Articolo metodologico
Qui viene presentato un protocollo per la formulazione di nanoparticelle lipidiche (LNP) che incapsulano l'mRNA che codifica per la luciferasi delle lucciole. Questi LNP sono stati testati per la loro potenza in vitro in cellule HepG2 e in vivo in topi C57BL/6.
Le nanoparticelle lipidiche (LNP) hanno recentemente attirato l'attenzione generale con il successo dello sviluppo dei vaccini a mRNA COVID-19 di Moderna e Pfizer/BioNTech. Questi vaccini hanno dimostrato l'efficacia delle terapie a base di mRNA-LNP e hanno aperto la porta a future applicazioni cliniche. Nei sistemi mRNA-LNP, gli LNP fungono da piattaforme di rilascio che proteggono il carico di mRNA dalla degradazione da parte delle nucleasi e mediano il loro rilascio intracellulare. Le LNP sono tipicamente composte da quattro componenti: un lipide ionizzabile, un fosfolipide, il colesterolo e un coniugato di polietilenglicole (PEG) ancorato ai lipidi (lipid-PEG). Qui, gli LNP che incapsulano l'mRNA che codifica per la luciferasi della lucciola sono formulati mediante miscelazione microfluidica della fase organica contenente i componenti lipidici LNP e della fase acquosa contenente l'mRNA. Questi mRNA-LNP vengono quindi testati in vitro per valutare la loro efficienza di trasfezione nelle cellule HepG2 utilizzando un saggio bioluminescente basato su piastre. Inoltre, gli mRNA-LNP sono valutati in vivo in topi C57BL/6 a seguito di un'iniezione endovenosa attraverso la vena caudale laterale. L'imaging a bioluminescenza di tutto il corpo viene eseguito utilizzando un sistema di imaging in vivo . Vengono mostrati risultati rappresentativi per le caratteristiche dell'mRNA-LNP, la loro efficienza di trasfezione nelle cellule HepG2 e il flusso luminescente totale nei topi C57BL/6.
Le nanoparticelle lipidiche (LNP) si sono dimostrate molto promettenti negli ultimi anni nel campo della terapia genica non virale. Nel 2018, la Food and Drug Administration (FDA) degli Stati Uniti ha approvato la prima terapia di interferenza dell'RNA (RNAi), Onpattro di Alnylam, per il trattamento dell'amiloidosi ereditaria da transtiretina 1,2,3,4. Questo è stato un importante passo avanti per le nanoparticelle lipidiche e le terapie a base di RNA. Più recentemente, Moderna e Pfizer/BioNTech hanno ricevuto l'approvazione della FDA per i l....
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NOTA: Mantenere sempre condizioni prive di RNasi durante la formulazione di mRNA-LNP pulendo le superfici e le apparecchiature con un decontaminante di superficie per RNasi e DNA. Utilizzare solo puntali e reagenti privi di RNasi.
Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le Linee guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio dell'Università della Pennsylvania e un protocollo approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) dell'Università della Pennsylvania.
1. Preparazione pre-formulazione
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Gli mRNA-LNP sono stati formulati utilizzando uno strumento microfluidico che possedeva un diametro idrodinamico medio di 76,16 nm e un indice di polidispersità di 0,098. Il pKa degli mRNA-LNP è risultato essere 5,75 eseguendo un test TNS18. L'efficienza di incapsulamento per questi mRNA-LNP è stata calcolata al 92,3% utilizzando il saggio di fluorescenza modificato e l'equazione 4.4. La concentrazione complessiva di RNA utilizzata per il trattamento cellulare .......
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Con questo flusso di lavoro, una varietà di mRNA-LNP può essere formulata e testata per la loro efficienza in vitro e in vivo. I lipidi ionizzabili e gli eccipienti possono essere scambiati e combinati con diversi rapporti molari e diversi rapporti di peso tra lipidi ionizzabili e mRNA per produrre mRNA-LNP con diverse proprietà fisico-chimiche22. Qui, abbiamo formulato C12-200 mRNA-LNP con un rapporto molare di 35/16/46,5/2,5 (lipide ionizzabile:lipide helper:colesterolo:lipide-.......
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Non ci sono conflitti di interesse da dichiarare.
M.J.M. riconosce il sostegno di un direttore del National Institutes of Health (NIH) degli Stati Uniti (DP2 TR002776), di un Burroughs Wellcome Fund Career Award presso la Scientific Interface (CASI), di un premio alla carriera della National Science Foundation degli Stati Uniti (CBET-2145491) e di ulteriori finanziamenti da parte del National Institutes of Health (NCI R01 CA241661, NCI R37 CA244911 e NIDDK R01 DK123049).
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| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,1 M Acido cloridrico | Sigma | 7647-01-0 | |
| 0,22 μ m Filtri per siringhe | Genesee | 25-243 | |
| 1 mL BD Siringa con punta scorrevole | BD | 309659 | |
| 1,2-dimiristoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-[metossi(polietilenglicole)-2000] (sale di ammonio) (C14-PEG2000) | Avanti Polar Lipids | 880150P | |
| 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725P | |
| 1.5 mL Eppendorf Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 15 mL Provette coniche | Fisher Scientific | 14-959-70C | |
| 200 proof Ethanol | Decon Labs | 2716 | |
| 23G Aghi | Fisher Scientific | 14-826-6C | |
| 3 mL BD Siringhe monouso con punte Luer-Lok | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| 3 mL Dialisi Cassette | Thermo Scientific | A52976 | |
| 96 pozzetti parete nera piastra inferiore nera | Fisher Scientific | 07-000-135 | |
| 96 pozzetti piastra inferiore bianca / trasparente, superficie TC | Thermo Scientific | 165306 | |
| acetato di ammonio, 1 chilogrammo | Research Products International | 631-61-8 | |
| Citrato di ammonio bibasico | SIgma | 3012-65-5 | |
| BD Luer-Lok Siringa sterile, monouso, 5 mL | BD | 309646 | |
| C12-200 Lipidi ionizzabili | Cayman Chemical | 36699 | |
| C57BL/6 Topi | Jackson Laboratory | 000664 | |
| Colesterolo | Sigma | 57-88-5 | |
| CleanCap FLuc mRNA (5moU) | TriLink Biotechnologies | L-7202 | |
| Cuvette monouso | Fisher Scientific | 14955129 | |
| D-luciferina, sale di potassio | Thermo Scientific | L2916 | |
| DMEM, alto glucosio | Thermofisher Scientific | 11965-084 | |
| Exel Siringhe da insulina - 0,5 mL | Fisher Scientific | 1484132 | |
| Siero fetale bovino | Corning | 35-010-CV | |
| Hep G2 [HEPG2] | ATCC | HB-8065 | |
| HyPure Acqua di grado di biologia molecolare | Cytiva | SH30538.03 | |
| Infinite 200 PRO Plate Reader | Tecan | N/A | |
| IVIS Spectrum In Vivo System | Perkin Elmer | N/A | |
| Large Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666-11D | |
| dosaggio della luciferasi | Promega | E4550 | |
| NanoAssemblr Ignite Cartucce - Classic - Confezione da 100 | Nanosystems di precisione | NIN0065 | |
| NanoAssemblr Ignite Instrument | Nanosystems di precisione | NIN0001 | |
| PBS - Soluzione salina tamponata con fosfato (10x) pH 7,4, senza RNasi | Thermo Scientific | AM9624 | |
| Penicillina-Streptomicina | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| QB Citrato Tampone, (Citrato 100 mM) pH 3.0 | Teknova | Q2442 | |
| Quant-it RiboGreen Kit di analisi dell'RNA | Thermo Scientific | R11490 | |
| Reporter Lisi 5x Tampone | Promega | E3971 | |
| RNasi Away Surface Decontaminante | Thermofisher Scientific | 7000TS1 | |
| Cloruro di sodio | Sigma | 7647-14-5 | |
| Idrossido di sodio | Sigma | 1310-73-2 | |
| Fosfato di sodio | Sigma | 7601-54-9 | |
| Reagente TNS (sale sodico dell'acido 6-(p-Toluidino)-2-naftalensolfonico) | Sigma | T9792 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9036-19-5 | |
| Zetasizer | Malvern Panalytical | NanoZS |
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