezzature / strumenti diagnostici 14,21, protocolli di rianimazione (studi randomizzati controllati) 13,15,16,22, e biomarcatori del sangue e dei tessuti 10,12,20. Pertanto, il modello ha dimostrato di essere versatile e una singola serie sperimentale è stata tradizionalmente utilizzata per rispondere a diverse domande di ricerca. Questo è importante e in accordo con le tre R (riduzione, sostituzione e perfezionamento) della ricerca animale sperimentale23 (cioè, il principio di ridurre il numero di animali sacrificati per scopi scientifici).

Nel seguente protocollo, il modello suinetto di asfissia perinatale è descritto in dettaglio, incluso come indurre, definire e accertare l'arresto cardiaco. Il modello è stato perfezionato per ridurre al minimo l'esposizione a sedativi e interventi chirurgici e comprende ventilazione meccanica, asfissia, rianimazione, osservazione post-rianimazione e raccolta di campioni di sangue, urina e liquido cerebrospinale. I nostri gruppi raccolgono tradizionalmente anche tessuti da organi vitali postmortem, ma la procedura di raccolta dei tessuti non è descritta in dettaglio in questo protocollo. Il modello simula un insulto ipossico con acidosi respiratoria e metabolica mista, che riflette la biochimica dei neonati umani asfittici. Con l'attento monitoraggio dei suinetti con valutazioni invasive della pressione sanguigna (BP) e della frequenza cardiaca (FC), della pulsossimetria (PO), dell'elettrocardiogramma (ECG), della cardiografia ad impedenza (ICG) e della spettroscopia nel vicino infrarosso (NIRS), è possibile studiare in dettaglio la fisiologia dell'asfissia perinatale, con particolare attenzione al cuore.

Il modello è tecnicamente impegnativo, poiché è necessario un equilibrio molto sottile tra i farmaci, gli interventi chirurgici e il metodo per indurre l'arresto cardiaco per garantire un ragionevole tasso di sopravvivenza. Condurre gli esperimenti richiede una preparazione approfondita e un team dedicato e ben funzionante. Anche la selezione di animali da esperimento sembra svolgere un ruolo importante nel garantire il successo degli esperimenti. In questo documento, descriviamo il protocollo in dettaglio e le nostre esperienze con esso.

Protocollo

Il protocollo è stato approvato dall'Autorità norvegese per la sicurezza alimentare (approvazione nr. 25030) e gli esperimenti sono stati condotti secondo le normative europee, norvegesi e istituzionali. La replica di questo modello richiede l'ottenimento dell'approvazione etica per gli esperimenti sugli animali in linea con le normative istituzionali e nazionali e la garanzia di condurre gli esperimenti secondo le tre Rs23. Tutto il personale che si occupa degli animali deve essere certificato con le funzioni A, B e D ai sensi dell'articolo 23 e dell'articolo 24 della direttiva UE 2010/63/UE24 o equivalente. Monitorare attentamente gli animali durante l'intero esperimento e regolare l'anestesia, le impostazioni del ventilatore, la temperatura e il posizionamento degli animali per garantire il benessere degli animali. Valutare criticamente il modello e la sua applicazione regolarmente e perfezionarli come richiesto e possibile.

NOTA: I suinetti utilizzati in questo studio avevano un'età compresa tra 12 e 36 ore, pesavano 1,7-2,3 kg, avevano un'equa distribuzione di genere, erano di razza mista norvegese Landrace, Duroc e Yorkshire ed erano geneticamente non modificati. La fase 1 e la fase 2 del protocollo includono l'anestesia generale e le procedure di campionamento dei dati che si applicano durante l'esperimento, e le fasi 3-10 descrivono in dettaglio le procedure sperimentali, compresa la preparazione degli animali, l'intervento chirurgico, l'asfissia fino all'arresto cardiaco, la rianimazione e l'osservazione post-rianimazione.

1. Protocollo di anestesia (TIME: si applica all'intero esperimento)

  1. Indurre l'anestesia con un bolo di fentanil IV (50 μg/kg) e pentobarbital (15-20 mg/kg) in un catetere venoso periferico in una vena dell'orecchio.
    ATTENZIONE: Il fentanil è dannoso se inalato o ingerito e irrita gli occhi e la pelle. È anche un farmaco limitato. La sua fornitura e il suo uso dovrebbero essere monitorati e regolamentati secondo le normative per le droghe soggette a restrizioni. Il pentobarbital è dannoso se ingerito e irrita gli occhi e la pelle.
  2. Mantenere l'anestesia con fentanil per via endovenosa (50 μg/kg/h) fino all'asfissia, quindi interrompere durante l'asfissia e ripristinare a 25 μg/kg/h dopo il ritorno della circolazione spontanea (ROSC).
    NOTA: L'anestesia ad alte dosi di fentanil utilizzata in questo modello deriva da decine di anni di perfezionamento del modello in uno sforzo collaborativo che coinvolge neonatologi e anestesisti pediatrici. L'anestesia con fentanil ad alte dosi è associata alla stabilità cardiovascolare ed emodinamica25,26 negli adulti umani e nei neonati. Tuttavia, uno studio condotto su suinetti neonati ha dimostrato che l'uso di fentanil era associato a una riduzione della FC e della gittata cardiaca (CO) e ad un aumento della pressione arteriosa media (MAP), della pressione diastolica ventricolare sinistra e dell'indice di resistenza periferica totale27.
  3. Monitorare il benessere del maialino durante l'intero esperimento. Controlla il tono muscolare e valuta i parametri vitali per assicurarti che il maialino sia completamente anestetizzato. Se il suinetto mostra segni di angoscia, somministrare ulteriore fentanil IV o pentobarbital IV secondo il giudizio clinico.

2. Campionamento dei dati e registrazioni (TIME: si applica all'intero esperimento)

  1. Stampare un modulo di registrazione della cassa cartacea (CRF) per ogni suinetto. Il CRF contiene informazioni su HR, BP (incluso MAP), saturazione di ossigeno (SpO2), saturazione di ossigeno cerebrale regionale (NIRS), temperatura, farmaci extra forniti e brividi.
  2. Sul CRF, dai al maialino un numero ID e registra il peso e il sesso del maialino sulla prima pagina.
  3. Effettuare le registrazioni ogni 5 minuti durante il periodo di stabilizzazione e poco prima dell'induzione dell'asfissia. Dopo l'induzione dell'asfissia, effettuare la prima registrazione dopo 10 minuti e poi ogni 5 minuti fino all'arresto cardiaco. Se il ROSC viene raggiunto, effettuare le registrazioni il prima possibile dopo ROSC, ogni 5 minuti per la prima ora dopo ROSC e poi ogni 30 minuti per il resto del periodo di osservazione.
  4. Sul CRF, indicare quando raccogliere i diversi campioni.
    1. Raccogliere sangue e plasma completi all'inizio della stabilizzazione, poco prima dell'induzione dell'asfissia, all'arresto cardiaco, al ROSC, 30 min, 60 min, 120 min, 240 min e 540 min dopo ROSC, e alla fine dello studio (570 min).
      NOTA: È importante calcolare quanto sangue può essere prelevato da ciascun maialino. Ad esempio, meno sangue può essere prelevato da suinetti più piccoli, suinetti instabili e suinetti che hanno subito una perdita di sangue dall'intervento chirurgico al collo. È anche fondamentale osservare l'emoglobina (Hb) dallo stato acido-base durante l'esperimento. In questo studio sono stati esclusi i suinetti con Hb <6 g/dL.
    2. Raccogliere l'urina a 240 minuti dopo ROSC e alla fine dello studio (570 min).
    3. Prendi lo stato acido-base all'inizio della stabilizzazione, appena prima dell'induzione dell'asfissia, 10 minuti dopo l'induzione dell'asfissia e poi ogni 5 minuti fino all'arresto cardiaco. Prendere lo stato acido-base all'arresto cardiaco, a ROSC, 5 min, 15 min, 30 min, 60 min, 120 min, 240 min e 540 min dopo ROSC, e alla fine dello studio (570 min).
    4. Raccogliere il liquido cerebrospinale (CSF) alla fine dello studio (570 min).
  5. Raccogliere sangue pieno e plasma dal catetere arterioso centrale.
    1. Prelevare 2 ml di sangue dal catetere arterioso centrale in una siringa eparinizzata e mettere da parte.
    2. Quindi, prelevare 2,5 ml di sangue in una nuova siringa eparinizzata. Introdurre 0,5 ml dell'ultimo sangue pieno prelevato in una provetta da microcentrifuga e congelare a scatto in azoto liquido.
    3. Introdurre i restanti 2 mL in un flaconcino di EDTA di dimensioni appropriate e centrifugare a 1.700 x g a 4 °C per 10 minuti. Pipettare il plasma (che si separa dal buffy coat e dagli eritrociti come strato superiore) in provette per microcentrifuga e congelare a scatto in azoto liquido.
    4. Prelevare altri 0,2 ml di sangue dal catetere arterioso centrale in una nuova siringa eparinizzata. Posizionare la siringa nella macchina acido-base (vedere Tabella dei materiali) e inserire le informazioni pertinenti (ID, punto temporale e temperatura del maialino).
    5. Spingere il sangue che è stato prelevato nella prima siringa eparinizzata nel catetere arterioso. Lavare il catetere arterioso con soluzione salina normale eparinizzata per garantire che tutto il sangue venga restituito alla circolazione del maialino.
  6. Raccogliere l'urina mediante aspirazione sovrapubica delle urine.
    1. Individua i punti di riferimento: l'area tra la terza e la seconda coppia più bassa di capezzoli, circa 2 cm sotto l'ombelico e alcuni millimetri lateralmente alla linea mediana.
    2. Utilizzare una siringa da 10 mL con una cannula da 23 G. Far avanzare la cannula verticalmente di circa 1 cm e aspirare fino a quando la siringa si riempie di urina. Metti l'urina in un tubo criogenico e congela a scatto in azoto liquido.
  7. Raccogliere CSF da una puntura lombare.
    1. Metti il maialino su un fianco e tira gli arti posteriori verso il petto. Individua i punti di riferimento: tra le etichette spinali a livello della cresta iliaca del maialino.
    2. Far avanzare una cannula da 21 G leggermente cranialmente tra le etichette spinali fino a quando il CSF emerge. Mettere il liquido cerebrospinale in provette da microcentrifuga e congelare a scatto in azoto liquido.
    3. Raccogliere ECG continuo e dati arteriosi invasivi (vedere punto 6 e passaggio 7) utilizzando un software di acquisizione e analisi dei dati (vedere Tabella dei materiali). Eseguire NIRS (vedere il passaggio 7) con una macchina NIRS disponibile in commercio (vedere Tabella dei materiali).

3. Preparazione (TEMPO: settimane o mesi, per tutto il tempo necessario)

  1. Ottenere l'approvazione etica per gli esperimenti sugli animali.
  2. Contatta un agricoltore e organizza la selezione dei suinetti (età: 12-36 ore, uguale distribuzione di genere, peso: 1,7-2,3 kg), la data di consegna e le modalità di trasporto.
    NOTA: Selezionare suinetti della stessa razza (in questo studio, un mix di Landrace norvegese, Duroc e Yorkshire) e allevamento, idealmente dalla stessa cucciolata e all'interno di una fascia di età ristretta, è importante per ridurre la varianza biologica e fisiologica.
  3. Assicurati che il personale sia disponibile alle date stabilite.
  4. Verificare che tutte le attrezzature necessarie siano disponibili e che tutti gli strumenti e gli strumenti di osservazione funzionino. Controllare la data di scadenza del gas asfissia (8% O 2, 92% N2) e che non sia vuoto.
  5. Impostare il laboratorio e tutte le attrezzature in modo che sia pronto per l'accoglienza dei maialini. Calibrare tutte le attrezzature necessarie.
  6. Eseguire la stima delle dimensioni del campione nel caso di uno studio controllato randomizzato e preparare la randomizzazione dei suinetti.

4. Ricezione di suinetti (TEMPO: da 10 minuti a 2 ore, a seconda del numero di suinetti)

  1. Organizzare il trasporto dei maialini domestici dalla fattoria alla struttura chirurgica il giorno degli esperimenti. Coprire il "pavimento" del contenitore con trucioli di legno fine e bottiglie di acqua calda per mantenere la temperatura dei maialini. Fare fori di bava nel contenitore per garantire la circolazione dell'aria.
  2. Ottenere informazioni dall'agricoltore sull'età e sul peso dei suinetti. Verifica il loro peso all'arrivo.
  3. Misurare SpO2 e FC posizionando una sonda pulsossimetrica (PO) (vedere la tabella dei materiali) sull'arto posteriore del maialino mentre il maialino è calmo e a suo agio nel contenitore.
  4. Preparare tutti gli strumenti e accendere il calore sui materassi elettrici sul tavolo chirurgico.
  5. Lascia riposare i maialini nel contenitore fino a quando tutti i membri della squadra sono pronti per l'induzione dell'anestesia e l'intervento chirurgico.

5. Induzione di anestesia, intubazione e ventilazione meccanica (TEMPO: 15 min)

  1. Preparare l'attrezzatura per l'accesso IV e l'intubazione.
  2. Applicare la sonda PO su un arto posteriore per il monitoraggio dell'ossigenazione e della FC durante l'induzione dell'anestesia e dell'intubazione.
  3. Assicurati che la persona tenga il maialino fasciato fermo e calmo. Assicurarsi che la persona due inserisca un catetere endovenoso periferico in una vena dell'orecchio. Lavare il catetere con circa 1 mL di soluzione salina normale per confermare il posizionamento. Fissare il catetere con del nastro adesivo.
  4. Iniettare una dose in bolo di fentanil e pentobarbital nella vena dell'orecchio (come descritto al punto 1.1). Lavare il catetere con 1 mL di soluzione salina normale. Controllare che il maialino sia anestetizzato valutando i riflessi di astinenza.
  5. Assicurarsi che la persona ponga il maialino in posizione supina. Apri la bocca e tira fuori la lingua con un tampone di garza di 10 cm x 10 cm. Mantieni la laringe in linea retta.
  6. Assicurarsi che la persona due usi il laringoscopio (vedi Tabella dei materiali) per sollevare la lingua. Avanzare il laringoscopio per sollevare l'epiglottide e visualizzare le corde vocali. Far avanzare il tubo endotracheale (ETT, vedi Tabella dei materiali) attraverso le corde vocali.
    NOTA: L'uso di un ETT con manette può rendere più impegnativo l'avanzamento dell'ETT attraverso le corde vocali. Se l'intubazione è difficile, è particolarmente importante osservare i segni vitali del maialino. Se i parametri vitali cadono, posizionare una maschera sul muso del maialino, collegare la maschera a una sacca autogonfiante e ventilare manualmente il maialino fino a quando i parametri vitali non si normalizzano. Quindi, prova di nuovo a intubare. Se è ancora impegnativo, prendere in considerazione la somministrazione di una dose extra di pentobarbital. In rari casi (ad esempio, anomalia delle vie aeree superiori), deve essere eseguita una tracheostomia. Tuttavia, con personale esperto, l'intubazione viene solitamente eseguita facilmente.
  7. Collegare l'ETT a un sacchetto autogonfiabile (vedere Tabella dei materiali) e avviare la ventilazione manuale.
  8. Confermare il corretto posizionamento dell'ETT mediante 1) aumento del torace bilaterale e simmetrico durante la ventilazione, 2) suoni respiratori bilaterali e simmetrici sui campi polmonari senza alcun suono di ingresso dell'aria sopra l'epigastrio, 3) risposte SpO2 e HR e 4) condensazione all'interno dell'ETT. La CO2 scaduta potrebbe anche essere misurata (semi)quantitativamente in caso di dubbio.
  9. Gonfiare il bracciale ETT. Fissare l'ETT a una profondità di 12-13 cm (per un maialino di 2 kg) con nastro adesivo diviso longitudinalmente a metà. Avvolgere il nastro attorno alla parte dell'ETT immediatamente distale ai denti anteriori e continuare intorno al muso.
  10. Continuare a ventilare manualmente il suinetto fino a quando non viene trasferito sul tavolo di intervento chirurgico dove è collegato a un ventilatore meccanico. Sul tavolo, collegare l'ETT al ventilatore meccanico (vedere Tabella dei materiali) con le seguenti impostazioni: P Insp = 15-20 cm H 2 O, Peep = 5,0 cm H2O, Flow Insp = 8,0 L/min, Frequenza = 30 bpm e T Insp = 0,34 s.
    NOTA: Se il suinetto ha SpO 2 <90%, il PInsp e la frequenza possono essere aumentati fino a quando l'SpO2 è ≥90%. L'ossigeno supplementare potrebbe essere utilizzato se il protocollo di rianimazione non comporta il confronto di diversi FiO2.
  11. Posizionare un termometro rettale e fissarlo con del nastro chirurgico intorno alla coda del maialino.
  12. Mantenere la temperatura del suinetto (38,5-39,0 °C) con coperte/asciugamani caldi drappeggiati intorno al maialino come un nido, regolando la temperatura del materasso riscaldante sotto il maialino e/o riempiendo guanti di gomma/lattice con acqua calda e mettendoli negli asciugamani che circondano il maialino. Guarda la temperatura del maialino durante l'intervento chirurgico ed esegui misure di stabilizzazione della temperatura secondo necessità.

6. Intervento chirurgico (TEMPO: 20 min)

  1. Preparare tutta l'attrezzatura necessaria e riempire tutti i cateteri con soluzione salina normale (Figura 1). Annotare l'ora in cui inizia l'intervento chirurgico sulla CRF.
  2. Sterilizzare la pelle del maialino anestetizzato con 5 mg/ml di clorexidina colorata usando 3-5 spugne chirurgiche.
  3. Fare un'incisione cutanea lunga 2,5 cm sul lato destro del collo del maialino usando un bisturi.
  4. Utilizzare divaricatori palpebrali per ritrarre la pelle su entrambi i lati dell'incisione.
  5. Utilizzare una pinza arteriosa per sezionare ed esporre la vena giugulare interna (Figura 2).
  6. Posizionare due fili di sutura in nylon 3-0 sotto la vena giugulare per mantenerla stabile.
  7. Tenere una delle suture in una mano e il catetere venoso centrale nell'altra (Figura 3). Inserire il catetere venoso centrale e ritirare l'ago.
  8. Legare uno dei fili di sutura utilizzati per tenere la vena intorno alla vena (e al catetere) nell'area in cui il catetere si trova all'interno della vena (Figura 4).
    NOTA: Assicurarsi che la sutura di mantenimento non sia legata troppo strettamente attorno al catetere e che il nodo sia prossimale alla punta distale del catetere.
  9. Sciacquare con 1 mL di soluzione salina normale per confermare il corretto posizionamento del catetere.
  10. Chiudere la pelle con suture 4-0 assorbibili.
  11. Collegare fentanil 50 μg/kg/h e una soluzione bilanciata di carboidrati-elettroliti (10 mg/ml di glucosio, vedere Tabella dei materiali) al catetere venoso centrale.
  12. Fare un'incisione cutanea lunga 2,5 cm sul lato sinistro del collo del maialino usando un bisturi. Rendere l'incisione leggermente più mediale rispetto all'incisione sul lato destro del collo.
  13. Utilizzare divaricatori palpebrali per ritrarre la pelle su entrambi i lati dell'incisione.
  14. Quindi, utilizzare una pinza arteriosa per sezionare ed esporre l'arteria carotide comune (mediale al muscolo sternocleidomastoideo).
  15. Posizionare due fili di sutura in nylon 3-0 sotto l'arteria carotide comune per mantenerla stabile.
  16. Tenere una delle suture in una mano e il catetere arterioso centrale nell'altra. Inserire il catetere arterioso centrale e ritirare l'ago.
  17. Legare uno dei fili di sutura che è stato utilizzato per tenere l'arteria intorno all'arteria (e il catetere) nella zona in cui il catetere è all'interno dell'arteria.
    NOTA: Assicurarsi che la sutura di mantenimento non sia legata troppo strettamente attorno al catetere e che il nodo sia prossimale alla punta distale del catetere.
  18. Sciacquare con 1 mL di soluzione salina normale per confermare il corretto posizionamento del catetere.
  19. Utilizzare punti di sutura 4-0 riassorbibili per fissare le ali del catetere alla pelle e chiudere la pelle.
  20. Collegarsi al monitoraggio arterioso invasivo della pressione arteriosa (vedere Tabella dei materiali) e iniziare a registrare utilizzando il software di acquisizione e analisi dei dati.
    NOTA: Assicurarsi che il trasduttore arterioso invasivo della BP sia calibrato a livello cardiaco per ottenere letture corrette della BP.
  21. Coprire con una medicazione trasparente. Ora, il catetere arterioso centrale è in posizione.
  22. Annotare sul CRF l'ora in cui l'intervento chirurgico è terminato.

7. Stabilizzazione (TEMPO: minimo 1 ora, ma per il tempo necessario a stabilizzare il suinetto dopo l'intervento chirurgico e al personale per prepararsi all'induzione dell'asfissia)

  1. Collegare il suinetto all'apparecchiatura di monitoraggio ECG (vedere Tabella dei materiali).
    1. Rasare e rimuovere i peli se necessario prima di posizionare gli elettrodi. Posizionare due elettrodi su ciascun lato del torace, sul lato mediale di ciascun arto superiore. Posizionare il terzo elettrodo sul lato sinistro dell'ombelico.
    2. Collegare i cavi agli elettrodi e iniziare a registrare utilizzando il software di acquisizione e analisi dei dati.
  2. Collegare il suinetto a un dispositivo di monitoraggio del CO non invasivo (vedere Tabella dei materiali).
    1. Rasare e rimuovere i peli secondo necessità prima di posizionare gli elettrodi (vedere Tabella dei materiali). Posizionare il primo elettrodo sulla parte superiore della testa del maialino, appena dietro gli occhi, il secondo sul lato sinistro del collo, il terzo sul lato sinistro dell'addome, medioascellare a livello dell'ombelico e il quarto elettrodo sulla coscia sinistra.
    2. Inserisci le informazioni pertinenti sul dispositivo e avvia la registrazione. A causa della limitata memoria interna, regolare la frequenza di campionamento in base alla durata dell'esperimento.
  3. Collegare il maialino al monitoraggio NIRS.
    1. Rasare e rimuovere i peli se necessario prima di posizionare gli elettrodi. Posizionare gli elettrodi NIRS (vedere la tabella dei materiali) sulla parte superiore della testa del maialino, dietro l'elettrodo CO non invasivo e fissare con nastro adesivo non trasparente per proteggere dalla luce.
  4. Collegare il suinetto a un'apparecchiatura di monitoraggio aggiuntiva, se applicabile, ed eseguire l'ecocardiografia se questo fa parte del protocollo sperimentale.
  5. Posizionare il maialino in una posizione comoda, preferibilmente prona.
  6. Effettuare le misurazioni e le registrazioni e registrare sul CRF durante il periodo di stabilizzazione (vedere il passaggio 2).
  7. Osservare il maialino per quanto riguarda la temperatura, SpO2, HR, BP e brividi durante il periodo di stabilizzazione. Regolare le impostazioni del ventilatore meccanico e la temperatura del maialino e somministrare anestesia supplementare a seconda dei casi.

8. Induzione di asfissia e arresto cardiaco (TEMPO: 15-60 min, varia tra i suinetti)

NOTA: Tutto il personale coinvolto deve conoscere il proprio ruolo prima dell'induzione dell'asfissia.

  1. Decidere un momento per iniziare l'asfissia (in base alla durata della stabilizzazione e alla disponibilità del personale) e scriverlo sul CRF.
  2. Annotare le misurazioni fisiologiche del maialino sul CRF e prelevare campioni di sangue appena prima dell'induzione dell'asfissia.
  3. Interrompere il fentanil IV subito prima dell'inizio dell'asfissia.
  4. Per avviare l'asfissia, ruotare la manopola dell'ossigeno sul ventilatore meccanico al 100% e commutare il tubo dell'ossigeno sul ventilatore sul gas asfissia (8% O 2, 92% N2).
  5. Ridurre la velocità del ventilatore di 10 gonfiaggi/min.
  6. Assicurarsi che l'SpO2 del maialino stia cadendo per assicurarsi che l'induzione abbia successo.
  7. Dopo 10 minuti di asfissia, ridurre la velocità del ventilatore di altri 10 gonfiaggi/min.
  8. Dopo 10 minuti di asfissia, e successivamente ogni 5 minuti, prendere lo stato acido-base e annotare le misurazioni fisiologiche del maialino sul CRF. Continuare fino all'arresto cardiaco.
  9. Dopo 20 minuti di asfissia, ridurre la velocità del ventilatore di altri 10 gonfiaggi/min.
  10. Dopo 30 minuti di asfissia, bloccare l'ETT con una pinza arteriosa.
  11. Quando la MAP scende sotto i 20 mm Hg, inizia l'auscultazione continua del cuore.
    NOTA: L'arresto cardiaco è definito come un battito cardiaco non udibile dall'auscultazione e/o dalla perdita della pulsazione della linea arteriosa. Si noti che può verificarsi attività elettrica senza impulsi (PEA) sull'ECG.
  12. Assicurati che quella persona ausculti il cuore. Chiama ad alta voce quando il battito cardiaco non è più udibile (arresto cardiaco) mentre rimuovi il morsetto ETT. Assicurarsi che la persona due commuta il tubo del gas asfissia sul ventilatore all'uscita dell'ossigeno. Registra il tempo dell'arresto cardiaco sul CRF e avvia un timer.
  13. Impostare il FiO 2 come assegnato dal protocollo (in questo studio, i suinetti sono stati randomizzati a ricevere un FiO2 di 0,21 o 1,0). Impostare le impostazioni del ventilatore come segue: P Insp = 30 cm H 2 O, Peep = 5,0 cmH2O, Flow Insp = 8,0 L/min, Frequenza = 40 bpm e TInsp = 0,34 s.
  14. Prelevare campioni di sangue dal punto temporale dell'arresto cardiaco, come descritto al punto 2.5.

9. Rianimazione cardiopolmonare (RCP) (TEMPO: 0-15 min)

NOTA: La RCP può essere condotta secondo le linee guida28 dell'International Liaison Committee on Resuscitation (ILCOR), con un rapporto 3:1 tra compressione toracica e ventilazione o rapporti diversi tra compressioni toraciche e ventilazioni a seconda dello scopo dello studio.

  1. Se si utilizza la RCP 3:1 consigliata dall'ILCOR, attenersi alla seguente procedura.
    1. Ventilare meccanicamente il maialino per 30 secondi dopo l'arresto cardiaco. Quindi, avviare le compressioni toraciche e mirare a un rapporto tra compressione toracica e ventilazione 3: 1.
      NOTA: Poiché il ventilatore esegue le ventilazioni e non una persona, le compressioni toraciche e le ventilazioni possono talvolta essere simultanee/non coordinate.
    2. Comprimere il torace ad una profondità di 1/3 del diametro anteroposteriore toracico, consentire il rinculo completo del torace e utilizzare la tecnica delle mani che circondano due pollici. Obiettivo di generare una pressione arteriosa sistolica ≥20 mm Hg.
    3. Somministrare adrenalina (0,02-0,03 mg/kg) IV dopo 30 s di compressione toracica e poi ogni 3 minuti di RCP (massimo quattro dosi). Sciacquare con 1 mL di soluzione salina normale dopo ogni somministrazione di adrenalina.
  2. Determinare ROSC osservando i tracciati arteriosi della BP e l'ECG e confermare mediante auscultazione cardiaca. La definizione di ROSC è una HR stabile e non assistita ≥100 bpm.
  3. Continuare gli sforzi di rianimazione fino a ROSC o per un massimo di 15 minuti. Se la RCP non ha successo entro 15 minuti, interrompere gli sforzi di rianimazione, indicare l'ora della morte e registrare sul CRF.
  4. Se gli sforzi di rianimazione hanno successo, annotare sul CRF il tempo di ROSC, la durata della RCP in secondi e il numero di dosi di adrenalina somministrate.
  5. Prelevare campioni di sangue e registrazioni CRF il più presto possibile dopo ROSC e continuare le registrazioni come descritto al punto 2 per altre 9,5 ore (570 min).

10. Osservazione post-ROSC (TEMPO: 9,5 ore)

  1. Reintrodurre l'infusione di fentanil IV, inizialmente a 25 μg/kg/h, e titolare in base agli effetti/requisiti clinici.
    NOTA: Durante e dopo l'asfissia, il tasso metabolico è ridotto, quindi la dose più bassa di fentanil IV. Tuttavia, alcuni suinetti potrebbero aver bisogno di velocità di infusione più elevate e, quindi, è importante osservare i parametri vitali e i riflessi del maialino.
  2. Monitorare attentamente il maialino per 9,5 ore. Regolare le impostazioni del ventilatore meccanico come richiesto per mantenere l'SpO 2 ≥90% e mantenere la normocapnia (pressione parziale regolata in temperatura di CO 2 (pCO2) di 5-7,5 kPa).
  3. Mantenere la temperatura del suinetto a 38,5-39,0 °C ed eseguire misure correttive della temperatura come indicato.
    NOTA: I suinetti tendono ad avere l'ipotermia durante e dopo l'asfissia.
  4. Prelevare campioni e registrazioni CRF in punti temporali predeterminati come dettato dal CRF (fase 2).
  5. A 9,5 ore di osservazione post-ROSC, eutanasia il maialino (fase 11).
    NOTA: Alcuni suinetti potrebbero non sopravvivere a tutte le 9,5 ore di osservazione post-ROSC. Se il maialino mostra segni di angoscia significativa e un peggioramento delle condizioni, eseguire l'eutanasia prima.

11. Eutanasia (TEMPO: 10 min)

  1. Preparare il tavolo di dissezione con l'attrezzatura chirurgica necessaria, le fiale per conservare i campioni di tessuto e l'azoto liquido per congelare i campioni.
  2. Raccogliere i campioni di fine studio (570 min) come descritto nella fase 2.
  3. Somministrare pentobarbital IV 150 mg/kg. Eseguire la dissezione, posizionare i campioni di organi in tubi criogenici contrassegnati e congelare a scatto in azoto liquido. Conservare una metà del cervello in formalina se lo si desidera.
  4. Collocare i campioni dell'esperimento (sangue intero, plasma, urina, liquido cerebrospinale e campioni di organi) in un congelatore a -80 °C o conservarli in un altro modo come dettato dalle analisi pianificate.

figure-protocol-1
Figura 1: Tavolo sterile con strumenti chirurgici. Gli strumenti chirurgici vengono preparati e conservati su un tavolo sterile prima dell'inizio dell'intervento chirurgico al collo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Vena giugulare interna. La vena giugulare interna dopo che è stata sezionata libera ed esposta. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Inserimento del catetere venoso centrale. I fili di sutura sono tenuti appena prima dell'inserimento del catetere venoso centrale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Suture per fissare il catetere venoso centrale. Le suture sono legate attorno alla vena (e al catetere) per fissare il catetere all'interno della vena. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Risultati

Dopo che i suinetti sono stati strumentati e stabilizzati, le misurazioni ECG e BP vengono continuamente raccolte utilizzando un software di acquisizione e analisi dei dati. I cambiamenti emodinamici durante l'asfissia possono essere facilmente visti nel software (Figura 5). La BP scende gradualmente durante l'asfissia fino all'arresto cardiaco quando la BP = 0. Dopo aver raggiunto il ROSC, la pressione sanguigna aumenta e dopo un po 'di tempo si normalizza di nuovo. I dati di BP ed ECG possono essere utilizzati per diversi tipi di analisi, ad esempio, il calcolo della pressione di perfusione coronarica durante la RCP e le variazioni del ritmo e della morfologia della BP e dell'ECG prima, durante e / o dopo l'asfissia.

Il volume e l'indice cardiaco dell'ictus cardiaco sono continuamente monitorati con cardiografia ad impedenza (una misurazione non invasiva della gittata cardiaca)21. Per studiare il danno cardiaco, vengono misurati i marcatori miocardici dello stress ossidativo e del metabolismo anaerobico19. Inoltre, gli enzimi cardiaci tra cui la troponina T cardiaca possono essere misurati nel plasma (risultati non ancora pubblicati).

L'asfissia cambia la fisiologia del maialino. La Figura 6 mostra un esempio di come HR (Figura 6A), MAP (Figura 6B), pH (Figura 6C), pCO2 (Figura 6D), eccesso di base (Figura 6E) e lattato (Figura 6F) cambiano durante l'esperimento. Come previsto, l'eccesso di MAP, pH e base diminuisce durante l'asfissia, mentre il pCO2 e il lattato aumentano (acidosi mista respiratoria e metabolica). Verso la fine dell'esperimento, i valori si normalizzano.

Storicamente, gli esperimenti sono stati eseguiti con suinetti tracheostomizzati 11,13,15,16,19 (cioè con una via aerea priva di perdite). Per limitare lo stress chirurgico, i suinetti sono stati intubati endotrachealmente con ETT non ammanettati negli esperimenti del 2019. In questi esperimentisono stati osservati 21 tassi di ROSC notevolmente inferiori. Pertanto, in recenti esperimenti, abbiamo confrontato i tassi ROSC utilizzando ETT non ammanettati rispetto a quelli ammanettati. Quando si utilizzano ETT non ammanettati, 7/19 suinetti hanno raggiunto ROSC, e quando si utilizzano ETT ammanettati, 5/5 suinetti hanno raggiunto ROSC (p = 0,012) (risultati non pubblicati). Questa scoperta supporta l'importanza di una via aerea priva di perdite in questo modello.

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Figura 5: Campionamento continuo dei dati utilizzando il software di acquisizione e analisi dei dati. Un esempio di come appare il campionamento continuo dei dati nel software di acquisizione e analisi dei dati. (A) BP per l'intero esperimento. (B) Complessi beat-to-beat di BP ed ECG. Diverse parti dell'esperimento sono contrassegnate nel pannello (A): 1) inizio dell'asfissia, 2) arresto cardiaco e RCP, 3) ROSC. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 6: Cambiamenti nelle variabili cardiovascolari e metaboliche durante l'esperimento. Una dimostrazione di come diverse variabili cambiano durante l'esperimento. I sei punti temporali mostrati sono i seguenti: poco prima dell'inizio dell'ipossia (basale), 10 minuti di ipossia, arresto cardiaco, ROSC, 120 minuti dopo ROSC e fine dello studio (570 minuti dopo ROSC). (A) Frequenza cardiaca (HR), (B) pressione arteriosa media (MAP), (C) pH, (D) pressione parziale di CO 2 (pCO2), (E) eccesso di base e (F) lattato. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Discussione

Questo modello di maialino richiede tempo e tecnicamente impegnativo, con diversi passaggi critici. Un buon equilibrio nei farmaci, negli interventi chirurgici e nel metodo per indurre l'arresto cardiaco è necessario per garantire un ragionevole tasso di sopravvivenza. Poiché il protocollo ha una durata relativamente lunga e comprende diversi passaggi critici, condurre gli esperimenti richiede una preparazione approfondita e un team dedicato e ben funzionante, e gli esperimenti dovrebbero essere condotti in strutture che hanno esperienza con la ricerca su animali di grandi dimensioni. I nostri team di ricerca hanno eseguito esperimenti su uno o tre suinetti in parallelo. Si raccomanda di avere almeno due persone presenti in ogni momento durante gli esperimenti e almeno tre persone se gli esperimenti devono essere condotti con tre suinetti contemporaneamente.

Le parti particolarmente critiche e tecnicamente impegnative degli esperimenti includono quanto segue: 1) assicurarsi che tutte le apparecchiature funzionino e che tutti gli strumenti di campionamento dei dati siano disponibili, funzionanti e calibrati; 2) buona e soddisfacente ventilazione meccanica, in particolare prima dell'asfissia e durante la RCP; 3) intervento chirurgico; 4) l'induzione dell'asfissia; 5) accertamento dell'arresto cardiaco; 6) RCP; e 7) il campionamento dei campioni, specialmente nei punti critici come l'arresto cardiaco e il ROSC. I passaggi più critici del protocollo sono l'induzione dell'asfissia e l'accertamento dell'arresto cardiaco. Nei primi esperimenti, la CO2 è stata aggiunta al gas asfissia per imitare da vicino l'acidosi respiratoria e metabolica mista dell'asfissia perinatale 10,11,13,14,15,16,20. Tuttavia, negli esperimenti successivi 7,21,22 in cui il gas CO2 non era disponibile, è stata osservata anche la riduzione della velocità di ventilazione meccanica seguita dal bloccaggio dell'ETT dopo 20-30 minuti per provocare acidosi respiratoria e metabolica mista. Alti livelli di CO2 all'arresto cardiaco non sono solo importanti per imitare la situazione clinica, ma possono anche influenzare ROSC. La ragione di ciò potrebbe essere che l'arresto cardiaco sembra verificarsi a un pH specifico e il pH dipende sia dal lattato che dalla CO2. Poiché l'ipercapnia è più facilmente invertita rispetto all'acidosi lattica, l'acidosi prevalentemente respiratoria rispetto all'acidosi metabolica può determinare quanto velocemente i suinetti si riprendono dall'asfissia. Altri modelli di suinetto di asfissia perinatale o HIE spesso iniziano la riossigenazione/rianimazione prima dell'arresto cardiaco, tipicamente in base ai valori di MAP o alla durata dell'asfissia (ad esempio, 45 minuti di asfissia 29, 2h di asfissia 30, MAP di 20 mmHg 31, MAP di 30-35 mmHg 30, MAP70% al di sotto del basale29,32). Il vantaggio di questo modello è che inducendo l'arresto cardiaco, è possibile studiare la RCP neonatale e campionare i dati prima, durante e subito dopo l'arresto cardiaco. In particolare, la scoperta incidentale che una frazione sostanziale di suinetti ha PEA 7,33 durante l'arresto cardiaco può aumentare l'applicabilità del modello oltre il campo di perinatologia 34.

Nel corso degli anni, il modello è stato perfezionato per ridurre al minimo l'esposizione dei suinetti ai sedativi e all'intervento chirurgico e migliorare il campionamento e le registrazioni dei dati. I protocolli precedenti 10,11,13,14,15,16,20 includevano l'induzione dell'anestesia con sevoflurano. Questo è stato ora abbandonato, poiché l'attuale protocollo prevede di stabilire direttamente l'accesso IV attraverso una vena dell'orecchio e farmaci IV. Ciò è possibile in quanto l'angoscia dei suinetti viene evitata semplicemente fasciando il maialino in un asciugamano prima dell'inserimento del catetere endovenoso periferico da parte di un fornitore addestrato. Midazolam è stato utilizzato anche nei primi protocolli sperimentali; tuttavia, la valutazione soggettiva del ricercatore (R.S.) che ha eseguito la stragrande maggioranza delle autopsie era che il cervello era in condizioni peggiori durante l'autopsia se il midazolam fosse stato usato come infusione continua. Pertanto, ora usiamo solo fentanil IV per mantenere l'anestesia. Midazolam può essere usato in dosi in bolo se il suinetto mostra segni di sofferenza e fentanil e/o pentobarbital non mostrano alcun effetto; Tuttavia, non abbiamo quasi mai dovuto somministrarlo.

In termini di altri perfezionamenti, in esperimenti precedenti, i suinetti sono stati tracheostomizzati con un tubo endotracheale strettamente fissato posto attraverso un'incisione sottoglottica. Questa procedura fornisce una via aerea senza perdite, ma provoca stress chirurgico per il suinetto. D'altra parte, a causa delle vie aeree superiori più grandi del suinetto, l'intubazione endotracheale è associata a perdite significative quando si utilizzano ETT non ammanettati. Pertanto, abbiamo iniziato a utilizzare ETT ammanettati, che hanno portato a zero perdite e tassi di ROSC significativamente più elevati, paragonabili agli esperimenti con suinetti tracheostomizzati. Inoltre, sono stati apportati alcuni adeguamenti per quanto riguarda il campionamento dei dati. Alcuni dei precedenti esperimenti 7,19,22,33,35,36 prevedevano l'uso di una sonda a flusso posta attorno all'arteria carotide comune sinistra. Questa sonda di flusso non è stata prontamente disponibile presso il nostro istituto di Oslo negli ultimi anni. Il nostro laboratorio di Edmonton utilizza ancora una sonda a flusso carotideo e il suo utilizzo potrebbe fornire preziosi dati emodinamici aggiuntivi al modello. Alcuni esperimenti precedenti prevedevano anche l'uso di un catetere pressione-volume posizionato nel ventricolo sinistro facendolo avanzare attraverso una delle carotidi. La somministrazione di compressioni toraciche ha confuso le registrazioni del catetere pressione-volume e, in alcuni casi, ha persino causato il fallimento e la rottura del catetere. Pertanto, il suo uso è stato abbandonato nel modello di arresto. Recentemente, i monitor CO non invasivi sono stati aggiunti al protocollo e ci stiamo concentrando sull'ottimizzazione dei segnali ECG durante l'arresto cardiaco e la RCP, in quanto potrebbero fornire informazioni preziose sulla morfologia dell'ECG e sulla PEA. Infine, il tempo di osservazione post-ROSC è stato esteso da 4 h a 9,5 h, perché 4 h sono troppo brevi per poter rilevare cambiamenti istopatologici, morte cellulare e cambiamenti in alcuni biomarcatori.

Uno dei limiti più importanti di questo modello, e dell'uso dei suinetti in generale come modello traslazionale, è che, a differenza della RCP in sala parto, la transizione cardio-polmonare postnatale è già avvenuta nei suinetti. È improbabile che i suinetti abbiano shunt cardiovascolari fetali aperti e alte pressioni polmonari, come sarebbe il caso in un neonato asfissiato. Sebbene uno studio di Fugelseth et al.37, che ha utilizzato una versione precedente di questo modello di asfissia dei suinetti (non arresto cardiaco), abbia dimostrato che è probabile che gli shunt vascolari si riaprano nei suinetti durante l'asfissia, le loro risposte alla ventilazione e al supporto emodinamico possono differire. Pertanto, le misurazioni fisiologiche potrebbero non essere sempre rappresentative di un neonato umano in transizione. Sono presenti anche alcune differenze anatomiche tra suinetti e neonati, come le vie aeree superiori più grandi nei suinetti, che causano perdite di ETT (il che significa che è importante usare ETT ammanettati) e una temperatura basale più elevata.

Nonostante queste limitazioni, c'è una lunga tradizione nella comunità di ricerca globale di utilizzare i suinetti come modello traslazionale per l'asfissia perinatale. Il maiale è simile agli esseri umani in termini di anatomia, fisiologia, istologia, biochimica e infiammazione38, e a parte il peso alla nascita inferiore a termine (1,5-2,5 kg), il maialino appena nato ha dimensioni abbastanza simili al neonato umano. Le dimensioni e l'anatomia consentono la strumentazione, il monitoraggio, l'imaging e la raccolta di campioni biologici paragonabili al neonato umano. Questo modello consente anche studi di rianimazione poiché le compressioni toraciche sono relativamente facili da eseguire allo stesso modo dei neonati umani e i maiali hanno anatomia e fisiologia cardiaca simili a quelle degli esseri umani39, compresa la distribuzione del sangue coronarico, l'afflusso di sangue al sistema di conduzione, l'aspetto istologico del miocardio e le risposte biochimiche e metaboliche al danno ischemico40. Un altro fattore importante è che il neonato suinetto ha uno sviluppo cerebrale perinatale paragonabile al neonato umano41, e l'asfissia provoca una risposta biochimica con ipercapnia e acidosi respiratoria e metabolica mista, che assomiglia a quella del neonato asfissiato.

Per concludere, questo modello di asfissia perinatale è tecnicamente impegnativo e richiede tempo. Tuttavia, fornisce preziose informazioni sui cambiamenti fisiologici ed emodinamici durante l'asfissia perinatale, consente studi di rianimazione neonatale e fornisce preziose informazioni sui cambiamenti fisiologici prima, durante e dopo l'arresto cardiaco, che potrebbero anche essere di interesse per altre aree di ricerca in medicina oltre alla perinatologia.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse rilevanti per questo articolo da divulgare.

Ringraziamenti

Vorremmo ringraziare tutti i ricercatori e i ricercatori che hanno contribuito a stabilire, sviluppare e perfezionare questo modello di asfissia perinatale e arresto cardiaco nelle nostre strutture. Vorremmo ringraziare il personale delle strutture di ricerca sugli animali presso l'Institute for Surgical Research e l'Institute for Comparative Medicine, Università di Oslo, Norvegia, e i tecnici di ricerca dell'Università di Alberta, Edmonton, Canada, per la loro collaborazione nel corso degli anni. Ringraziamo il Medical Student Research Program dell'Università di Oslo, il Research Council of Norway e la Norwegian SIDS and Stillbirth Society per il sostegno economico a questa pubblicazione.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Macchina acido-base (ABL 800 Flex)Radiometro Medical ApS, Brø nshø j, Danimarca989-963
Software AcqKnowledge 4.0 per PCBiopac Systems Inc., Goleta, CA, USAACK100W
Telo adesivo con aperturaOneMed Group Oy, Helsinki, Finlandia1505-01
Adrenalina (1 mg/mL)Takeda AS, Asker, NorvegiaVnr 00 58 50Diluire 1:10 in soluzione fisiologica a 0,1 mg/mL
Cannula arteriosa 20 G 1,10 mm x 45 mmBecton Dickinson Infusion Therapy, Helsingborg, Svezia682245
Pinze arterioseQualsiasi
gas asfissia, 8% di ossigeno in azotoLinde Gas AS (AGA AS), Oslo, Norvegia110093
Benelyte, 500 mLFresenius Kabi, Norge AS, Halden, Norvegia79011
Biopac ECG e moduli per la pressione arteriosa invasiva, Modello MP 150Biopac Systems Inc., Goleta, CA 93117, USAECG100C, MP150WSW
Scatola di cartone per la conservazione dei campioniSyhehuspartner HF, Oslo, Norvegia2000076
Cannula, 23G x 1 1/4"- Nr.14Beckton Dickinson S.A., Fraga, Spagna300700
Cannula, 18G x 2"Beckton Dickinson S.A., Fraga, Spagna301900
Cannula, 21G x 1 1/2"- Nr.2Beckton Dickinson S.A., Fraga, Spagna304432
Centrifuga (Megafuge 1.0R) Heraeus instruments, Kendro Laboratory Products GmbH, Hanau, Germania75003060
Colorato con clorexidina 5 mg/mLFresenius Kabi Norge AS, Halden, Norvegia00 73 24
Combi-StopperB. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germania4495101
CRF formaDivaricatore
13 cm x 18 mmQualsiasi
termometro digitale ad 15 °Amarell, Kreuzwertheim, Germania9243101
elettrodi ECG, SkintactLeonhard Lang, Innsbruck, AustriaFS-TC1 /10
Materasso riscaldante elettricoQualsiasi
set di estensioneCodan Medizinische Gerä te GmbH & Co KG, Lensahn, Germania71.4021
Fentanil (50 &; micro; g/mL)Hameln, Saksa, Germania00 70 16
Trucioli di legno fineQualsiasi
Finnpipette F1, 100-1000 µ LVWR, PA, USA613-5550
operatoria completamente attrezzata
Tubo del gasQualsiasi
cm x 5 cmBastos Viegas,.a., Penafiel, Portogallo
Eparina, eparinnatio 5000 IE/a.e./mLLEO Pharma AS, Ballerup, Danimarca46 43 27
Tamponi in tessuto non tessuto HighClean, 10 cm x 10 cmSelefa, OneMed Group Ay, Helsinki, Finlandia223003
ICON Osypka Medical GmbH, Berlino, GermaniaCardiometro portatile non invasivo
ICON elettrodi/elettrodi ECG, Ambu WhiteSensor WSP25Ambu A/S, Ballerup, DanimarcaWsP25-00-S/50
Pompa medica Infusomat SpaceB. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germania8713050
Sistema invasivo di monitoraggio della pressione sanguignaCodan pvb Critical Care GmbH, Forstinning, Germania74.6604
Laringoscopio SunMed Greenlinen lama No 2 KaWe Medical, Asperg, Germania
Ventilatore meccanico Leoni plusLö wenstein Medical SE & Co. KG, Bad Ems, Germania
Azoto liquido 230 LLinde Gas AS (AGA AS), Oslo, Norvegia102730
Provette per microcentrifuga, 1,5 mlForsyningssenteret, Trondheim, Norvegia72.690.001
Provetta endotracheale per microcuffia, misura 3,5Avanos, GA, USA35162
Porta aghiQualsiasi
Neoflon, catetere venoso periferico, 24 G 0,7 mm x 19 mmBecton Dickinson Infusion Therapy AB, Helsingborg, Svezia391350
Suinetti neonatali di età compresa tra 12 e 36 anniIl più giovane possibile
Elettrodi NIRS,  Kit sensore singolo non adesivo FORE-SIGHT SmallCas Medical systems Inc., Branford Connecticut, USA01-07-2000
Macchina NIRS, FORE-SIGHT Universale, ossimetro cerebrale MC-202, ossimetro regionale da banco  FORE-SIGHTCas Medical systems Inc., Branford Connecticut, USA01-06-2020Può anche utilizzare INVOS, Covidien
Soluzione salina normale, NaCl 9 mg/mL, 500 mL.Fresenius Kabi Norge AS, Halden, NorwayVare nr. 141387non miscelata
, NaCl 9 mg/mL, 500 mL.Fresenius Kabi Norge AS, Halden, Norvegia141388Per il monitoraggio della pressione arteriosa per via endovenosa, aggiungere eparina (0,2 ml di eparina 5000 IE/a.e./mL in 500 ml di NaCl allo 0,9%)
Provette criogeniche Nunc 1,8 mLVWR, PA, USA479-6847
Linea Perfusor originale, I Standard PEB. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germania8723060
Monitoraggio della saturazione di ossigeno, MasimoSET, Rad 5Masimo, Neuchâ tel, Svizzera9196
Monitor della saturazione di ossigeno, OxiMax N-65Covidien LP (formerly Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, USAN65-PDN1
Pentobarbital (100 mg/mL)Norges Apotekerforening, Oslo, NorvegiaPnr 811602
Puntali per pipetteVWR, PA, USA732-2383
Contenitore in plastica con foriQualsiasiDeve consentire la circolazione dell'aria
Etichette per stampanti B-492, hvit, 25 mm x 9 mm, 3000 etichetteVWR, PA, USAPer tubi nunc
Rasoio, monouso monousoQualsiasi
Guanti di gommaQualsiasi
Borse dell'acqua calda in gomma
mlLaerdal Medical, Stavanger, Norvegia86005000
Set di prolunga per porte a T di piccolo diametroB. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germania471954
Guanti chirurgici sterili in lattice, Sempermed supremeSemperit Technische Produkte Ges.m.b.H., Vienna, Austriamisura 7: 822751701Diverse misure
Stetoscopio Tutti
i rubinetti, a 3 vie, DiscofixB. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germania16494C
Stiletto misura 3.5 Qualsiasi
lama per laringoscopio SunMed Greenlinen n. 2 KaWe Medical, Asperg, Germania
Lama chirurgica, misura 15Swann Morton LTD, Sheffield Inghilterra205
Pinze chirurgicheQualsiasi
Forbici chirurgicheQualsiasi
Spugne chirurgiche, steriliMö lnlycke Assistenza sanitaria, Gö teborg, SveziaC0130-3025
Tamponi chirurgiciMö lnlycke Assistenza sanitaria, Gö teborg, Svezia159860-00
Nastro chirurgico Micropore 2,5 cm x 9,1 m 3M Norge AS, Lillestrø m, Norvegia153.5
Sutura, Monsoft Monofilamento Nylon 3-0Covidien LP (precedentemente Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, USASutura SN653
, Polysorb Braided AbsorbableCovidien LP (precedentemente Nellcor Puritan Bennett Inc.), Boulder, CO, USAGL884
Siringa 0.01-1 mL Omnifix F Luer SoloB. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germania9161406VUtilizzato per il prelievo di sangue acido-base. Sciacquare con eparina
Siringa 10 ml Omnifix Luer SoloB. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germania4616103V
Siringa 2,5 mL BD PlastipakBeckton Dickinson S.A., Madrid, Spagna300185Utilizzato per il prelievo di sangue. Lavare con siringa di NaCl eparinizzata
20 ml Omnifix Luer Loc SoloB. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germania4617207V
Siringa 20 mL Omnifix Luer SoloB. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germania4616200V
Siringa 5 ml Omnifix Luer SoloB. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germania4616057V
Siringa 50 ml Omnifix Luer Lock SoloB. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germania4617509F
Siringa 50 ml Omnifix Luer SoloB. Braun Melsungen AG,  Melsungen, Germania4616502F
Telo per tende da tavolo, asap drytopAsap Norway AS, Skien, Norvegia83010705
Tape Tensoplast 2,5 cm x 4,5 m BSN Medical, Essity Medical Solutions, Charlotte, NC, USA66005305, 72067-00
TimerQualsiasi
asciugamanoQualsiasi
Fissaggio IV trasparenteMediplast AB, Malmö, Svezia60902106
Gel per ultrasuoniOptimu Medical Solutions Ltd. Leeds, Regno Unito1157
Ecografo, LOGIQ eGE Healthcare, GE Medical Systems, WI, USA5417728-100
Telo multiuso, sterileOneMed Group Oy, Helsinki, Finlandia1415-01
Vacuette K3E K3EEDTA 2mLGreiner Bio-One GmbH, Kremsmü nster, Austria454222
Venflon Pro Safety 22 G 0,9 mm x 25 mmBecton Dickinson Infusion Therapy, Helsingborg, Svezia393222
Maschera di ventilazione realizzata per adattarsi perfettamente al muso di un maialinoQualsiasiTipicamente a forma di cono
PesoQualsiasi
palpebrale Desmarres autocostruito Sala tampone di garza 5 Soluzione fisiologica BRDY805911 Qualsiasi Sacca pediatrica in silicone autogonfiabile 500

Riferimenti

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