Articolo metodologico

Strategie di screening di piccole molecole dall'identificazione del lead alla convalida

DOI:

10.3791/64811

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20 gennaio 2023

1Department of Cancer Biology, Chemical Biology Program, Dana-Farber Cancer Institute

In questo articolo

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ARTICOLI DISCUSSI:

Festa, F., Labaer, J. Screening degli inibitori della chinasi in microarray di proteine umane autoassemblate. Giornale degli esperimenti visualizzati. 152, E59886 (2019).

Stockman, B. J. et al. Saggi di attività basati su NMR per determinare l'inibizione dei composti, i valori IC50, l'attività artefattuale e l'attività dell'intera cellula delle riboidrolasi nucleosidiche. Giornale degli esperimenti visualizzati. 148, E59928 (2019).

Gao, S. et al. Un test ad alto rendimento per la previsione della tossicità chimica mediante profilazione fenotipica automatizzata di Caenorhabditis elegans. Giornale degli esperimenti visualizzati. 145, E59082 (2019).

Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Utilizzo dell'imaging ad alto contenuto per quantificare l'impegno del bersaglio nelle cellule aderenti. Giornale degli esperimenti visualizzati. 141, E58670 (2018).

Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. Un test di luciferasi ad alto rendimento per valutare la proteolisi della proteasi PCSK9 a singolo turnover. Giornale degli esperimenti visualizzati. 138, E58265 (2018).

Sullivan, C. et al. Utilizzo di modelli di zebrafish di infezioni da virus dell'influenza A umana per lo screening di farmaci antivirali e la caratterizzazione delle risposte delle cellule immunitarie dell'ospite. Giornale degli esperimenti visualizzati. 119, E55235 (2017).

Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Valutazione della resistenza agli inibitori della tirosin-chinasi mediante un'interrogazione delle vie di trasduzione del segnale da parte di array di anticorpi. Giornale degli esperimenti visualizzati. 139, E57779 (2018).

Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. Un adattamento semi-high-throughput del saggio dell'ATPasi accoppiato a NADH per lo screening di inibitori di piccole molecole. Giornale degli esperimenti visualizzati. 150, E60017 (2019).

Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Sviluppo di inibitori delle interazioni proteina-proteina attraverso REPLACE: Applicazione alla progettazione e allo sviluppo di inibitori CDK non ATP competitivi. Giornale degli esperimenti visualizzati. 104, E52441 (2015).

Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identificazione di mediatori della segnalazione del recettore delle cellule T tramite lo screening di librerie di inibitori chimici. Giornale degli esperimenti visualizzati. 143, E58946 (2019).

Takakusagi, Y. Strategia di biopanning e analisi bioinformatica ad alto rendimento basata su biosensori per la convalida globale delle interazioni farmaco-proteina. Giornale degli esperimenti visualizzati. 166, E61873 (2020).

Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. Profilazione cellulare ad alto rendimento di composti di degradazione proteica mirati utilizzando linee cellulari HiBiT CRISPR. Giornale degli esperimenti visualizzati. 165, E61787 (2020).

Editoriale

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La rivoluzione della genomica ha portato a una grande quantità di conoscenze sull'associazione tra perturbazione genetica e diversi fenotipi di malattia1. Ciò ha portato all'annotazione di numerose proteine come potenziali bersagli farmacologici e ha stimolato l'interesse per la scoperta e lo sviluppo di composti che inibiscono questi bersagli2. In questo contesto, diverse strategie di screening sono emerse come approcci importanti per la scoperta di composti di successo, la convalida del bersaglio, la misurazione delle affinità di legame, la selettività, la tossicità e l'impegno del bersaglio all'interno della cellula, nonché la reattività, la stabilità e le proprietà farmacochinetiche dei composti. Questa raccolta cattura alcuni dei progressi metodologici in questo settore con l'obiettivo di mostrare una moltitudine di strategie che possono essere utilizzate per lo screening e la valutazione dell'attività biochimica e/o biologica di piccole molecole.

Le protein chinasi rappresentano una grande famiglia di enzimi con oltre 500 membri. Questi enzimi sono regolatori chiave di tutti i processi cellulari e il loro malfunzionamento è stato collegato a numerose malattie3. Pertanto, sono stati al centro di un intenso interesse per la scoperta di farmaci e, per estensione, per lo sviluppo di metodologie. Pertanto, quattro articoli di questa raccolta riportano i progressi in questo spazio. Festa et al. descrivono una piattaforma di screening per la scoperta di inibitori della chinasi che utilizza array di proteine programmabili di acidi nucleici autoassemblati (NAPPA)4. Questi array visualizzano chinasi umane a lunghezza intera e consentono lo screening multiplex di composti in un'ampia collezione di chinasi, consentendo così non solo l'identificazione dei risultati, ma anche la profilazione della selettività. Tieman et al. descrivono un metodo basato su microarray di fosfoanticorpi sviluppato per lo screening dei cambiamenti a livello cellulare nello stato di fosforilazione come lettura dell'attività dell'inibitore della chinasi5. Ciò può portare a intuizioni sulla natura dei percorsi che sono diventati resistenti all'inibizione, che è un parametro importante rilevante per comprendere la risposta e l'efficacia dei farmaci. Chen et al. descrivono un test di citometria a flusso per lo screening di raccolte di inibitori della chinasi per identificare i composti che influenzano la segnalazione del recettore delle cellule T (TCR)6. Questa strategia ha portato alla rapida identificazione delle chinasi coinvolte nella segnalazione del TCR, indicando il loro potenziale come bersagli per lo sviluppo di farmaci immunoterapici. Infine, l'attività di molte chinasi è regolata attraverso interazioni proteina-proteina (PPI), suggerendo che i composti che hanno come bersaglio questi PPI potrebbero essere interessanti. Nandha Premnath et al. descrivono un metodo chiamato REPLACE (sostituzione con alternative di ligandi parziali utilizzando l'arricchimento computazionale) che può essere utilizzato per sviluppare PPI non ATP competitivi di chinasi convertendo le caratteristiche dei leganti peptidici in piccole molecole che coinvolgono la stessa superficie di legame7.

Oltre alle chinasi, molti altri enzimi svolgono un ruolo nella malattia e sono stati perseguiti nella scoperta di farmaci. Pertanto, sono interessanti anche i metodi ottimizzati per enzimi diversi dalle chinasi. Ad esempio, Stockman et al. descrivono saggi di attività basati sulla spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) per scoprire e valutare gli inibitori delle riboidrolasi nucleosidiche dal parassita Trichomonas vaginalis8. Questi saggi possono essere utilizzati anche per la determinazione dei valori IC50 . Per lo screening degli inibitori dell'ATPasi, Radnai et al. hanno sviluppato un metodo di screening semi-high throughput che utilizza un formato di test enzimatico accoppiato che coinvolge due enzimi (piruvato chinasi e lattato deidrogenasi) che alla fine traduce l'attività dell'ATPasi in fluorescenza intrinseca della nicotinammide adenina dinucleotide (NADH) come lettura9. A differenza di tutti gli enzimi descritti finora che sono processivi e catalizzano più passaggi, la proproteina convertasi subtilisina/kesina di tipo 9 (PCSK9) è una proteasi a singolo turnover che viene autoinibita dal suo substrato. Ciò rende difficile lo screening per gli inibitori di PCSK9 e Chorba et al. descrivono un metodo basato su cellule ad alto rendimento che collega l'attività di scissione di PCSK9 all'attività della luciferasi secreta come lettura, consentendo così lo screening per gli inibitori10.

Oltre a trovare composti che inibiscono l'attività di vari bersagli, sono di grande interesse anche i saggi che confermano che il composto coinvolge il suo bersaglio previsto nelle cellule. Axelsson et al. descrivono una strategia per convalidare l'impegno del bersaglio nelle cellule aderenti basata sulla combinazione di imaging ad alto contenuto mediante anticorpi immunofluorescenti e un saggio di spostamento termico cellulare (CETSA)11. Questo test utilizza una sfida termica isotermica su cellule trattate con un'ampia raccolta di composti per identificare i composti stabilizzanti. Un metodo in grado di valutare l'impegno e l'attività del bersaglio delle molecole degradatrici, sviluppato da Riching et al., utilizza la tecnologia di marcatura HiBiT/LgBiT per produrre una proteina luminescente e monitorare i parametri di degradazione attraverso una diminuzione della luminescenza12. Infine, Takakusagi et al. descrivono un metodo per convalidare le interazioni proteina-farmaco che si basa sull'utilizzo di display peptidici basati su fagi per lo screening del legame tra i motivi peptidici leganti i farmaci e le piccole molecole13. Lo schermo di visualizzazione dei peptidi è combinato con l'analisi bioinformatica per convalidare il legame del bersaglio.

Un altro livello di validazione di piccole molecole è la caratterizzazione dei loro effetti in modelli animali. Questa raccolta include due metodi di questo tipo, uno che utilizza modelli di zebrafish (Danio rerio) di infezione da virus dell'influenza A umana per valutare l'efficacia di composti con attività antivirale, nonché la risposta immunitaria dell'ospite14, e un altro che impiega Caenorhabditis elegans come modello per profilare la tossicità dei composti15. Entrambi questi studi evidenziano la necessità di metodi ottimizzati in grado di valutare l'efficacia e la tossicità in vivo.

In conclusione, la scoperta e lo sviluppo di farmaci sono processi formidabili con numerosi colli di bottiglia, sfide e un'alta probabilità di fallimento. Inoltre, il continuo carico di malattie, sia nell'area delle malattie infettive, dove il numero di agenti patogeni resistenti ai farmaci è cresciuto a un ritmo allarmante, sia nelle aree in cui la crescente prevalenza di malattie croniche e malattie associate all'invecchiamento della popolazione, richiede la nostra attenzione e la nostra azione mirate. Questa raccolta evidenzia diversi metodi che mirano ad accelerare la scoperta, la convalida e la caratterizzazione dei farmaci. In futuro, ci aspettiamo di vedere ulteriori innovazioni in questo settore, in particolare quelle volte a migliorare la produttività dello screening, aumentare la diversità delle librerie chimiche e sviluppare modelli in vivo compatibili con lo screening ad alto rendimento (HTS). Inoltre, i flussi di lavoro che forniscono una visione olistica della potenza, della selettività, della specificità, dell'efficacia e della tossicità su scala più rapida e più piccola potrebbero essere particolarmente abilitanti.

Dichiarazioni

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M.K. è un consulente retribuito per Life Science Editors.

Ringraziamenti

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M.K. è in parte supportato dal CA236754 NCI T32.

Riferimenti

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  1. Vincent, F., et al. Phenotypic drug discovery: recent successes, lessons learned and new directions. Nature Reviews Drug Discovery. , (2022).
  2. Ha, J., Park, H., Park, J., Park, S. B. Recent advances in identifying protein targets in drug discovery. Cell Chemical Biology. 28, 394-423 (2021).
  3. Attwood, M. M., et al. Trends in kinase drug discovery: targets, indications and inhibitor design. Nature Reviews. Drug Discovery. 20, 839-861 (2021).
  4. Festa, F., Labaer, J. Kinase inhibitor screening in self-assembled human protein microarrays. Journal of Visualized Experiments. (152), e59886(2019).
  5. Tiemann, K., Garri, C., Wang, J., Clarke, L., Kani, K. Assessment of resistance to tyrosine kinase inhibitors by an interrogation of signal transduction pathways by antibody arrays. Journal of Visualized Experiments. (139), e57779(2018).
  6. Chen, E. W., Ke, C. Y., Brzostek, J., Gascoigne, N. R. J., Rybakin, V. Identification of mediators of T-cell receptor signaling via the screening of chemical inhibitor libraries. Journal of Visualized Experiments. (143), e58946(2019).
  7. Nandha Premnath, P., Craig, S., McInnes, C. Development of inhibitors of protein-protein interactions through REPLACE: Application to the design and development non-ATP competitive CDK inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (104), e52441(2015).
  8. Stockman, B. J., et al. NMR-Based activity assays for determining compound inhibition, IC50 values, artifactual activity, and whole-cell activity of nucleoside ribohydrolases. Journal of Visualized Experiments. (148), e59928(2019).
  9. Radnai, L., Stremel, R. F., Sellers, J. R., Rumbaugh, G., Miller, C. A. A semi-high-throughput adaptation of the NADH-coupled ATPase assay for screening small molecule inhibitors. Journal of Visualized Experiments. (150), e60017(2019).
  10. Chorba, J. S., Galvan, A. M., Shokat, K. M. A high-throughput luciferase assay to evaluate proteolysis of the single-turnover protease PCSK9. Journal of Visualized Experiments. (138), e58265(2018).
  11. Axelsson, H., Almqvist, H., Seashore-Ludlow, B. Using high content imaging to quantify target engagement in adherent cells. Journal of Visualized Experiments. (141), e58670(2018).
  12. Riching, K. M., Mahan, S. D., Urh, M., Daniels, D. L. High-Throughput cellular profiling of targeted protein degradation compounds using HiBiT CRISPR cell lines. Journal of Visualized Experiments. (165), e61787(2020).
  13. Takakusagi, Y. Biosensor-based high throughput biopanning and bioinformatics analysis strategy for the global validation of drug-protein interactions. Journal of Visualized Experiments. (166), e61873(2020).
  14. Sullivan, C., et al. Using zebrafish models of human influenza A virus infections to screen antiviral drugs and characterize host immune cell responses. Journal of Visualized Experiments. (119), e55235(2017).
  15. Gao, S., et al. A high-throughput assay for the prediction of chemical toxicity by Automated phenotypic profiling of Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (145), e59082(2019).

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