Analisi dell'espressione genica nei follicoli umani

Melody Devos; Joana Dias Nunes; Isabelle Demeestere

doi:10.3791/64807

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Articolo metodologico

Analisi dell'espressione genica nei follicoli umani

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DOI:

10.3791/64807

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17 febbraio 2023

Melody Devos^*¹ , Joana Dias Nunes^*¹ , Isabelle Demeestere¹^,²

¹Research Laboratory on Human Reproduction, Université libre de Bruxelles (ULB), ²Fertility Clinic, Erasme Hospital, Université libre de Bruxelles (ULB)

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

Qui, descriviamo un protocollo che delinea come isolare i follicoli ovarici umani dal tessuto corticale congelato-scongelato per eseguire analisi di espressione genica.

Abstract

L'ovaio è un organo eterogeneo composto da diversi tipi di cellule. Per studiare i meccanismi molecolari che si verificano durante la follicologenesi, la localizzazione delle proteine e l'espressione genica possono essere eseguite su tessuto fisso. Tuttavia, per valutare correttamente i livelli di espressione genica in un follicolo umano, questa struttura complessa e delicata deve essere isolata. Quindi, un protocollo adattato precedentemente descritto dal laboratorio di Woodruff è stato sviluppato per separare i follicoli (l'ovocita e le cellule della granulosa) dal loro ambiente circostante. Il tessuto corticale ovarico viene prima lavorato manualmente per ottenere piccoli frammenti utilizzando due strumenti: un'affettatrice di tessuto e un tritatutto. Il tessuto viene quindi digerito enzimaticamente con lo 0,2% di collagenasi e lo 0,02% di DNasi per almeno 40 minuti. Questa fase di digestione viene eseguita a 37 °C e al 5% di CO₂ ed è accompagnata da pipettaggio meccanico del mezzo ogni 10 minuti. Dopo l'incubazione, i follicoli isolati vengono raccolti manualmente utilizzando una pipetta microcapillare calibrata al microscopio. Se i follicoli sono ancora presenti nei pezzi di tessuto, la procedura viene completata con la microdissezione manuale. I follicoli vengono raccolti su ghiaccio in un terreno di coltura e vengono risciacquati due volte in goccioline di soluzione salina tamponata con fosfato. Questa procedura di digestione deve essere attentamente controllata per evitare il deterioramento del follicolo. Non appena la struttura dei follicoli appare compromessa o dopo un massimo di 90 minuti, la reazione viene interrotta con una soluzione bloccante a 4 °C contenente siero bovino fetale al 10%. Un minimo di 20 follicoli isolati (di dimensioni inferiori a 75 μm) devono essere raccolti per ottenere una quantità adeguata di RNA totale dopo l'estrazione dell'RNA per la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR). Dopo l'estrazione, la quantificazione dell'RNA totale da 20 follicoli raggiunge un valore medio di 5 ng/μL. L'RNA totale viene quindi retrotrascritto in cDNA e i geni di interesse vengono ulteriormente analizzati utilizzando RT-qPCR.

Introduzione

L'ovaio è un organo complesso composto da unità funzionali e strutturali, compresi i follicoli all'interno della corteccia e lo stroma. La follicologenesi, il processo di attivazione, crescita e maturazione del follicolo da uno stato quiescente primordiale a un follicolo maturo in grado di essere fecondato e di supportare lo sviluppo embrionale precoce, è ampiamente studiato nella ricerca¹. Svelare i meccanismi che guidano questo fenomeno potrebbe migliorare la cura della fertilità per le donne². Le analisi su tessuto umano fisso permettono di valutare l'espressione proteica e la localizzazione genica all'interno delle u....