Method Article

Analisi dell'espressione genica nei follicoli umani

DOI:

10.3791/64807

⸱

February 17th, 2023

 ,  , 
1Research Laboratory on Human Reproduction, Université libre de Bruxelles (ULB), 2Fertility Clinic, Erasme Hospital, Université libre de Bruxelles (ULB)

In This Article

Summary

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Qui, descriviamo un protocollo che delinea come isolare i follicoli ovarici umani dal tessuto corticale congelato-scongelato per eseguire analisi di espressione genica.

Abstract

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L'ovaio è un organo eterogeneo composto da diversi tipi di cellule. Per studiare i meccanismi molecolari che si verificano durante la follicologenesi, la localizzazione delle proteine e l'espressione genica possono essere eseguite su tessuto fisso. Tuttavia, per valutare correttamente i livelli di espressione genica in un follicolo umano, questa struttura complessa e delicata deve essere isolata. Quindi, un protocollo adattato precedentemente descritto dal laboratorio di Woodruff è stato sviluppato per separare i follicoli (l'ovocita e le cellule della granulosa) dal loro ambiente circostante. Il tessuto corticale ovarico viene prima lavorato manualmente per ottenere piccoli frammenti utilizzando due strumenti: un'affettatrice di tessuto e un tritatutto. Il tessuto viene quindi digerito enzimaticamente con lo 0,2% di collagenasi e lo 0,02% di DNasi per almeno 40 minuti. Questa fase di digestione viene eseguita a 37 °C e al 5% di CO2 ed è accompagnata da pipettaggio meccanico del mezzo ogni 10 minuti. Dopo l'incubazione, i follicoli isolati vengono raccolti manualmente utilizzando una pipetta microcapillare calibrata al microscopio. Se i follicoli sono ancora presenti nei pezzi di tessuto, la procedura viene completata con la microdissezione manuale. I follicoli vengono raccolti su ghiaccio in un terreno di coltura e vengono risciacquati due volte in goccioline di soluzione salina tamponata con fosfato. Questa procedura di digestione deve essere attentamente controllata per evitare il deterioramento del follicolo. Non appena la struttura dei follicoli appare compromessa o dopo un massimo di 90 minuti, la reazione viene interrotta con una soluzione bloccante a 4 °C contenente siero bovino fetale al 10%. Un minimo di 20 follicoli isolati (di dimensioni inferiori a 75 μm) devono essere raccolti per ottenere una quantità adeguata di RNA totale dopo l'estrazione dell'RNA per la reazione a catena della polimerasi quantitativa in tempo reale (RT-qPCR). Dopo l'estrazione, la quantificazione dell'RNA totale da 20 follicoli raggiunge un valore medio di 5 ng/μL. L'RNA totale viene quindi retrotrascritto in cDNA e i geni di interesse vengono ulteriormente analizzati utilizzando RT-qPCR.

Introduction

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L'ovaio è un organo complesso composto da unità funzionali e strutturali, compresi i follicoli all'interno della corteccia e lo stroma. La follicologenesi, il processo di attivazione, crescita e maturazione del follicolo da uno stato quiescente primordiale a un follicolo maturo in grado di essere fecondato e di supportare lo sviluppo embrionale precoce, è ampiamente studiato nella ricerca1. Svelare i meccanismi che guidano questo fenomeno potrebbe migliorare la cura della fertilità per le donne2. Le analisi su tessuto umano fisso permettono di valutare l'espressione proteica e la localizzazione genica all'interno delle u....

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Protocol

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Questo progetto è stato approvato dal Comitato Etico dell'Ospedale Erasme (Bruxelles, Belgio). La paziente inclusa in questo protocollo è stata sottoposta a crioconservazione del tessuto ovarico (OTC) per la conservazione della fertilità prima dell'esposizione alla chemioterapia nel 2000. La paziente ha firmato il consenso scritto informato a donare il suo tessuto congelato residuo alla ricerca alla fine del periodo di conservazione.

1. Scongelamento del tessuto ovarico crioconservato

  1. Preparare una piastra a 6 pozzetti contenente cinque soluzioni di scongelamento. Il primo pozzetto contiene 5 ml di soluzione criop....

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Results

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Utilizzando questa procedura di isolamento, lo sperimentatore può recuperare i follicoli dall'ambiente stromale per eseguire specifiche analisi di espressione genica. In base alle dimensioni e alla morfologia dei follicoli, è possibile differenziare i diversi stadi della follicologenesi. Lo sperimentatore può selezionare i follicoli di interesse in base alle loro dimensioni utilizzando una pipetta microcapillare adattata. Utilizzando un microcapillare di massimo 75 μm, è possibile discriminare i follicoli primordiali e p.......

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Discussion

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La crioconservazione del tessuto ovarico è un approccio promettente per preservare la fertilità delle pazienti oncologiche. In clinica, il tessuto corticale scongelato viene innestato nuovamente nella paziente dopo la remissione, consentendo la ripresa della funzione ovarica e della fertilità19,20. Oltre all'uso clinico, frammenti ovarici residui possono anche essere donati per la ricerca alla fine del periodo di conservazione per studiare i meccanismi che regola.......

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Disclosures

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Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato supportato da una sovvenzione Excellence of Science (EOS) (ID: 30443682). I.D. è ricercatore associato presso il Fonds National de la Recherche Scientifique de Belgique (FNRS).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Piastra di Petri a griglia da 2 mmStrumento Bioanalyzer Corning430196
2100Agilent G2939BA
2100 Expert versioneAgilentB.02.08.SI648
Piastra a 4 pozzettiSigmaAldrich D6789
Piastra a 6 pozzettiCarl Roth  EKX5.1
Kit Agilent total RNA 6000 picoAgilent5067-1513
Acido ascorbicoSigma AldrichA4403
Gruppi di tubi aspiratore per pipette microcapillariSigma AldrichA5177
CentrifugaEppendorf5424R
Collagenase IVLifeTechnologies17104-019
DMSOSigma AldrichD2650
DNaseSigma AldrichD4527-10kU
FBSGibco10270-106
GoScript trascrittasi inversaPromegaA5003
HSACAF DCF LC4403-41-080
Leibovitz-15LifeTechnologies11415-049
L-glutamminaSigma AldrichG7513
McCoy' s 5A + bicarbonato + HepesLifeTechnologies12330-031
Tritatessuti McIlwainStoelting51350
Microcapillary RI EZ-Tips 200 &; mCooperSurgical7-72-2200/1
Punte EZ RI microcapillari 75 &; mCooperSurgical7-72-2075/1
Software operativo NanoDrop 2000/2000cThermoFisherversione 1.6
Spettrofotometro NanoDropThermoFisher2000/2000c
Penicillina GSigma AldrichP3032
PowerTrack SYBR master mix verdeThermoFisherA46109
Primer: GDF9F: CCAGGTAACAGGAATCCTTC R: GGCTCCTTTATCATTAGATTG
Primer: HPRTF: CCTGGCGTGATTAGTGAT R: GAGCACACAGAGGGCTACAA
Primer: Kit LigandF: TGTTACTTTCGTACATTGGCTGG R: AGTCCTGCTCCATGCAAGTT
Real-Time qPCR Quantstudio 3ThermoFisherA33779
Kit di isolamento RNAqueous-micro total RNAThermoFisherAM1931
SelenioSigma AldrichS9133
Piruvato di sodioSigma AldrichS8636
StereomicroscopioNikonSMZ800
Streptomicina solfatoSigma AldrichS1277
SaccarosioSigma AldrichS1888
Thermo Scientific Forma Serie II  camicia d'acqua CO2  incubatriciThermoFisher3110
Affettatrice per tessuti Thomas Stadie-RiggsThomas Scientific6727C10
TransferrinRoche 
10652202001

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gougeon, A. Human ovarian follicular development: From activation of resting follicles to preovulatory maturation. Annales d'Endocrinologie. 71 (3), 132-143 (2010).
  2. Yang, D. Z., Yang, W., Li, Y., He, Z.

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Gene ExpressionHuman FolliclesFollicle IsolationOvarian TissueEnzymatic DigestionGranulosa CellsRNA ExtractionRT qPCROocyte IsolationFolliculogenesis

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