Questo è un protocollo semplice di un test di guaina di foglie d'orzo che utilizza reagenti minimi e attrezzature di laboratorio comuni (incluso uno smartphone di base). Lo scopo è quello di visualizzare il processo di infezione precoce della malattia blastica in laboratori senza accesso ad apparecchiature di microscopia avanzate.
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Articolo metodologico
Visualizzazione dei siti di infezione precoce della malattia dell'esplosione del riso (Magnaporthe oryzae) sull'orzo (Hordeum vulgare) utilizzando un microscopio di base e uno smartphone
In questo articolo
Sommario
Abstract
Capire come le piante e gli agenti patogeni interagiscono e se tale interazione culmina nella difesa o nella malattia, è necessario per sviluppare strategie più forti e più sostenibili per la salute delle piante. I progressi nei metodi che visualizzano in modo più efficace i campioni di patogeni vegetali durante l'infezione e la colonizzazione hanno prodotto strumenti come il saggio della guaina delle foglie di riso, che è stato utile nel monitoraggio dell'infezione e degli eventi di colonizzazione precoce tra il riso e il patogeno fungino, Magnaporthe oryzae. Questo patogeno emi-biotrofico causa gravi perdite di malattia nel riso e nelle monocotiledoni correlate, tra cui miglio, segale, orzo e, più recentemente, grano. Il saggio della guaina fogliare, se eseguito correttamente, produce una sezione vegetale otticamente chiara, spessa diversi strati, che consente ai ricercatori di eseguire l'imaging di cellule vive durante l'attacco di patogeni o generare campioni fissi colorati per caratteristiche specifiche. Indagini cellulari dettagliate sull'interazione orzo-M. oryzae sono rimaste indietro rispetto a quelle dell'ospite del riso, nonostante la crescente importanza di questo grano come fonte di cibo per animali e umani e come bevande fermentate. Qui è riportato lo sviluppo di un saggio di guaina per foglie d'orzo per studi complessi sulle interazioni di M. oryzae durante le prime 48 ore post-inoculazione. Il saggio della guaina fogliare, indipendentemente dalla specie studiata, è delicato; Viene fornito un protocollo che copre tutto, dalle condizioni di crescita dell'orzo e l'ottenimento di una guaina fogliare, all'inoculazione, all'incubazione e all'imaging del patogeno sulle foglie delle piante. Questo protocollo può essere ottimizzato per lo screening ad alta produttività utilizzando qualcosa di semplice come uno smartphone per scopi di imaging.
Introduzione
Magnaporthe oryzae, il fungo esplosione del riso, infetta un assortimento di colture di cereali, tra cui orzo, grano e riso1. Questo agente patogeno causa malattie devastanti e rappresenta una minaccia mondiale per queste preziose colture, causando la perdita completa del raccolto se non controllato. Molti laboratori in tutto il mondo si concentrano sulla malattia dell'esplosione del riso a causa della sua minaccia globale e dei suoi attributi come modello eccellente per le interazioni pianta-fungo2. È stato completamente sequenziato e la genetica del suo ciclo infettivo, in particolare gli eventi precoci, è stata stabilita 3,4. Il ciclo vitale inizia con una spora che germina su una superficie fogliare, formando la struttura di penetrazione specializzata chiamata appressorio. L'appressorio penetra nel tessuto fogliare e l'infezione continua con lo sviluppo di lesioni che iniziano il processo di sporulazione e diffondono la malattia4. Prevenire uno qualsiasi di questi eventi precoci inibirebbe drasticamente questa malattia devastante. Di conseguenza, la maggior parte della ricerca attuale sulla malattia blastica si è concentrata sulle prime fasi dell'infezione, dai conidi germinati che formano un appressorio allo sviluppo delle ife invasive e del complesso interfacciale biotrofico (BIC)5.
La grande quantità di ricerche sulla malattia blastica è stata condotta nel riso, anche se M. oryzae è un patogeno significativo per una varietà di colture, e ceppi di recente evoluzione stanno emergendo come una minaccia globale per il grano6. Mentre il riso è una delle prime tre colture di base utilizzate per nutrire la popolazione, insieme a grano e mais, l'orzo è il quarto cereale in termini di alimentazione per il bestiame e produzione di birra7. Con la crescita dell'industria della birra artigianale, cresce anche il valore economico dell'orzo. Ci sono diversi vantaggi nell'utilizzare M. oryzae e orzo come patosistema per studiare la malattia blastica. In primo luogo, ci sono ceppi di M. oryzae che infettano solo l'orzo, così come ceppi che possono infettare più specie di erba. Ad esempio, 4091-5-8 infetta principalmente solo l'orzo, mentre Guy11 e 70-15 possono infettare sia l'orzo che il riso8. Questi ceppi sono geneticamente simili e il processo di infezione è paragonabile9. In secondo luogo, in condizioni standard di laboratorio e di serra, l'orzo è più facile da coltivare, in quanto non ha i complicati requisiti del riso (controllo conciso della temperatura, alta umidità, spettri di luce specifici). Ci sono anche sfide di imaging con il riso a causa dell'idrofobicità della superficie fogliare, che l'orzo non mostra10.
Questo protocollo presenta un metodo semplice per isolare e utilizzare efficacemente guaine per foglie d'orzo per l'analisi microscopica di più stadi di infezione, utilizzando comuni forniture di laboratorio e uno smartphone per la raccolta dei dati. Questo metodo per il test della guaina delle foglie d'orzo è adattabile per i laboratori di tutto il mondo in quanto richiede forniture minime e tuttavia fornisce un quadro chiaro dell'interazione microscopica tra l'agente patogeno e le prime cellule che infetta. Mentre i saggi di patogenicità, come l'inoculazione di spray o goccioline, possono fornire una visione macro della capacità del patogeno di formare lesioni, questo test consente al ricercatore di visualizzare fasi specifiche dell'infezione precoce, dagli eventi di pre-penetrazione alla colonizzazione delle cellule epidermiche. Inoltre, i ricercatori possono facilmente confrontare l'infezione con il fungo di tipo selvatico con l'infezione con un mutante ridotto in virulenza.
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Protocollo
1. Preparazione di materiali sperimentali
- Preparare l'agar di farina d'avena (OMA) mescolando la farina d'avena fino a quando non è una polvere fine. Aggiungere 25 g di farina d'avena in polvere e 15 g di agar a 500 mL di ddH2O e sterilizzare in autoclave sul ciclo di supporto (in alternativa portare a ebollizione per 20 minuti). Versare il supporto in piastre di Petri sterili da 60 mm.
NOTA: altri tipi di supporti che inducono la sporulazione, come l'agar V8, sono accettabili per questo protocollo. - La piastra M. oryzae filtra direttamente sulle piastre OMA utilizzando una pinza sterile, e consente loro di coprire l'intera piastra (9-12 giorni). Posizionare le piastre in un'incubatrice di crescita a 25 °C con cicli giorno:notte 12:12 h per favorire l'induzione della sporulazione.
NOTA: Alcuni mutanti crescono più lentamente e richiedono cure aggiuntive (ad esempio, prima il mezzo completo, poi un trasferimento all'OMA), e potrebbero richiedere un'ulteriore settimana per produrre abbastanza conidi. - Piantare direttamente semi di orzo (Hordeum vulgare Lacey) in un mezzo di crescita umido (ad esempio, terriccio fuori suolo) con 10-15 semi per vaso da 6 pollici. Mettere le pentole in vassoi con 1-2 pollici di acqua.
- Impostare le condizioni della camera di crescita dell'orzo a 22 °C per 12 ore (luce diurna) e 19 °C per 12 ore (buio) al 60% di umidità relativa. Continua ad annaffiare dal basso per non disturbare i semi.
- Coltiva l'orzo fino alla seconda fase fogliare, approssimativamente per 14 giorni. Usando le forbici sterili, tagliare la pianta d'orzo appena sopra la linea del terreno. Usando una pinza e un rasoio / bisturi, tagliare con cura la guaina fogliare della prima foglia aperta longitudinalmente e, usando la pinza, rimuoverla dalla base della seconda foglia.
NOTA: Pulire gli strumenti (pinze, bisturi, ecc.) prima dell'uso con etanolo al 75% -80%. La guaina è il sottile strato epidermico che fornisce l'attacco dalla prima alla seconda foglia (dalla seconda alla terza foglia, ecc.; vedi Figura 1). - Posizionare la prima foglia piatta in una capsula di Petri sterile da 60 mm, contenente un tovagliolo di carta bagnato per mantenere l'umidità all'interno del piatto. Usando il bisturi, tagliare la maggior parte della prima foglia lontano dalla guaina, lasciando solo 0,5 in del tessuto fogliare per il montaggio.
- Fissare il tessuto fogliare sul fondo della piastra di Petri.
NOTA: La guaina si arriccia, ma questo è accettabile in quanto una guaina arricciata trattiene più facilmente la goccia condiale. - Raccogliere piastre di M. oryzae di 9-12 giorni e aggiungere 0,5-2 ml di acqua sterile alle piastre. Utilizzando un ciclo di inoculazione sterile, raschiare delicatamente i miceli per rilasciare i conidi attaccati. Pipettare con cautela la sospensione condiale in un tubo di microcentrifuga contenente un piccolo pezzo di garza per filtrare eventuali pezzi grandi di micelio dalla sospensione condiale.
NOTA: Le spore possono essere raccolte già da 7 giorni, se la crescita e la sporulazione sono sufficienti per raggiungere la concentrazione di spore desiderata. La raccolta può essere ritardata non più di 14 giorni se si lavora con un mutante genetico a crescita lenta - La concentrazione di spore desiderata è 5 x 10 4 spore per ml, ma un intervallo (1 x 10 4-1 x 10 5) è accettabile. Una concentrazione troppo elevata rende difficile l'imaging dei singoli siti di infezione; Diluire la concentrazione di spore con acqua sterile se necessario.
- Pipettare con cautela la sospensione condiale all'interno della guaina fogliare arrotolata. Inizia con 25 μL (la dimensione delle gocce può essere aumentata a seconda delle dimensioni della guaina, fino a 50 μL).
NOTA: Si consiglia di eseguire da tre a cinque repliche di ciascun ceppo mutante o linea di orzo. È comune che si verifichino danni durante il processo di colorazione, pertanto si raccomandano ulteriori repliche della guaina. - Riempire quattro o cinque bicchieri da 500 ml con ddH2O e riscaldare fino alla cottura a vapore (utilizzando un forno a microonde o una piastra elettrica). Prestare attenzione quando si spostano i becher dell'acqua calda. Tenere il coperchio della capsula di Petri su uno dei bicchieri fumanti per intrappolare l'umidità all'interno della piastra.
- Impilare le piastre della guaina fogliare infette e circondarle con i becher caldi rimanenti. Questo crea un ambiente umido e umido, necessario per la germinazione delle spore.
NOTA: prestare attenzione quando si cuoce a vapore i coperchi per assicurarsi che l'acqua calda o il vapore non tocchino le guaine. - Proteggere le guaine fogliari dalla luce, coprire con una scatola di gomma o plastica colorata (preferibilmente nera) e lasciare riposare per 48 ore o il punto temporale desiderato per l'imaging.
NOTA: Una scatola di cartone non è adatta perché non blocca l'umidità / umidità e assorbe il vapore dai becher dell'acqua calda. Una vasca di plastica bloccante funziona bene per contenere l'umidità e può essere coperta con tessuto nero o un contenitore scuro più grande per bloccare la luce.
2. Processo di colorazione
- Preparare la macchia come segue: preparare una nuova diluizione di acido acetico al 45% e aggiungere lo 0,1% v/v di tripano blu. Aliquote 1 mL della soluzione colorante in provette da microcentrifuga. Impostare un blocco termico o un bagno d'acqua a 40 °C.
- Con attenzione, usando un rasoio o un bisturi, tagliare la guaina fogliare lontano dal nastro. Usando una pinza, posizionare la guaina nel tubo della microcentrifuga e assicurarsi che sia completamente immersa nella soluzione colorante. Lasciare 2 ore affinché il colorante penetri nella foglia. Riscaldare i campioni a 40 °C durante il processo di colorazione in un blocco termico o a bagnomaria per aumentare la penetrazione del colorante.
NOTA: Le guaine cercano di galleggiare nel tubo della microcentrifuga; Per evitare tasche non macchiate di tessuto fogliare, riempire i tubi, immergere le guaine e chiudere il tubo. Non mettere più guaine nella stessa provetta da microcentrifuga. - Risciacquare accuratamente le guaine fogliari in glicerolo al 60% per rimuovere il colorante in eccesso. Tre risciacqui (ciascuno in glicerolo fresco) sono generalmente sufficienti. Tenere la guaina in glicerolo fino al momento del montaggio sui vetrini.
3. Processo di montaggio e imaging
- Posizionare la guaina su un vetrino pulito e aggiungere alcune gocce di glicerolo al 60%. Utilizzando un microscopio da dissezione e due paia di pinze, srotolare con cura la guaina, lasciando il centro inoculato rivolto verso l'alto. Tenere la guaina aperta con la pinza e posizionare il coprislip sulla parte superiore per evitare che la guaina si arricci e blocchi il sito di infezione.
NOTA: La guaina fogliare è molto fragile e questi passaggi devono essere eseguiti con cura per evitare danni alla guaina. - Sigillare il coprislip con lo smalto per unghie per la conservazione a lungo termine o il nastro adesivo per la conservazione a breve termine. Osservare i vetrini al microscopio ottico composto.
- Scatta immagini di base usando un microscopio e un telefono cellulare. Qui, le immagini sono state scattate con un supporto adattatore per telefono cellulare e uno smartphone. Per i dispositivi Android, regolare l'applicazione della fotocamera sulle seguenti impostazioni: flash off, disabilitare Top Shot, disabilitare la regolazione automatica della luminosità e delle ombre e impostare la risoluzione della foto su full.
NOTA: l'utilizzo dell'applicazione fotocamera sul telefono riduce la durata della batteria più velocemente del solito, quindi si consiglia di avere un'alimentazione esterna. - Una volta montato il cellulare sul microscopio, scatta un'immagine di un micrometro in scala con l'obiettivo che verrà utilizzato per acquisire i dati. I dati in questo studio sono stati acquisiti a un obiettivo aereo 40x 0,65 NA e l'adattatore telefonico è stato montato su un oculare 10x. Regola lo zoom del telefono a 2,5x e mantienilo coerente per mantenere una dimensione costante dei pixel.
- Il centro della guaina ospita la maggiore concentrazione di spore e appressorie infettanti; Pertanto, mirare a 9-12 immagini di ogni guaina per ottenere numeri significativi per l'analisi statistica. Il numero di spore e appressoria varia in base alla concentrazione di spore applicate.
4. Valutazione e conteggio delle immagini utilizzando ImageJ (FIJI)
- Trasferire le immagini a un computer che esegue ImageJ (FIJI). Per aprire le immagini, trascinare e rilasciare i file sulla barra di ImageJ.
- Imposta la scala delle immagini caricando l'immagine micrometrica del palcoscenico e disegnando una linea retta tra due segni per la scala. Apri Set Scale (Open Set Scale), digita la Distanza nota per la linea misurata e digita l'unità per la scala. Sul micrometro, in questo esempio, la linea più piccola era di 10 μm. Seleziona la casella Imposta globale e premi OK. Tutte le immagini caricate successivamente avranno la stessa scala.
- Per contare appressori, spore o altri oggetti, selezionate lo strumento Punto . Quindi, apri il ROI Manager. Fare clic sul tasto T sulla tastiera per aggiungere punti all'elenco. Queste regioni di interesse possono essere salvate, se necessario, e ricaricate sulla stessa immagine.
- A seconda degli obiettivi sperimentali, effettuare misurazioni aggiuntive, come la lunghezza delle spore, la dimensione dell'appressoria e la lunghezza del tubo germinale.
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Risultati
Una rappresentazione del flusso di lavoro iniziale per questa tecnica è illustrata nella Figura 1. Le guaine sono state raccolte da piante d'orzo "Lacey" sensibili di 14 giorni (H. vulgare). I conidi sono stati raccolti da piastre sporulanti di M. oryzae OMA di 10 giorni, con una sospensione condiale preparata utilizzandoddH 2O sterile per una concentrazione finale di 5 x 104 spore per ml. La sospensione dell'inoculo è stata applicata direttamente alle...
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Discussione
Ci sono molti saggi comunemente usati disponibili per testare i ceppi di M. oryzae che forniscono una visione a livello macroscopico di una risposta infettiva compatibile o incompatibile, come le inoculazioni di spray o goccioline, e l'uso di sistemi di valutazione per quantificare le dimensioni delle lesioni13,14. Un altro test comune per M. oryzae è quello di testare la capacità del patogeno di formare la sua struttura di penetrazione speciali...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori riconoscono il finanziamento del premio USDA-NIFA 2016-67013-24816.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Acido acetico | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| Telefono cellulare | Pixel 4A | Qualsiasi smartphone con una fotocamera posteriore che può essere montata in un supporto sarà sufficiente. | |
| Adattatore per microscopio per telefono cellulare | Vankey | B01788LT3S | https://www.amazon.com/Vankey-Cellphone-Telescope-Binocular-Microscope/dp/B01788LT3S/ref=sr_1_2_sspa?keywords=vankey+cellphone+telescope+adapter+mount&qid=1662568182&sprefix= vankey+%2Caps%2C63& sr=8-2 -spons& psc=1& spLa=ZW5jcnlwd GVkUXVhbGlmaWVyPUFKNklBR jlCREJaMEcmZW5jcnlwdGVkSWQ 9QTA2MDMxNjhBRFYxQTMzNk9E M0YmZW5jcnlwdGVkQWRJZD1BM DQxMzAzOTMxNzI1TzE3M1ZGTEI md2lkZ2V0TmFtZT1zcF9hdGYmY WN0aW9uPWNsaWNrUmVkaXJlY3 QmZG9Ob3RMb2dDbGljaz10cnVl |
| Glicerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Microscopio | AmScope | FM690TC | 40x– 2500x Microscopio trinoculare verticale a epifluorescenza |
| Fiocchi d'avena vecchio stile Fiocchi d'avena | Quaker | N/A | https://www.amazon.com/Quaker-Oats-Old-Fashioned-Pack/dp/B00IIVBNK4/ref=asc_df_B00IIVBNK4/?tag=hyprod-20&linkCode=df0 & hvadid=312253390021& hvpos= & hvnetw=g& hvrand=98212627704 6839544& hvpone=& HVPTWO=& hvq mt=& hvdev=c& hvdvcmdl=& hvlocint =& hvlocphy=9007494& HVTARGID =PLA-568492637928& psc=1 |
| ProMix BX | ProMix | 1038500RG | |
| CLS2975245 | Corning | rettangolari in vetro | |
| , microscopio | Sigma-Aldrich | S8902 | |
| Micrometro da tavolino | OMAX | A36CALM7 | 0,1 mm e 0,01 mm Vetrino di calibrazione per microscopio |
| Trypan blue | Sigma-Aldrich | T6146 |
Riferimenti
- Roy, K. K., et al. First report of barley blast caused by Magnaporthe oryzae pathotype Triticum (MoT) in Bangladesh. Journal of General Plant Pathology. 87 (3), 184-191 (2021).
- Dean, R., et al. The Top 10 fungal pathogens in molecular plant pathology. Molecular Plant Pathology. 13 (4), 414-430 (2012).
- Dean, R. A., et al. The genome sequence of the rice blast fungus Magnaporthe grisea. Nature. 434 (7036), 980-986 (2005).
- Wilson, R. A., Talbot, N. J. Under pressure: investigating the biology of plant infection by Magnaporthe oryzae. Nature Reviews. Microbiology. 7 (3), 185-195 (2009).
- Giraldo, M. C., et al. Two distinct secretion systems facilitate tissue invasion by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Nature Communications. 4, 1996(2013).
- Islam, M. T. Emergence of wheat blast in Bangladesh was caused by a SouthAmerican lineage of Magnaporthe oryzae. BMC Biology. 14 (1), 84(2016).
- Langridge, P. Economic and Academic Importance of Barley. The Barley Genome. Compendium of Plant Genomes. , Springer. Cham. 1-10 (2018).
- Heath, M. C., Valent, B., Howard, R. J., Chumley, F. G. Interactions of two strains of Magnaporthe grisea with rice, goosegrass, and weeping lovegrass. Canadian Journal of Botany. 68 (8), 1627-1637 (1990).
- Gowda, M., et al. Genome analysis of rice-blast fungus Magnaporthe oryzae field isolates from southern India. Genomics Data. 5, 284-291 (2015).
- Luginbuehl, L. H., El-Sharnouby, S., Wang, N., Hibberd, J. M. Fluorescent reporters for functional analysis in rice leaves. Plant Direct. 4 (2), 00188(2020).
- Fernandez, J., Wilson, R. A. Why no feeding frenzy? Mechanisms of nutrient acquisition and utilization during infection by the rice blast fungus Magnaporthe oryzae. Molecular Plant-Microbe Interactions. 25 (10), 1286-1293 (2012).
- Cooper, J. G. Identifying Genetic Control of Reactive Oxygen Species in Magnaporthe oryzae (the Rice Blast Fungus) through Development, Screening, and Characterization of a Random Insert Mutant Library. University of Delaware. , Doctoral dissertation (2022).
- Zhang, M., et al. al.The plant infection test: Spray and wound-mediated inoculation with the plant pathogen Magnaporthe grisea. Journal of Visualized Experiments. (138), e57675(2018).
- Koga, H., Dohi, K., Nakayachi, O., Mori, M. A novel inoculation method of Magnaporthe grisea for cytological observation of the infection process using intact leaf sheaths of rice plants. Physiological and Molecular Plant Pathology. 64 (2), 67-72 (2004).
- Hamer, J. E., Howard, R. J., Chumley, F. G., Valent, B. A mechanism for surface attachment in spores of a plant pathogenic fungus. Science. 239 (4837), 288-290 (1988).
- Khang, C. H., et al. et al. of Magnaporthe oryzae effectors into rice cells and their subsequent cell-to-cell movement. The Plant Cell. 22 (4), 1388-1403 (2010).
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Ristampe e permessi
