Articolo metodologico

Analisi dell'espressione genica nei follicoli umani

DOI:

10.3791/64807

⸱

17 febbraio 2023

 ,  , 
1Research Laboratory on Human Reproduction, Université libre de Bruxelles (ULB), 2Fertility Clinic, Erasme Hospital, Université libre de Bruxelles (ULB)

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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Qui, descriviamo un protocollo che delinea come isolare i follicoli ovarici umani dal tessuto corticale congelato-scongelato per eseguire analisi di espressione genica.

Abstract

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L'ovaio è un organo eterogeneo composto da diversi tipi di cellule. Per studiare i meccanismi molecolari che si verificano durante la follicologenesi, la localizzazione delle proteine e l'espressione genica possono essere eseguite su tessuto fisso. Tuttavia, per valutare correttamente i livelli di espressione genica in un follicolo umano, questa struttura complessa e delicata deve essere isolata. Quindi, un protocollo adattato precedentemente descritto dal laboratorio di Woodruff è stato sviluppato per separare i follicoli (l'ovocita e le cellule della granulosa) dal loro ambiente circostante. Il tessuto corticale ovarico viene prima lavorato manualmente per ottenere piccoli frammenti utilizzando due strumenti: un'affettatrice di tessuto e un tritatutto. Il tessuto viene quindi digerito enzimaticamente con lo 0,2% di collagenasi e lo 0,02% di DNasi per almeno 40 minuti. Questa fase di digestione viene eseguita a 37 °C e al 5% di CO2 ed è accompagnata da pipettaggio meccanico del mezzo ogni 10 minuti. Dopo l'incubazione, i follicoli isolati vengono raccolti manualmente utilizzando una pipetta microcapillare calibrata al microscopio. Se i follicoli sono ancora presenti nei pezzi di tessuto, la procedura viene completata con la microdissezione manuale. I follicoli vengono raccolti su ghiaccio in un terreno di coltura e vengono risciacquati due volte in goccioline di soluzione salina tamponata con fosfato. Questa procedura di digestione deve essere attentamente controllata per evitare il deterioramento del follicolo. Non appena la struttura dei follicoli appare compromessa o dopo un massimo di 90 minuti, la reazione viene interrotta con una soluzione bloccante a 4 °C contenente siero bovino fetale al 10%. Un minimo di 20 follicoli isolati (di dimensioni inferiori a 75 μm) devono essere raccolti per ottenere una quantità adeguata di RNA totale dopo l'estrazione dell'RNA per la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR). Dopo l'estrazione, la quantificazione dell'RNA totale da 20 follicoli raggiunge un valore medio di 5 ng/μL. L'RNA totale viene quindi retrotrascritto in cDNA e i geni di interesse vengono ulteriormente analizzati utilizzando RT-qPCR.

Introduzione

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L'ovaio è un organo complesso composto da unità funzionali e strutturali, compresi i follicoli all'interno della corteccia e lo stroma. La follicologenesi, il processo di attivazione, crescita e maturazione del follicolo da uno stato quiescente primordiale a un follicolo maturo in grado di essere fecondato e di supportare lo sviluppo embrionale precoce, è ampiamente studiato nella ricerca1. Svelare i meccanismi che guidano questo fenomeno potrebbe migliorare la cura della fertilità per le donne2. Le analisi su tessuto umano fisso permettono di valutare l'espressione proteica e la localizzazione genica all'interno delle unità funzionali dell'ovaio 3,4. Tuttavia, sono necessarie tecniche specifiche per dissociare i follicoli dalla corteccia circostante per valutare con precisione i livelli di espressione genica all'interno dei follicoli ovarici. Quindi, in uno studio precedente, è stata sviluppata una tecnica di isolamento del follicolo per consentire analisi dell'espressione genica direttamente dall'unità funzionale dell'ovaio5. Sono stati sviluppati diversi approcci, come la digestione enzimatica e/o l'isolamento meccanico, così come la microdissezione a cattura laser, che consente l'isolamento del follicolo all'interno di un pezzo di tessuto 6,7,8,9. L'isolamento del follicolo è ampiamente utilizzato, sia con tessuto ovarico umano che animale, per valutare i profili di espressione genica dei follicoli in tutte le fasi dello sviluppo10,11,12. Tuttavia, una procedura di isolamento ottimale dovrebbe tenere conto della fragile struttura del follicolo all'interno della corteccia densa e, pertanto, dovrebbe essere eseguita con cura per evitare danni7. Questo manoscritto descrive una procedura, adattata da un protocollo descritto dal laboratorio di Woodruff, per isolare i follicoli umani dalla corteccia ovarica congelata e scongelata al fine di eseguire analisi di espressione genica13.

Il primo passo dell'isolamento del follicolo ovarico dal tessuto umano congelato è la procedura di scongelamento. Questo processo viene eseguito sulla base del protocollo clinico utilizzato per l'innesto di tessuto ovarico crioconservato, come precedentemente descritto14,15. Il processo mira a rimuovere gli agenti crioprotettori risciacquando la corteccia ovarica in concentrazioni decrescenti del mezzo. Quindi, il tessuto viene frammentato prima dell'isolamento enzimatico e meccanico per recuperare i follicoli. I follicoli in diversi stadi possono essere distinti utilizzando uno stereomicroscopio ad alto ingrandimento e ottica di buona qualità per isolare quelli di interesse. Ogni follicolo isolato viene misurato utilizzando un righello integrato nel microscopio e i follicoli possono essere raggruppati in base al loro stadio di sviluppo: follicoli primordiali (30 μm), follicoli primari (60 μm), follicoli secondari (120-200 μm) e follicoli antrali (>200 μm)16. Un'ulteriore classificazione può essere eseguita in base alla morfologia dei follicoli: i follicoli primordiali hanno uno strato di cellule granulari appiattite (GC), i follicoli primari hanno uno strato di GC cuboidali, i follicoli secondari hanno almeno due strati di GC cuboidali e la presenza di una cavità tra i GC caratterizza lo stadio antrale. Quando vengono selezionati i follicoli di interesse, viene eseguita l'estrazione dell'RNA. La quantità e la qualità dell'RNA vengono valutate prima della reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR) (Figura 1).

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Protocollo

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Questo progetto è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Erasme (Bruxelles, Belgio). La paziente inclusa in questo protocollo è stata sottoposta a crioconservazione del tessuto ovarico (OTC) per la conservazione della fertilità prima dell'esposizione alla chemioterapia nel 2000. La paziente ha firmato il consenso scritto informato a donare il suo tessuto congelato residuo alla ricerca alla fine del periodo di conservazione.

1. Scongelamento del tessuto ovarico crioconservato

  1. Preparare una piastra a 6 pozzetti contenente cinque soluzioni di scongelamento. Il primo pozzetto contiene 5 ml di soluzione crioprotettiva composta da terreno Leibovitz-15, 0,1 mol/L di saccarosio, 1,5 mol/L di dimetil solfossido (DMSO) e 1% di albumina sierica umana (HSA). I pozzetti successivi contengono 5 ml di terreno Leibovitz-15 con concentrazioni decrescenti di crioprotettore: 1 mol/L, 0,5 mol/L e 2 x 0 mol/L DMSO.
    NOTA: La soluzione crioprotettiva può differire in base al protocollo utilizzato nella clinica della fertilità.
  2. Rimuovere un flaconcino contenente un frammento corticale ovarico dall'azoto liquido nel rispetto delle norme di sicurezza (guanti criogenici, occhiali protettivi e scarpe chiuse) e mantenere il tubo a temperatura ambiente (RT) per 30 s.
  3. Immergere il flaconcino in acqua bidistillata per 2 minuti a RT agitando delicatamente prima di aprire il flaconcino sotto un cappuccio verticale e trasferirlo direttamente nel primo pozzetto della piastra a 6 pozzetti (su ghiaccio).
  4. Trasferire il frammento successivamente in ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti, ciascuno contenente concentrazioni decrescenti di crioprotettore in 5 ml di terreno Leibovitz-15. Agitare delicatamente il tessuto in ogni mezzo per 5 minuti (su ghiaccio).

2. Isolamento del follicolo

NOTA: Tutti gli esperimenti sono condotti utilizzando materiali privi di RNasi e sotto un cappuccio verticale.

  1. Trasferire il tessuto scongelato in una piastra di Petri grigliata di 2 mm riempita con 10 ml di mezzo di dissezione (terreno Leibovitz-15, piruvato di sodio [2 mmol / L], L-glutammina [2 mmol / L], HSA [0,3%], penicillina G [30 μg / ml] e streptomicina [50 μg / ml]). Regolare le dimensioni del tessuto con un bisturi, se necessario.
    NOTA: A seconda del protocollo clinico, la dimensione del tessuto congelato può variare da 8 mm x 4 mm x 1 mm a 4 mm x 2 mm x 1 mm. Per questo protocollo, sono state utilizzate due strisce di 4 mm x 2 mm x 1 mm.
  2. Impilare i tre pezzi dell'affettatrice di tessuto, mettere il frammento tra i due blocchi e tagliare il frammento a metà usando una lama, facendo scorrere tra i blocchi per ottenere due frammenti di 0,5 mm di spessore.
  3. Utilizzare il trinciatutto per tagliare il frammento e ottenere pezzi più piccoli. Se necessario, tagliare manualmente i pezzi rimanenti con un bisturi fino a quando il tessuto non è completamente frantumato.
  4. Trasferire il tessuto frammentato in una piastra di Petri a griglia riempita con 7 ml di terreno di digestione (terreno di coltura [terreno di coltura McCoy's 5A, 3 mmol / L glutammina, 0,1% HSA, 30 μg / mL penicillina G, 50 μg / mL streptomicina, 2,5 μg / mL transferrina, 4 ng / mL selenio e 50 μg / mL di acido ascorbico] integrati con 0,2% collagenasi e 0,02% DNasi).
  5. Mettere il piatto nell'incubatore al 5% di CO2 e 37 °C. Ogni 10 minuti, estrarre la capsula di Petri dall'incubatrice e lavare il tessuto pipettando su e giù con una pipetta da 1 ml.
  6. Dopo 45 minuti di incubazione nel mezzo di digestione, posizionare il piatto sotto uno stereomicroscopio con un intervallo di ingrandimento di 5x-6,3x e recuperare i follicoli utilizzando una pipetta microcapillare. Selezionare i follicoli di interesse e isolarli aspirandoli con una pipetta orale.
    NOTA: il pipettaggio della bocca deve essere eseguito con attenzione per evitare la perdita di materiale nel tubo e la contaminazione.
  7. Se i follicoli rimangono bloccati in un pezzo di corteccia, isolarli meccanicamente con due siringhe da 27 G strappando la corteccia con la punta delle siringhe per rilasciare i follicoli dallo stroma.
    NOTA: Non toccare i follicoli con le siringhe per evitare di danneggiarli.
  8. Trasferire i follicoli con il microcapillare in una piastra a 4 pozzetti contenente gocce di 15 μL del terreno di coltura calibrato coperto da 500 μL di coltura oleosa (da 1 a 10 follicoli per goccia). Questa fase mantiene la vitalità del follicolo durante il processo di raccolta. Alla fine della procedura, sciacquare i follicoli due volte per 5 s ogni volta in due gocce di 15 μL di soluzione salina tamponata fosfato (PBS) coperta da 500 μL di coltura oleosa (su ghiaccio).
  9. Raccogliere 20 follicoli con una quantità minima di PBS utilizzando la pipetta orale (massimo 10 μL) in un tubo vuoto e mantenere il tubo sul ghiaccio.
    NOTA: Per la stabilità dell'RNA, è fondamentale eseguire il passo 2.8 e il passo 2.9 sul ghiaccio. Sono necessari circa 20 follicoli (<75 μm) per avere abbastanza RNA per RT-qPCR standard (SYBR Green).
  10. Dopo un massimo di 90 minuti di incubazione nel mezzo di digestione, interrompere la reazione enzimatica aggiungendo nella capsula di Petri un eccesso di soluzione bloccante fredda (4 °C) (7,5 ml) composta da terreno di coltura integrato con siero bovino fetale (FBS) al 10%.
    NOTA: La soluzione bloccante può essere aggiunta non appena lo sperimentatore osserva follicoli attaccati alla piastra o follicoli danneggiati (forma asimmetrica o follicoli di colore più scuro). Si consiglia di eseguire l'isolamento del follicolo entro un periodo massimo di 2,5 ore per evitare danni follicolari e di eseguire l'estrazione dell'RNA immediatamente dopo l'isolamento.

3. Estrazione dell'RNA

NOTA: L'estrazione dell'RNA viene eseguita seguendo le istruzioni fornite con un kit di estrazione dell'RNA adattando i volumi di eluizione.

  1. Sospendere i follicoli isolati aggiungendo 100 μL della soluzione di lisi fornita con il kit di estrazione dell'RNA al tubo contenente i follicoli sotto un cappuccio chimico e vortice ad alta velocità (2.500 giri / min) per rompere la struttura dei follicoli. Aggiungere 50 μL di etanolo (100%) al tubo e brevemente vortice ad alta velocità.
    NOTA: Poiché il tampone di lisi contiene 2-mercaptoetanolo e acido tiocianico, questo passaggio deve essere eseguito con cautela sotto una cappa chimica.
  2. Trasferire il volume totale del tubo (circa 160 μL) in un gruppo di cartucce di microfiltro comprendente una colonna e un tubo di raccolta e centrifugarlo per 10 s a 16.363 x g a 4 °C. Lavare la colonna con 180 μL di soluzione di lavaggio 1, fornita con il kit, e centrifugare il tubo per 10 s a 16.363 x g a 4 °C.
  3. Aggiungere 180 μL di soluzione di lavaggio 2/3, fornita con il kit, alla colonna e centrifugare per 10 s a 16.363 x g a 4 °C. Eseguire questo passaggio due volte. Centrifugare il tubo un'ultima volta per 1 minuto per asciugare il filtro e posizionare un nuovo tubo di raccolta sotto la cartuccia.
  4. Eseguire l'eluizione degli acidi nucleici in due fasi:
    1. In primo luogo, aggiungere 8 μL di soluzione di eluizione calda (75 °C) al filtro, attendere 1 minuto a RT e centrifugare per 30 s a 16,363 x g a 4 °C.
    2. Ripetere questo passaggio con 7 μL di soluzione di eluizione.
      NOTA: Il tubo contenente gli acidi nucleici eluiti deve essere tenuto su ghiaccio. Per evitare la contaminazione del DNA, una fase supplementare di degradazione del DNA è altamente raccomandata: passo 3.5.
  5. Incubare la provetta con 2 UI DNasi e 1x tampone DNasi per 20 minuti a 37 °C. Bloccare l'attività enzimatica con il reagente di inattivazione della DNasi 1/10 per 2 minuti a RT.
  6. Centrifugare il tubo per 1,5 minuti a 16,363 x g a 4 °C. Infine, raccogliere la sospensione contenente l'RNA e trasferirla in un nuovo tubo.
  7. Valutare la quantità di RNA presente nel campione utilizzando uno spettrofotometro (software NanoDrop 2000 > Nucleic Acid > RNA). Utilizzare 1 μL di soluzione di eluizione come bianco e misurare la quantità di RNA estratta dai follicoli isolati con 1 μL di soluzione.
  8. Controllare il rapporto 260/280 per la purezza dell'RNA (circa 2,0). Conservare il campione a -80 °C o retrotrascriverlo direttamente per eseguire RT-qPCR.
    NOTA: Per valutare l'integrità dell'RNA, il campione può essere elaborato con un sistema di elettroforesi automatizzato ad alta risoluzione prima o dopo il congelamento a -80 °C. In questo lavoro, dopo la retrotrascrizione, RT-qPCR è stato eseguito con il seguente ciclo:
    Tenere il palco con 20 s a 50 °C e 10 min a 95 °C
    40 cicli di PCR con 15 s a 95 °C e 1 min a 60 °C
    Stadio della curva di fusione con 15 s a 95 °C, 1 min a 60 °C, 30 s a 95 °C e 15 s a 60 °C

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Risultati

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Utilizzando questa procedura di isolamento, lo sperimentatore può recuperare i follicoli dall'ambiente stromale per eseguire specifiche analisi di espressione genica. In base alle dimensioni e alla morfologia dei follicoli, è possibile differenziare i diversi stadi della follicologenesi. Lo sperimentatore può selezionare i follicoli di interesse in base alle loro dimensioni utilizzando una pipetta microcapillare adattata. Utilizzando un microcapillare di massimo 75 μm, è possibile discriminare i follicoli primordiali e p...

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Discussione

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La crioconservazione del tessuto ovarico è un approccio promettente per preservare la fertilità delle pazienti oncologiche. In clinica, il tessuto corticale scongelato viene innestato nuovamente nella paziente dopo la remissione, consentendo la ripresa della funzione ovarica e della fertilità19,20. Oltre all'uso clinico, frammenti ovarici residui possono anche essere donati per la ricerca alla fine del periodo di conservazione per studiare i meccanismi che regola...

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Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione Excellence of Science (EOS) (ID: 30443682). I.D. è ricercatore associato presso il Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Piastra di Petri a griglia da 2 mmStrumento Bioanalyzer Corning430196
2100Agilent G2939BA
2100 Expert versioneAgilentB.02.08.SI648
Piastra a 4 pozzettiSigmaAldrich D6789
Piastra a 6 pozzettiCarl Roth  EKX5.1
Kit Agilent total RNA 6000 picoAgilent5067-1513
Acido ascorbicoSigma AldrichA4403
Gruppi di tubi aspiratore per pipette microcapillariSigma AldrichA5177
CentrifugaEppendorf5424R
Collagenase IVLifeTechnologies17104-019
DMSOSigma AldrichD2650
DNaseSigma AldrichD4527-10kU
FBSGibco10270-106
GoScript trascrittasi inversaPromegaA5003
HSACAF DCF LC4403-41-080
Leibovitz-15LifeTechnologies11415-049
L-glutamminaSigma AldrichG7513
McCoy' s 5A + bicarbonato + HepesLifeTechnologies12330-031
Tritatessuti McIlwainStoelting51350
Microcapillary RI EZ-Tips 200 &; mCooperSurgical7-72-2200/1
Punte EZ RI microcapillari 75 &; mCooperSurgical7-72-2075/1
Software operativo NanoDrop 2000/2000cThermoFisherversione 1.6
Spettrofotometro NanoDropThermoFisher2000/2000c
Penicillina GSigma AldrichP3032
PowerTrack SYBR master mix verdeThermoFisherA46109
Primer: GDF9F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Primer: HPRTF: CCTGGCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
Primer: Kit LigandF: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
Real-Time qPCR Quantstudio 3ThermoFisherA33779
Kit di isolamento RNAqueous-micro total RNAThermoFisherAM1931
SelenioSigma AldrichS9133
Piruvato di sodioSigma AldrichS8636
StereomicroscopioNikonSMZ800
Streptomicina solfatoSigma AldrichS1277
SaccarosioSigma AldrichS1888
Thermo Scientific Forma Serie II  camicia d'acqua CO2  incubatriciThermoFisher3110
Affettatrice per tessuti Thomas Stadie-RiggsThomas Scientific6727C10
TransferrinRoche 
10652202001

Riferimenti

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