Viene delineato un protocollo per eseguire immagini in tempo reale per quantificare come la proteina accessoria TnpB influenzi la dinamica della trasposizione nelle singole cellule vive di Escherichia coli .
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Articolo metodologico
Quantificazione in tempo reale degli effetti del TnpB associato alla famiglia IS200/IS605 sull'attività di trasposone
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Qui, viene delineato un protocollo per eseguire immagini in tempo reale dell'attività degli elementi trasponibili in cellule batteriche vive utilizzando una suite di reporter fluorescenti accoppiati alla trasposizione. In particolare, dimostra come l'imaging in tempo reale possa essere utilizzato per valutare gli effetti della proteina accessoria TnpB sull'attività dell'elemento trasponibile IS608, un membro della famiglia di elementi trasponibili IS200/IS605. La famiglia IS200/IS605 di elementi trasponibili sono abbondanti elementi mobili collegati con uno degli innumerevoli geni presenti in natura, tnpB. Le omologie di sequenza propongono che la proteina TnpB possa essere un precursore evolutivo dei sistemi CRISPR/Cas9. Inoltre, TnpB ha ricevuto un rinnovato interesse, avendo dimostrato di agire come un'endonucleasi del DNA guidata da RNA simile al Cas. Gli effetti di TnpB sui tassi di trasposizione di IS608 sono quantificati ed è dimostrato che l'espressione di TnpB di IS608 si traduce in ~5 volte maggiore attività di trasposone rispetto alle cellule prive di espressione di TnpB.
Introduzione
Gli elementi trasponibili (TE) sono elementi genetici che si mobilitano all'interno dei loro genomi ospiti per escissione o copia catalizzata seguita da reintegrazione genomica. I TE esistono in tutti i domini della vita e la trasposizione ristruttura il genoma ospite, mutando le regioni codificanti e di controllo1. Ciò genera mutazioni e diversità che svolgono un ruolo importante nell'evoluzione2,3, nello sviluppo 4,5 e in diverse malattie umane6, incluso il cancro7.
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Protocollo
1. Preparazione di colture batteriche
- Coltivare E. coli ceppo MG1655 con costrutti di trasposone plasmidico (precedentemente descritti in Kim et al.8) durante la notte in LB con gli antibiotici appropriati (25 μg/mL di kanamicina, vedi Tabella dei materiali) a 37 °C.
NOTA: Le sequenze dei costrutti utilizzati e le relative sequenze sono disponibili come numeri di adesione GenBank20 OP581959, OP581957, OP581958, OP717084 e OP717085. - Per ottenere una crescita esponenziale allo stato stazionario, colture diluite ≥100 volte nel mezzo M63 (100 mM KH 2 PO 4, 1 m....
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Risultati
Questo metodo di visualizzazione dell'attività del trasposone nelle cellule vive mediante microscopia a fluorescenza, pur avendo un rendimento inferiore rispetto alle misurazioni di fluorescenza di massa, consente la visualizzazione diretta dell'attività del trasposone nelle singole cellule vive. Gli eventi di escissione del trasposone determinano la ricostituzione del promotore per mCerulean3 (Figura 1), consentendo l'identificazione delle cellule sottoposte ad attività di trasposone mediante fluorescenza blu brillante .......
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Discussione
Il metodo unico presentato qui per l'imaging in tempo reale dell'attività degli elementi trasponibili nelle cellule vive è un saggio sensibile in grado di rilevare direttamente la trasposizione nelle cellule vive e in tempo reale e correlare questa attività con l'espressione di proteine accessorie. Mentre il throughput è inferiore a quello che può essere ottenuto con metodi di massa, questo metodo raggiunge misurazioni dettagliate dell'attività TE e dell'espressione proteica nelle singole cellule viventi.
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.
Ringraziamenti
Il sostegno finanziario per questa ricerca è stato fornito da fondi di avvio dell'Università della California.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 2 tonnellate di resina epossidica trasparente | Devcon | 31345 | |
| agarosio | Sigma-Aldrich | 5066 | |
| solfato di ammonio | Sigma-Aldrich | AX1385-1 | |
| Cloridrato di anidroptetraciclina | Sigma-Aldrich | 37919 | |
| Argon Laser | Melles Griot | 35-IMA-840-015 | |
| Filtro blu cubo | Chroma | Es: Z457/10X, Em: ET485/30M | |
| D(+)Glucosio | Sigma-Aldrich | G7021 | |
| Eclipse Ti-E Microscopio | Nikon | Fuori produzione | |
| Eppendorf epTIPS Scatole e vassoi di ricarica, Volume: da 0,1 a 10 &; L, Lunghezza: 3,4 cm, 1,33 pollici, PP (Polipropilene) | Eppendorf North America Biotools | 22491504 | |
| Eppendorf epTIPS Scatole e vassoi di ricarica, Volume: da 50 a 1000 &; L, Lunghezza: 7,1 cm, 2,79 pollici, PP (Polipropilene) | Eppendorf North America Biotools | 22491555 | |
| Solfato ferroso Acs 500 g | Fisher Scientific | 706834 | |
| Fiji Fiji | (imagej.net) | ||
| Fisher BioReagents LB Brodo, Miller (granulato) | Fisher Scientific | BP9723-2 | |
| Vetrino Coperchio Fisher | Scientific | 12-542B | |
| Kanamicina solfato | Sigma-Aldrich | 1355006 | |
| solfato di magnesio Cert Ac | Fisher Scientific | XXM63SP3KG | |
| Microscopio Riscaldatore | World Precision Instruments | 96810-1 | |
| Fosfato di potassio monobasico | Fisher Scientific | 17001H | |
| ProScan III | Stage Prior | ||
| Cubo filtro rosso | Chroma Ex: ET560/40X, Em: ET645/75M | ||
| Zaffiro 561 LP Vetrino | 1170412 | ||
| , microscopio | Fisher Scientific | 125535B | |
| Tiamina cloridrato | Sigma-Aldrich (SIAL) | T1270-100G | |
| Ti-LU4 Lancio laser | Nikon | ||
| Giallo Filtro | Cubo Chroma | Es: Z514/10X, Em: ET535/30M |
Riferimenti
- Cowley, M., Oakey, R. J. Transposable elements re-wire and fine-tune the transcriptome. PLoS Genetics. 9 (1), 1003234(2013).
- Schneider, D., Lenski, R. E. Dynamics of insertion sequence elements during experimental evolution of bacteria. Research in Micro....
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Ristampe e permessi
