Viene delineato un protocollo per eseguire immagini in tempo reale per quantificare come la proteina accessoria TnpB influenzi la dinamica della trasposizione nelle singole cellule vive di Escherichia coli .
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Articolo metodologico
Quantificazione in tempo reale degli effetti del TnpB associato alla famiglia IS200/IS605 sull'attività di trasposone
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In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui, viene delineato un protocollo per eseguire immagini in tempo reale dell'attività degli elementi trasponibili in cellule batteriche vive utilizzando una suite di reporter fluorescenti accoppiati alla trasposizione. In particolare, dimostra come l'imaging in tempo reale possa essere utilizzato per valutare gli effetti della proteina accessoria TnpB sull'attività dell'elemento trasponibile IS608, un membro della famiglia di elementi trasponibili IS200/IS605. La famiglia IS200/IS605 di elementi trasponibili sono abbondanti elementi mobili collegati con uno degli innumerevoli geni presenti in natura, tnpB. Le omologie di sequenza propongono che la proteina TnpB possa essere un precursore evolutivo dei sistemi CRISPR/Cas9. Inoltre, TnpB ha ricevuto un rinnovato interesse, avendo dimostrato di agire come un'endonucleasi del DNA guidata da RNA simile al Cas. Gli effetti di TnpB sui tassi di trasposizione di IS608 sono quantificati ed è dimostrato che l'espressione di TnpB di IS608 si traduce in ~5 volte maggiore attività di trasposone rispetto alle cellule prive di espressione di TnpB.
Introduzione
Gli elementi trasponibili (TE) sono elementi genetici che si mobilitano all'interno dei loro genomi ospiti per escissione o copia catalizzata seguita da reintegrazione genomica. I TE esistono in tutti i domini della vita e la trasposizione ristruttura il genoma ospite, mutando le regioni codificanti e di controllo1. Ciò genera mutazioni e diversità che svolgono un ruolo importante nell'evoluzione2,3, nello sviluppo 4,5 e in diverse malattie umane6, incluso il cancro7.
Utilizzando nuovi costrutti genetici che accoppiano aspetti dell'attività trasposizionale a reporter fluorescenti, il nostro lavoro precedente ha descritto lo sviluppo di un sistema sperimentale basato sul batterico TE IS608, un rappresentante della diffusa famiglia di TE IS200/IS605, che consente la visualizzazione in tempo reale della trasposizione in singole cellule vive8 (Figura 1). Il sistema TE è mostrato nella Figura 1A. Il TE comprende la sequenza codificante della trasposasi, tnpA, affiancata da ripetizioni palindromiche imperfette (IP) dell'estremità sinistra (LE) e dell'estremità destra (RE), che sono i siti di riconoscimento ed escissione per TnpA. tnpA è espresso utilizzando il promotore PLTetO1, che viene represso dal repressore tet ed è inducibile con aniidrotetraciclina (aTc)9. Il TE divide le sequenze -10 e -35 di un promotore costitutivo PlacIQ1 10 per il reporter blu mCerulean311. Come mostrato nella figura 1C, quando viene indotta la produzione di tnpA, il TE può essere asportato, portando alla ricostituzione del promotore. La cellula prodotta esprime mCerulean3 e fluoresce di blu. L'N-terminale del TnpA è fuso al reporter giallo Venere12, permettendo la misurazione dei livelli di TnpA mediante fluorescenza gialla.
IS608 e altri membri della famiglia di trasposoni IS200/IS605 codificano tipicamente anche un secondo gene della funzione finora sconosciuta, tnpB13. Le proteine TnpB sono una famiglia di nucleasi tremendamente abbondante ma non perfettamente caratterizzata codificata da diversi TE batterici e archeali 14,15, che spesso consistono solo di tnpB 16. Inoltre, studi recenti hanno rinnovato l'interesse per il TnpB scoprendo che il TnpB funziona come un'endonucleasi programmabile guidata da RNA simile a CRISPR / Cas che produrrà rotture di dsDNA o ssDNA in diverse condizioni17,18. Tuttavia, non è chiaro quale ruolo possa svolgere il TnpB nella regolamentazione del recepimento. Per eseguire la visualizzazione in tempo reale degli effetti di TnpB sulla trasposizione IS608, è stata creata una versione del trasposone, inclusa la regione codificante di TnpB con una fusione N-terminale alla proteina fluorescente rossa mCherry.
A complemento di studi più dettagliati a livello di massa eseguiti dal laboratorio Kuhlman19, viene mostrato qui come l'imaging in tempo reale dell'attività dei trasposoni possa rivelare quantitativamente l'impatto di TnpB o di qualsiasi altra proteina accessoria sulla dinamica trasposizionale. Fondendo TnpB a mCherry, i singoli eventi trasposizionali sono identificati dalla fluorescenza blu e correlati con i livelli di espressione di TnpA (fluorescenza gialla) e TnpB (fluorescenza rossa).
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Protocollo
1. Preparazione di colture batteriche
- Coltivare E. coli ceppo MG1655 con costrutti di trasposone plasmidico (precedentemente descritti in Kim et al.8) durante la notte in LB con gli antibiotici appropriati (25 μg/mL di kanamicina, vedi Tabella dei materiali) a 37 °C.
NOTA: Le sequenze dei costrutti utilizzati e le relative sequenze sono disponibili come numeri di adesione GenBank20 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 e OP717085. - Per ottenere una crescita esponenziale allo stato stazionario, colture diluite ≥100 volte nel mezzo M63 (100 mM KH 2 PO 4, 1 mM MgSO 4, 1,8 μM FeSO 4, 15 mM [NH 4]2SO 4, 0,5 μg/mL tiamina [vitamina B1]) integrate con una fonte di carbonio (0,5% p/v di glucosio qui) e antibiotici appropriati (vedi Tabella dei materiali).
- Coltivare colture a 37 °C fino a quando la densità ottica a 600 nm (OD600) raggiunge ~ 0,2. Le colture sono pronte per l'uso.
2. Preparazione della diapositiva
- Preparare un vetrino facendo bollire M63 con 0,5% p/v di glucosio e 1,5% p/v di agarosio nel microonde per sciogliere l'agarosio e assicurarsi che sia completamente fuso e ben miscelato.
- Lasciare raffreddare la miscela a ~55 °C prima di aggiungere antibiotici e induttori (25 μg/mL di kanamicina e 10 ng/μL di aniidrotetraciclina [aTc], vedere la tabella dei materiali).
- Posizionare un vetrino da microscopio sul banco di lavoro. Impila altre due diapositive perpendicolari alla prima e posizionane un'altra in alto, parallela alla diapositiva inferiore. Assicurarsi che vi sia uno spazio pari allo spessore di una diapositiva tra le diapositive inferiore e superiore. Pipettare ~ 1 mL della miscela di agarosio M63 in questo spazio tra i vetrini lentamente per creare un piccolo quadrato di gel.
- Una volta che il gel si è solidificato (~ 10-15 min), fai scorrere il vetrino superiore per rimuoverlo. Tagliare il tampone di agarosio con una lama di rasoio o un coltello. Quindi pipettare 2,5 μL della coltura (fase 1.3) e mettere il coprislip sopra.
- Sigillare lo spazio tra la slitta e la vetrina con resina epossidica (vedi Tabella dei materiali). Lasciare asciugare la resina epossidica e depositare le cellule sul tampone di agarosio per almeno 1 ora a 37 °C.
3. Microscopia a fluorescenza timelapse
- Porre il campione preparato (fase 1.3) su un microscopio a fluorescenza (vedere Tabella dei materiali) in un ambiente riscaldato e mantenuto a 37 °C.
- Impostare i tempi di esposizione appropriati per la fotocamera utilizzata per l'acquisizione delle immagini. Regolare l'intensità dell'illuminazione per ridurre al minimo il fotosbiancamento.
NOTA: Per il presente studio è stato utilizzato un tempo di esposizione di 2 s per ciascuna lunghezza d'onda. - Per ogni lunghezza d'onda, trova un campo visivo (FOV) contenente fluorescenza minima. Acquisire immagini da utilizzare durante l'analisi per la sottrazione dello sfondo.
- Impostare i tempi di esposizione appropriati per la fotocamera utilizzata per l'acquisizione delle immagini. Regolare l'intensità dell'illuminazione per ridurre al minimo il fotosbiancamento.
- Impostare un protocollo per acquisire immagini in una griglia a diverse lunghezze d'onda e a intervalli di tempo regolari.
- Codifica la fotografia timelapse nel protocollo. Impostare la frequenza di acquisizione sull'intervallo di tempo desiderato (20 minuti qui) e la durata totale del timelapse sulla lunghezza desiderata (24 ore).
- Codificare le lunghezze d'onda appropriate nel protocollo (a seconda del costrutto utilizzato).
NOTA: Il picco di eccitazione di mCherry è a 587 nm e il picco di emissione a 610 nm21; mVenus è a 515 nm e 527 nm12, mentre mCerulean3 è a 433 nm e 475 nm11. - Impostare la dimensione della griglia da acquisire tra il numero desiderato di FOV.
NOTA: i dati rappresentativi mostrati qui hanno utilizzato 8 x 8 FOV.
4. Analisi delle immagini
- Eseguire la sottrazione dello sfondo su ciascun canale di colore utilizzando le rispettive immagini di sfondo acquisite nel passaggio 3.1.2. Per tutte le fasi di analisi, utilizziamo moduli standard nella piattaforma open source Fiji22 (vedi Tabella dei materiali).
- Approssimare la popolazione totale in ogni momento sospendendo il canale mCeruleo e dividendo l'area di soglia per l'area cellulare media.
- Per contare gli eventi di escissione unici, prendere la derivata temporale del canale mCerulean3. Esegui questa operazione sottraendo le immagini successive nel canale mCerulean3. Gli eventi di escissione saranno rilevati nella derivata temporale come un lampo luminoso di fluorescenza.
- Soglia la pila di eventi di escissione per eliminare la fluorescenza indesiderata. Si noti che questo processo eliminerà parti delle escissioni stesse. Per risolvere questo problema, dilatare le immagini per ripristinare le escissioni alle loro dimensioni originali.
NOTA: Analisi che utilizzano tecniche simili di soglia e analisi delle immagini possono essere eseguite anche su altri canali di fluorescenza (ad esempio, correlare gli eventi di escissione con i livelli di trasposasi TnpA [fluorescenza di Venere gialla] e TnpB [fluorescenza mCherry rossa].
- Soglia la pila di eventi di escissione per eliminare la fluorescenza indesiderata. Si noti che questo processo eliminerà parti delle escissioni stesse. Per risolvere questo problema, dilatare le immagini per ripristinare le escissioni alle loro dimensioni originali.
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Risultati
Questo metodo di visualizzazione dell'attività del trasposone nelle cellule vive mediante microscopia a fluorescenza, pur avendo un rendimento inferiore rispetto alle misurazioni di fluorescenza di massa, consente la visualizzazione diretta dell'attività del trasposone nelle singole cellule vive. Gli eventi di escissione del trasposone determinano la ricostituzione del promotore per mCerulean3 (Figura 1), consentendo l'identificazione delle cellule sottoposte ad attività di trasposone mediante fluorescenza blu brillante ...
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Discussione
Il metodo unico presentato qui per l'imaging in tempo reale dell'attività degli elementi trasponibili nelle cellule vive è un saggio sensibile in grado di rilevare direttamente la trasposizione nelle cellule vive e in tempo reale e correlare questa attività con l'espressione di proteine accessorie. Mentre il throughput è inferiore a quello che può essere ottenuto con metodi di massa, questo metodo raggiunge misurazioni dettagliate dell'attività TE e dell'espressione proteica nelle singole cellule viventi.
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il sostegno finanziario per questa ricerca è stato fornito da fondi di avvio dell'Università della California.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2 tonnellate di resina epossidica trasparente | Devcon | 31345 | |
| agarosio | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| solfato di ammonio | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Cloridrato di anidroptetraciclina | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Filtro blu cubo | Chroma | Es: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucosio | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscopio | Nikon | Fuori produzione | |
| Eppendorf epTIPS Scatole e vassoi di ricarica, Volume: da 0,1 a 10 &; L, Lunghezza: 3,4 cm, 1,33 pollici, PP (Polipropilene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Scatole e vassoi di ricarica, Volume: da 50 a 1000 &; L, Lunghezza: 7,1 cm, 2,79 pollici, PP (Polipropilene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Solfato ferroso Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji Fiji | (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Brodo, Miller (granulato) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Vetrino Coperchio Fisher | Scientific | 12-542B | |
| Kanamicina solfato | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| solfato di magnesio Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscopio Riscaldatore | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Fosfato di potassio monobasico | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III | Stage Prior | ||
| Cubo filtro rosso | Chroma Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | ||
| Zaffiro 561 LP Vetrino | 1170412 | ||
| , microscopio | Fisher Scientific | 125535B | |
| Tiamina cloridrato | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Lancio laser | Nikon | ||
| Giallo Filtro | Cubo Chroma | Es: Z514/10X, Em: ET535/30M |
Riferimenti
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