Method Article

Registrazione della corrente di potassio voltaggio-dipendente su cardiomiociti H9C2 tramite la tecnica del patch-clamp a cellule intere

DOI:

10.3791/64805

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November 11th, 2022

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1State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2Chengdu Techman Instrument Co., Ltd., 3Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 4Research Institute of Integrated TCM & Western Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 5School of Ethnic Medicine, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine

In This Article

Summary

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Il presente protocollo descrive un metodo efficiente per l'acquisizione dinamica e in tempo reale delle correnti del canale del potassio voltaggio-dipendente (Kv) nei cardiomiociti H9c2 utilizzando la tecnica patch-clamp dell'intera cellula.

Abstract

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I canali del potassio sulla membrana cellulare miocardica svolgono un ruolo importante nella regolazione delle attività elettrofisiologiche cellulari. Essendo uno dei principali canali ionici, i canali del potassio voltaggio-dipendenti (Kv) sono strettamente associati ad alcune gravi malattie cardiache, come il danno miocardico indotto da farmaci e l'infarto del miocardio. Nel presente studio, la tecnica patch-clamp dell'intera cellula è stata impiegata per determinare gli effetti di 1,5 mM 4-aminopiridina (4-AP, un inibitore del canale del potassio ad ampio spettro) e aconitina (AC, 25 μM, 50 μM, 100 μM e 200 μM) sulla corrente del canale Kv (IKv) nei cardiomiociti H9c2. È stato riscontrato che il 4-AP ha inibito I Kv di circa il 54%, mentre l'effetto inibitorio dell'AC sull'IKv ha mostrato una tendenza dose-dipendente (nessun effetto per 25 μM, tasso inibitorio del 30% per 50 μM, tasso inibitorio del 46% per 100 μM e tasso inibitorio del 54% per 200 μM). A causa delle caratteristiche di maggiore sensibilità e precisione, questa tecnica promuoverà l'esplorazione della cardiotossicità e degli effetti farmacologici dell'etnomedicina che prendono di mira i canali ionici.

Introduction

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I canali ionici sono speciali proteine integrate incorporate nel doppio strato lipidico della membrana cellulare. In presenza di attivatori, i centri di tali speciali proteine integrate formano pori idrofili altamente selettivi, consentendo agli ioni di dimensioni e cariche appropriate di passare attraverso in modo di trasporto passivo1. I canali ionici sono alla base dell'eccitabilità cellulare e della bioelettricità e svolgono un ruolo chiave in una varietà di attività cellulari2. Il cuore fornisce sangue ad altri organi attraverso contrazioni regolari derivanti da un processo accoppiato eccitazione-contrazione avviato....

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Protocol

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I cardiomiociti di ratto H9c2 ottenuti commercialmente (vedere la tabella dei materiali) sono stati incubati in DMEM contenente il 10% di siero bovino fetale inattivato dal calore (FBS) e l'1% di penicillina-streptomicina a 37 °C in atmosfera umidificata al 5% di CO2. La tecnica patch-clamp dell'intera cellula è stata quindi impiegata per rilevare i cambiamenti in IKv nelle cellule H9c2 normali e nelle cellule trattate con 4-AP o AC (Figura 1 e Figura 2).

1. Preparazione della soluzione

  1. Preparare il terreno di coltur....

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Results

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Questo protocollo ha permesso la registrazione dell'IKv secondo i parametri impostati nella tecnica patch-clamp a tutta cella. L'IKv è stato attivato da 150 ms di stimolo impulsivo depolarizzante da -40 a +60 mV con un potenziale di mantenimento di -60 mV (Figura 3A). IKv dei cardiomiociti di ratto H9c2 sono apparsi per la prima volta intorno a -20 mV, e poi l'ampiezza è aumentata con un'ulteriore depolarizzazione. La relazione media tra IKv e pote.......

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Discussion

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La tecnica elettrofisiologica patch-clamp viene utilizzata principalmente per registrare e riflettere l'attività elettrica e le caratteristiche funzionali dei canali ionici sulla membrana cellulare25. Allo stato attuale, i principali metodi di registrazione della tecnica patch-clamp includono la registrazione a canale singolo e la registrazione a cella intera26. Per la modalità a cella intera, il microelettrodo di vetro e la pressione negativa vengono utilizzati per formare.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Acknowledgements

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Apprezziamo il sostegno finanziario della National Natural Science Foundation of China (82130113) e del Key R&D and Transformation Program del Dipartimento di Scienza e Tecnologia della Provincia del Qinghai (2020-SF-C33).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
4-AminopiridinaSigmaMKCJ2184
AconitinaChengdu Lemetian Medical Technology Co., LtdAmplificatore DSTDW000602
Axon InstrumentMultiClamp 700B
Bilancia analiticaSartorius124S-CW
ATP Na2Solarbio416O022
Vetro borosilicato con filamento (diametro esterno: 1,5 mm, diametro interno: 1,10 mm, lunghezza 10 cm) Sutter Instrument163225-5
Piastra per colture cellulari (100 mm)Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd1192022
Piastra per colture cellulari (35 mm)Zhejiang Sorfa Life Science Research Co., Ltd3012022
Clampex softwareMolecular Devices, LLC.Versione 10. 5
Software ClampfitMolecular Devices, LLC.Versione 10. 6. 0. 13software di acquisizione dati
D-(+)-glucosioRhawnRH289133
Fotocamera digitaleHamamatsuC11440
DigitalizzatoreAxon InstrumentAxon digidata 1550B
DMSOBoster Biological Technology Co., LtdPYG0040
Dulbecco's modified eagle medium (1x)Gibco8121587
EGTABiofroxxEZ6789D115
Siero fetale bovinoGibco2166090RP
Estrattore per micropipette fiammeggiante/marroneStrumento Sutter ModelloP-1000
Cellule H9c2Hunan Fenghui Biotechnology Co., LtdCL0111
HCImageLiveHamamatsu4.5.0.0
HClSichuan Xilong Scientific Co., Ltd2106081
HEPESXiya Chemical Technology (Shandong) Co., Ltd20210221
KClChengdu Colon Chemical Co., Ltd2020082501
KOHChengdu Colon Chemical Co., Ltd2020112601
MgCl2Tianjin Guangfu Fine Chemical Research Institute20160408
MgCl2· 6H2OChengdu Colon Chemical Co., Ltd2021020101
MicromanipolatoreSutter InstrumentMP-285A
MicroscopioOlympusIX73
Vetro di copertura del microscopio (20 &volte; 20 mm)Jiangsu Citotest Experimental Equipment Co. Ltd80340-0630
Milli-QChengdu Bioscience Technology Co., LtdMilli-Q IQ 7005
MultiClamp 700B commanderAxon InstrumentMultiClamp commander 2.0 
OriginPro 8 softwareOriginLab Corporationv8.0724 (B724)
Penicillina-streptomicina (100x)Boster Biological Technology Co., Ltd17C18B16
PH  metro Mettler ToledoS201K
Soluzione salina tamponata con fosfato (1x)Gibco8120485
Tripsina 0,25% (1x)HyCloneJ210045
Software per amplificatori di segnale

References

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  1. Luan, Q. H. Passive transport and ion channels in biofilms. Acta Scientiarum Naturalium Universitatis Intramongoljcae. 2, 215-235 (1984).
  2. Lei, M., Sun, S. Advances in the mechanism of arrhythmia induced by sodium channel disease. <....

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