Sviluppo di un modello di lesione della cuffia dei rotatori di tipo cronico di coniglio per lo studio della fibrosi e della degenerazione grassa muscolare

Sommario

Questo studio descrive in dettaglio le procedure per stabilire una lesione cronica della cuffia dei rotatori di coniglio (RC). In particolare, la lesione viene creata nell'unità muscolo-tendinea/miotendinea sottoscapolare (SSC) per imitare l'anatomia e la fisiopatologia della RC umana, compresa la grave degenerazione grassa muscolare (FD). Questo protocollo può essere applicato per studiare le lesioni RC e valutare le terapie rigenerative.

Abstract

La fisiopatologia della cuffia dei rotatori (RC) del coniglio può portare a cambiamenti progressivi e altamente degenerativi nella muscolatura e nei tendini associati, che influenzano negativamente i parametri clinicamente rilevanti, come la forza e la retrazione dell'unità muscolo-tendinea/miotendinea, causando in ultima analisi la perdita della funzione della spalla e influenzando negativamente i risultati della riparazione RC. I modelli animali che imitano aspetti dell'anatomia e della fisiopatologia della RC umana sono fondamentali per far progredire la comprensione concettuale della progressione della lesione e sviluppare terapie efficaci basate sull'ingegneria tissutale e sulla medicina rigenerativa.

In questo contesto, un modello di subscapolare di coniglio (SSC) è adatto per (i) la sua somiglianza anatomica con l'unità osso-tendineo-muscolo del sovraspinato umano (SSP), che è il sito RC più frequentemente lesionato; (ii) la sua somiglianza fisiopatologica con l'uomo in termini di fibrosi e degenerazione grassa muscolare (FD); e (iii) la sua idoneità alle procedure chirurgiche. Pertanto, l'obiettivo di questo studio è quello di descrivere le tecniche chirurgiche per indurre la lesione RC SSC. In breve, la procedura prevede l'isolamento del CSS identificando il muscolo coracobrachiale seguito da una transezione a tutto spessore in corrispondenza della giunzione muscolo-tendinea e avvolgendo l'estremità libera della giunzione muscolo-tendinea con un tubo penrose a base di silicone per prevenire il riattacco spontaneo. Le valutazioni istologiche vengono eseguite per monitorare la progressione della FD muscolare a 4 settimane dall'intervento chirurgico utilizzando ematossilina ed eosina (H&E), nonché la colorazione tricromica di Masson.

La perdita di muscolo e la FD erano evidenti 4 settimane dopo la transezione della giunzione muscolo-tendinea SSC, in modo simile alle condizioni fisiopatologiche della RC umana. Questo protocollo dimostra i passaggi per stabilire con successo un modello di lesione RC SSC di coniglio di tipo cronico, che può fungere da potente strumento per studiare i cambiamenti del muscolo scheletrico associati alla fisiopatologia RC e aiutare lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche per le lacerazioni RC di tipo cronico.

Introduzione

Le lesioni croniche della cuffia dei rotatori (RC) sono caratterizzate da alterazioni degenerative della muscolatura e dei tendini, tra cui l'atrofia dei muscoli, l'accumulo di tessuto adiposo e la fibrosi, che possono compromettere l'esito della riparazione della RC e, in ultima analisi, causare dolore e disfunzione alla spalla 1,2,3,4,5 . Per comprendere meglio la patogenesi lacrimale della RC e migliorare i risultati chirurgici, è fondamentale sviluppare modelli animali appropriati in grado di imitare aspetti dell'anatomia e della fisiopatologia della RC umana. In particolare, i modelli di lesione RC dovrebbero soddisfare i seguenti criteri: (i) mancanza di guarigione spontanea dopo la lesione; (ii) contengono una significativa presenza di fibrosi, atrofia muscolare e accumulo di tessuto adiposo; e iii) essere di dimensioni adeguate per consentire l'approssimazione delle tecniche chirurgiche utilizzate nell'uomo⁶.

In questo contesto, il muscolo sottoscapolare di coniglio (SSC) può essere utilizzato come modello animale accurato e affidabile per lo studio della fisiopatologia della RC, data la sua anatomia unica, la risposta fisiopatologica e le proprietà biomeccaniche⁷. In effetti, l'anatomia della RC SSC del coniglio è simile alla RC del sovraspinato umano (SSP), che è l'unità muscolo-tendinea più spesso associata a lesioni derivanti da uso eccessivo ^8,9. In particolare, il complesso tendineo SSC del coniglio passa attraverso un tunnel osseo e sotto il muscolo coracobrachiale, che è analogo alla situazione nell'uomo in cui il complesso tendineo SSP passa attraverso il tunnel osseo subacromiale e sotto il legamento coracoacromiale⁷. Questa somiglianza anatomica fa sì che la SSC del coniglio subisca movimenti muscoloscheletrici simili a quelli della SSP umana, in cui il tendine viaggia sotto l'acromion durante l'elevazione e l'abduzione dell'omero ^7,10.

Inoltre, nel coniglio sono stati osservati cambiamenti patoistologici, simili alle lacrime umane di RC¹¹, dopo la lacerazione di SSC. In particolare, la pancia muscolare subisce una grave FD, con una significativa perdita di massa muscolare, una diminuzione dell'area della sezione trasversale delle fibre muscolari e un aumento dell'adiposità. Inoltre, Otarodifard et al. hanno valutato le caratteristiche biomeccaniche delle SSC di coniglio dopo (1) tecniche di riparazione RC a fila singola, (2) doppia fila e (3) transossei equivalenti, e hanno scoperto che le caratteristiche biomeccaniche iniziali di queste riparazioni erano simili alle riparazioni RC SSP umane eseguite in campioni cadaverici¹². In quanto tale, la somiglianza anatomica, fisiologica e biomeccanica della SSC di coniglio con la SSP umana lo rende utile per modellare le lesioni RC.

Sebbene molte specie di animali, tra cui ratti, topi, cani e pecore, siano state utilizzate nello studio della malattia RC e nella riparazione 6,13,14,15^, il grado di cronicità della lesione è una considerazione chiave. Questo perché le lacerazioni RC possono essere asintomatiche e spesso possono essere diagnosticate molto più tardi, quando la lacerazione si è allargata ed è diventata di natura cronica, con sia il tendine che il muscolo che mostrano una grave degenerazione^16,17,18. Tuttavia, la maggior parte dei modelli di riparazione RC impiega modelli di lesioni acute, in cui il tendine sano viene tranciato e quindi immediatamente riparato 19,20,21,22. Ciò si verifica in gran parte per ragioni di convenienza logistica e facilità tecnica, con il risultato di pochi studi che esaminano la fisiopatologia della RC all'interno di un ambiente di tipo cronico. Inoltre, diversi modelli animali possono possedere attributi che ne ostacolano l'uso per studi di RC cronica.

Ad esempio, sebbene il ratto sia stato ampiamente utilizzato per modellare la lacerazione e l'intervento RC, la mancanza di un significativo accumulo adiposo a seguito di una lesione contrasta con la condizione umana e le sue piccole dimensioni rendono impegnative le procedure chirurgiche ripetute²³. Inoltre, sebbene Gerber et al. abbiano utilizzato l'infraspinato delle pecore per studiare l'atrofia muscolare e la FD dopo la lacerazione cronica^{della RC 24}, esiste una certa dissomiglianza anatomica tra l'infraspinato della pecora e la SSP umana, nonché numerose sfide logistiche per lo studio e l'alloggiamento di un modello animale così grande. Inoltre, Gerber et al. hanno sviluppato un modello di lesione RC ritardata nelle pecore rilasciando la testa superficiale del muscolo infraspinato e del tendine per imitare le caratteristiche di una lacerazione cronica RC, e quindi hanno valutato l'efficacia di diverse tecniche di riparazione sul tendine a 4-6 settimane. Sfortunatamente, questo modello di pecora simile a quello cronico possedeva un limite, in quanto l'estremità del tendine rilasciato diventava indistinguibile dal tessuto cicatriziale durante la seconda procedura chirurgica²⁵.

Coleman et al. hanno anche sviluppato un modello di lacrima cronica RC nelle pecore coprendo l'estremità del tendine tranciato con una membrana sintetica al momento dell'intervento chirurgico iniziale, che ha consentito la diffusione dei nutrienti e ridotto al minimo la formazione di tessuto cicatriziale intorno al tessuto lesionato, migliorando al contempo la discriminazione tra il tendine e il tessuto cicatriziale²⁶. Nel frattempo, Turner et al. hanno suggerito che una riparazione ritardata dovrebbe essere condotta entro 4 settimane, poiché il riattacco diretto si verifica raramente in una retrazione tendinea massiccia²⁷. Insieme, questi studi hanno contribuito a protocolli riproducibili e affidabili per la creazione di un modello di lesione RC SSC di coniglio di tipo cronico.

In questo protocollo, viene stabilito un modello di lesione RC di coniglio di tipo cronico a 4 settimane, in cui i cambiamenti patologici correlati alla fibrosi e all'atrofia muscolare mediata da FD possono essere studiati tramite valutazioni istologiche. In particolare, avvolgere l'estremità libera della giunzione muscolo-tendinea utilizzando un tubo penrose a base di silicone al momento dell'intervento chirurgico iniziale consente una chiara identificazione dei tessuti RC durante la seconda procedura chirurgica e, di conseguenza, facilita una riparazione sicura per studiare la guarigione RC con e senza aumento dello scaffolding. Nel complesso, un modello di SSC di coniglio di tipo cronico può imitare meglio la fisiopatologia della RC e porre requisiti tecnici e logistici minimi.

Protocollo

Tutte le procedure devono essere eseguite con tecnica chirurgica sterile in una sala adeguatamente attrezzata e designata per gli interventi chirurgici sugli animali secondo un protocollo approvato dal comitato etico per la sperimentazione animale dell'istituto. Nel presente studio, gli interventi chirurgici sui conigli sono stati eseguiti in conformità con un protocollo approvato dal Comitato Etico per la Sperimentazione Animale dell'Università Cinese di Hong Kong.

1. Procedura chirurgica

1. Per preparare l'area chirurgica, preriscaldare un termoforo e sovrapporlo con teli chirurgici sterili per mantenere la temperatura corporea del coniglio. Successivamente, disporre gli strumenti e le forniture chirurgiche sterilizzati (come specificato nella Tabella dei materiali) e organizzarli in base alle preferenze del chirurgo.
2. Indurre l'anestesia tramite somministrazione intramuscolare di 35 mg/kg di ketamina e 5 mg/kg di xilazina a conigli bianchi neozelandesi (di peso compreso tra 3,5 e 4,5 kg, circa 5-6,5 mesi di età; in questo studio sono stati utilizzati due conigli maschi e una femmina). Successivamente, confermare l'anestesia con un test di pizzicamento della zampa e/o della coda.
3. Se è necessaria un'anestesia aggiuntiva per sostenere il piano chirurgico, somministrare 10 mg/kg di ketamina e 3 mg/kg di xilazina per via endovenosa attraverso la vena dell'orecchio marginale²⁸ e monitorare la frequenza respiratoria dell'animale a intervalli regolari di 5-10 minuti.
4. Per preparare la finestra chirurgica, radere il sito di incisione previsto (la regione cutanea superficiale all'unità muscolo-tendinea SSC) e pulire con tre applicazioni alternate di betadine e alcol al 70%. Usa un batuffolo di cotone per applicare betadine e alcol al 70% con movimenti circolari (dall'interno verso l'esterno). Usa un unguento per gli occhi per mantenere gli occhi del coniglio umidi e lubrificati. Somministrare 20 mg/kg di cefalexina per via intramuscolare come agente antinfettivo.
5. Praticare un'incisione cutanea di 3-4 cm al di sotto della clavicola, dividere l'intervallo deltopettorale utilizzando un bisturi chirurgico n. 11 e ritrarre per accedere alla spalla (Figura 1A,B).
6. Per localizzare l'unità muscolo-tendinea SSC, per prima cosa, identificare il muscolo coracobrachiale (come tessuto che copre l'attacco del tendine SSC) e dividerlo. Successivamente, identificare il tendine SSC e inserire un morsetto ad angolo retto per esporre l'intero tendine SSC alla sua inserzione sulla tuberosità minore dell'omero (Figura 1C).
7. Prima di introdurre la lesione, isolare il muscolo-tendine del CSS (Figura 1D) e somministrare un anestetico intraoperatorio (0,2 mg/kg di bupivacaina allo 0,5%) localmente vicino al sito di transezione. Avvolgere l'unità muscolo-tendinea SSC in un tubo penrose a base di silicone (Figura 1E) per evitare attacchi indesiderati ai tessuti circostanti e favorire il successivo recupero dei tessuti.
8. Per indurre una lesione, creare una transezione a tutto spessore in corrispondenza della giunzione muscolo-tendinea utilizzando un bisturi chirurgico n. 11 (Figura 1F). Se necessario, fermare l'emorragia esercitando pressione con un pezzo di garza e utilizzare soluzione fisiologica per irrigare la ferita secondo necessità.
9. Per chiudere la ferita, utilizzare una sutura 4-0 a base di acido poliglicolico (PGA) per riapprossimare il tessuto muscolare deltoide (Figura 1G) e una sutura in nylon 4-0 per chiudere la ferita cutanea (Figura 1H).
10. Somministrare assistenza post-operatoria attraverso la somministrazione sottocutanea di 0,03 mg/kg di buprenorfina come analgesico (una volta immediatamente dopo l'intervento chirurgico e due volte al giorno per le successive 48 ore^{e 29}).
11. Lasciare che i conigli si riprendano su un termoforo coperto e applicare un collare morbido per prevenire comportamenti indesiderati, tra cui l'automutilazione, il leccamento dei siti chirurgici e la rimozione dei punti di sutura (Figura 1I).
12. Monitora gli animali per verificare la presenza di cambiamenti di peso e comportamentali. Segnalare al veterinario qualsiasi diminuzione di oltre il 10% del peso corporeo e un forte dolore che non può essere controllato (valutato in base a cinque azioni comportamentali: restringimento orbitale, appiattimento delle guance, cambiamenti di forma delle narici, cambiamenti di posizione dei baffi e cambiamenti di forma e posizione dell'orecchio) per determinare se è necessario un intervento come l'eutanasia precoce.

2. Raccolta dell'esemplare

1. Sopprimere i conigli a 4 settimane dal momento dell'infortunio. Anestetizzare i conigli e somministrare una dose letale di pentobarbital di sodio (più di 60 mg/kg). Confermare la morte per toracotomia.
2. Identificare la testa omerale e asportarla chirurgicamente, preservando i tubercoli maggiori e minori e tutti gli attacchi dei tessuti molli. Fissare con paraformaldeide (PFA) al 4% per 72 ore a 4 °C prima di trasferire in una soluzione di acido etilendiamminotetraacetico al 10% (EDTA) per 1 mese a temperatura ambiente (con cambio di terreno ogni 72 ore) per decalcificare l'osso.
3. Dopo la decalcificazione, sottoporre i campioni a un trattamento istologico standard utilizzando la disidratazione graduata dell'etanolo, l'inclusione della paraffina, il sezionamento istologico (sezioni da 8 μm) e la colorazione con ematossilina ed eosina (H&E) e le soluzioni tricromiche 30,31,32 di Masson.
4. Cattura immagini con un microscopio verticale con un ingrandimento di 10x.
5. Eseguire la semi-quantificazione delle immagini tricromiche di H&E e Masson misurando l'area e la percentuale di muscolo, tessuto fibroso e grasso all'interno del muscolo, come descritto in precedenza^33,34 utilizzando un software di progettazione grafica a scelta. In questo esempio viene utilizzato il software Adobe Photoshop (https://www.adobe.com).
   1. Seleziona una regione di un particolare colore che rappresenta un determinato tipo di tessuto utilizzando lo strumento bacchetta magica (il rosso è il tessuto muscolare, il blu è la fibrosi e il bianco rappresenta il grasso).
   2. Fare clic sulle voci di menu Seleziona | Inverso | Salva selezione | Assegna un nome alla sezione.
   3. Contare il numero di pixel all'interno dell'area contrassegnata facendo clic sulle voci di menu Finestra | Registro delle misurazioni | Registra misurazione per registrare questi valori di pixel e calcolare manualmente la percentuale dei tipi di tessuto selezionati.

3. Analisi statistica

1. Per i dati istologici, eseguire l'analisi statistica utilizzando il software analitico prescelto. Eseguire un test t di Student per il confronto di due campioni indipendenti tra il gruppo di controllo e quello ferito.
2. Esprimere i dati come media ± errore standard della media. Si consideri un valore p di <0,05 come statisticamente significativo.

Risultati

Per valutare la cronicità della patologia RC a seguito della transezione delle unità muscolo-tendinee SSC, la morfologia complessiva del tessuto e i cambiamenti cellulari sono stati caratterizzati tramite valutazione macroscopica e analisi istologica (H&E e colorazione tricromica di Masson, rispettivamente), a 4 settimane dopo l'infortunio (Figura 2, Figura 3 e Figura 4). Le immagini rappresentative della morfologia del tessuto macroscopico hanno mostrato la comparsa di tessuto adiposo bianco nei muscoli SSC lesionati, che era assente nel gruppo di controllo (Figura 2). La colorazione H&E ha confermato la perdita di cellularità e organizzazione muscolare, che è stata sostituita da un gran numero di adipociti (spazi vuoti circondati da sottili bordi di citoplasma che contenevano nuclei compressi) nei muscoli SSC danneggiati rispetto al gruppo di controllo (Figura 3A).

La valutazione semiquantitativa delle immagini H&E ha mostrato un alto grado di adipociti intramuscolari presenti nei muscoli SSC danneggiati (36,5% ± 8,5%) rispetto al gruppo di controllo (0,69% ± 0,18%) (Figura 3B). La colorazione tricromica di Masson ha anche confermato l'atrofia muscolare e la disposizione disorganizzata delle fibre di collagene nei muscoli SSC feriti rispetto al gruppo di controllo (Figura 4A). La valutazione semiquantitativa delle immagini tricromiche di Masson ha mostrato una riduzione della cellularità muscolare per i muscoli SSC infortunati (41,3% ± 2,6%) rispetto al gruppo di controllo (99,2% ± 0,16%) (Figura 4B). Sebbene un'ulteriore valutazione semiquantitativa non abbia mostrato alcuna differenza significativa per la formazione di tessuto fibrotico tra i muscoli SSC danneggiati (22,3% ± 13,1%) e il gruppo di controllo (0,07% ± 0,05%), è stato osservato un alto grado di fibrosi nei muscoli SSC feriti (Figura 4C). Insieme, la morfologia del tessuto macroscopico e l'analisi istologica hanno mostrato che il muscolo-tendine SSC del coniglio ferito ha mostrato una grave atrofia muscolare, accumulo di grasso e fibrosi, che sono noti segni distintivi della fisiopatologia cronica della RC.

Figura 1: Procedura chirurgica per modello di lesione muscolo-tendinea SSC di tipo cronico. (A) È stata creata una finestra chirurgica e i punti di riferimento anatomici come l'omero, la testa omerale e la clavicola sono stati identificati mediante palpazione. (B) Un'incisione cutanea di 3,0 cm è stata praticata al di sotto della clavicola. (C) Il muscolo coracobrachiale è stato diviso per esporre il muscolo SSC. (D) L'unità muscolo-tendinea SSC è stata isolata. (E) Un drenaggio di penrose a base di silicone è stato utilizzato per avvolgere il tessuto muscolo-tendineo SSC. (F) Il muscolo-tendine SSC è stato sezionato. (G) Il muscolo coracobrachiale è stato riapprossimato utilizzando suture PGA. (H) L'incisione cutanea è stata chiusa con punti di sutura in nylon. (I) Dopo l'intervento chirurgico, ai conigli è stato dato un collare morbido da indossare. Abbreviazioni: SSC = sottoscapolare; PGA = acido poliglicolico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 2: Morfologia grossolana dei muscoli SSC rappresentativi. Le frecce nere rappresentano i tessuti adiposi bianchi. Abbreviazione: SSC = sottoscapolare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Analisi istologica del modello di lesione RC di tipo cronico a 4 settimane. (A) Le immagini istologiche rappresentative colorate con H&E hanno mostrato fibre muscolari atrofiche e accumulo di adipociti. (B) Quantificazione della percentuale di accumulo di grasso muscolare lesionato. n = 3 conigli. Le barre di errore indicano SEM. *, statisticamente significativo (p≤ 0,05). Barre della scala = 5.000 μm (A, colonna di sinistra), 600 μm (A, colonna di destra). Abbreviazioni: SSC = sottoscapolare; RC = cuffia dei rotatori; H&E = ematossilina ed eosina. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Analisi istologica del modello di lesione RC di tipo cronico a 4 settimane. (A) Le immagini colorate in tricromia di Masson mostravano una fibrosi sostanziale. Il tessuto connettivo fibroso è colorato di blu. (B) Quantificazione della proporzione di muscolo e (C) tessuto fibrotico. n = 3 conigli. Le barre di errore indicano SEM. *, statisticamente significativo (p≤ 0,05). Barre della scala = 5.000 μm (A, colonna di sinistra), 200 μm (A, colonna di destra). Abbreviazioni: SSC = sottoscapolare; RC = cuffia dei rotatori. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Un modello animale riproducibile e fisiologicamente rilevante fornisce la capacità di far progredire la comprensione della patogenesi della malattia, valutare gli esiti delle terapie cliniche e migliorare e sviluppare ulteriormente i trattamenti chirurgici³⁵. In questo studio, è stato stabilito un modello SSC di coniglio affidabile e accurato che imita aspetti dell'anatomia e della fisiopatologia umana della RC. Le lacerazioni RC sono correlate a cambiamenti degenerativi muscolari progressivi e probabilmente irreversibili, con conseguente riduzione del potenziale di guarigione. Ad esempio, Ko et al. hanno dimostrato che il riattacco della SSP di coniglio a 6 settimane non ha invertito l'atrofia muscolare o la FD nelle 6 settimane successive. Tale atrofia muscolare mediata da FD influenza diversi importanti parametri clinici, tra cui la forza tendinea-muscolare e il range di movimento articolare, che possono influenzare gli esiti chirurgici^36,37.

Il protocollo qui stabilito ha mostrato significativi attributi di tipo cronico dopo la transezione delle unità muscolo-tendinee SSC. In particolare, questi cambiamenti includono una visibilmente diminuzione della massa muscolare e un aumento del contenuto adiposo e del tessuto fibrotico (Figura 2, Figura 3 e Figura 4). Questi risultati sono coerenti con i cambiamenti degenerativi riportati nelle lacrime umane^{di RC 38}. Negli ultimi anni, il ratto è emerso come uno dei modelli animali più intensamente studiati per la malattia e la lesione RC a causa delle sue elevate somiglianze anatomiche con SSP sia umane che di ratto che viaggiano sotto l'acromion^38,39,40. Tuttavia, va notato che la porzione di SSP di ratto che passa sotto l'arco acromiale è muscolare anziché tendinea, come nel caso dell'uomo⁴¹. Ancora più importante, Barton et al. hanno riconosciuto una mancanza di accumulo di grasso significativo dopo il distacco del tendine SSP nei ratti²³, che è in contrasto con la condizione umana⁴². In quanto tale, si ritiene che il complesso SSC del coniglio possa fornire un modello appropriato per imitare la lacerazione cronica RC degli esseri umani.

Per garantire la riproducibilità di questo modello, vale la pena notare due punti durante l'esecuzione di questo protocollo. In primo luogo, dopo la transezione delle unità muscolo-tendinee, l'estremità libera del tendine tranciato può essere a rischio di formare aderenze, che possono rendere difficile il recupero del tendine per le manipolazioni successive. Per evitare questo problema, è stato utilizzato un tubo in silicone non riassorbibile per avvolgere l'estremità libera della giunzione muscolo-tendinea dopo la transezione per evitare l'adesione spontanea ai tessuti circostanti e la guarigione spontanea (Figura 1E). Inoltre, l'unità muscolo-tendinea tranciata durante una seconda procedura di intervento (cioè, per eseguire una riparazione sicura; dati non mostrati) può essere chiaramente identificata avvolgendo l'estremità dei tessuti danneggiati al momento dell'intervento chirurgico iniziale. Questa tecnica è economica, efficace e può essere facilmente implementata in chirurgia⁴³. In secondo luogo, i conigli sono una specie altamente sensibile che può mostrare un comportamento dannoso dopo l'intervento chirurgico. Per evitare tali problemi, si consiglia vivamente di applicare anche un collare morbido per prevenire comportamenti indesiderati, tra cui l'automutilazione, il leccamento dei siti chirurgici e la rimozione dei punti di sutura (Figura 1I). Rispetto ai collari elettronici convenzionali in commercio realizzati in plastica rigida, il collare morbido autocostruito non ha causato lesioni cutanee o altri effetti collaterali che hanno influito sul benessere degli animali o sulla qualità dell'indagine scientifica. Insieme, questi passaggi sono fondamentali per creare un modello di lesione RC del coniglio accuratamente riproducibile e fornire la possibilità di studiare le strategie di riparazione rigenerativa.

Per studiare la fisiopatologia e la guarigione dei tendini in un modello animale, è necessario creare una lesione distinta e riproducibile e i punti temporali di studio devono essere accuratamente selezionati. La stragrande maggioranza degli studi sulle lesioni tendinee e sulla guarigione sono stati eseguiti su tendini animali completamente transiti⁴⁴, poiché la transezione è una procedura semplice che è altamente riproducibile e può simulare adeguatamente lo scenario clinico^45,46. Huegel et al. hanno dimostrato che la lesione di un tendine parzialmente tranciato era meno grave di quella di un tendine completamente tranciato e l'immobilizzazione ha avuto un effetto dannoso sulla meccanica del tendine, incluso un aumento della rigidità articolare⁴⁷. Per valutare l'atrofia e la FD che si osservano nel contesto di una lacrima massiva di RC, è essenziale definire i punti temporali caratteristici osservati sperimentalmente. Gupta et al. hanno validato un modello di lesione RC nel coniglio maschio e hanno osservato atrofia muscolare a 2 e 6 settimane, con un aumento del contenuto di grassi in punti temporali successivi (meno del 5% di contenuto di grassi a 2 settimane rispetto a più del 10% di contenuto di grassi a 6 settimane), coerente con il processo patologico osservato nelle lacrime di RC umane¹¹. In questo studio, è stata creata una massiccia lacerazione RC mediante transezione dell'unità muscolo-tendinea SSC in conigli maschi e femmine per 4 settimane, che ha portato a FD muscolare SSC (contenuto di grassi del 36,5%). Pertanto, un punto temporale di 4 settimane è appropriato per generare FD del muscolo SSC nei conigli bianchi neozelandesi maschi e femmine.

Esistono diverse limitazioni a questo studio. Questi includono: (i) passaggi associati alla generazione di modelli animali, come un punto temporale relativamente breve e materiali potenzialmente infiammatori (tubi penrose a base di silicone) per la generazione di lesioni di tipo cronico; (ii) caratterizzazione e analisi di modelli animali, come la mancanza di analisi del cammino e di elettromiografia per valutare la cinematica articolare e la generazione della forza contrattile muscolare; e (iii) confronto con modelli animali, come la mancanza di confronto con altri siti di lesione RC.

In termini di generazione del modello, le lesioni RC umane comportano tipicamente atrofia progressiva e FD che possono verificarsi nell'arco di diversi anni, che è relativamente più lungo del punto temporale di 4 settimane riportato qui. Questo è ritenuto accettabile, poiché un modello animale che genera circa il 36,5% di grasso intramuscolare in un lasso di tempo relativamente breve sarà logisticamente conveniente e può essere prolungato se ritenuto necessario. Inoltre, la biocompatibilità degli impianti a base di silicone, come i tubi penrose, è stata fonte di controversie di lunga data a causa di segnalazioni di risposta immunitaria cellulare e infiammazione⁴⁷; pertanto, un materiale inerte alternativo, come il glicole polietilenico (PEG), può essere sostituito per avvolgere il tendine resecato se si perseguono studi RC associati all'infiammazione.

In termini di caratterizzazione e analisi dei modelli animali, la mancanza di analisi del cammino⁴⁹ e di studi elettromiografici⁵⁰ può limitare i risultati dello studio a dati istologici qualitativi. Questi aspetti possono essere affrontati in studi futuri utilizzando l'analisi del movimento video⁵¹ e l'elettromiografia di superficie⁵⁰ per generare dati quantitativi sulla cinematica della spalla e sulle prestazioni muscolari RC.

In termini di confronto dei modelli, poiché anche i tendini SSP e infraspinato nei conigli sono stati ampiamente utilizzati per gli studi RC, il confronto della gravità della lesione, inclusa la FD tra questi diversi siti di lesione in futuro, identificherà ulteriori siti per l'ottimizzazione del modello.

In sintesi, questo studio ha sviluppato un protocollo per modellare lesioni RC di tipo cronico in conigli maschi e femmine. Questo modello è conveniente per i ricercatori grazie alla sua semplicità (transezione) e al periodo relativamente breve per indurre la cronicità (4 settimane) generando un ampio grado (36,5%) di FD intramuscolare. In quanto tale, questo protocollo dovrebbe aiutare i ricercatori nello studio della fisiopatologia RC, oltre a facilitare lo sviluppo di nuove terapie per la riparazione e la rigenerazione muscolo-tendinea.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Strumenti chirurgici
4-0 Acido poliglicolico (PGA)	e-Suture	GBK884
Pinze Adson dentate	Taobao, Cina
Forbici fini	Taobao, Cina
Pinze emostatiche	Taobao, Cina
Portaaghi	Taobao, Cina
Bisturi chirurgico con manico	Taobao, Cina		Sutura a lama n. 11 (
4-0 Nylon)	Taobao, Cina	19054	Per la chiusura della pelle sono accettabili suture in nylon o seta. Ogni sutura ha i suoi vantaggi e svantaggi e si consiglia agli utenti di sceglierne una in base alle proprie preferenze.
Accessori chirurgici
Batuffoli di cotone	Taobao, Cina
Garza	Taobao, Cina
Rasoio	Taobao, Cina
Cuscinetto riscaldante chirurgico	Taobao, Cina
Lampada
Siringa con aghi	Taobao, Cina		1 mL, 5 mL, 10 mL
Drugs
Buprenorphine	LASEC, CUHK		0,12 mg/kg
Bupivacaina	Sigma-Aldrich	b5274-5g	1-2 mg/kg
Cephalexin	Santa Cruz Biotechnology	sc-487556	20 mg/kg
Ketamina	LASEC, CUHK		35 mg/kg
Pentobarbital di sodio	LASEC, CUHK		superiore a 60 mg/kg
Xilazina	LASEC, CUHK		5 mg/kg
Equipment
Nikon Ni-U Eclipse Upright Microscope	Nikon Instruments Inc, USA
strong>Software
Adobe Photoshop 20.01	Adobe Inc, USA
strong>Altri reagenti
Betadine	Taobao, Cina		5%
Etanolo	Taobao, Cina		70%
Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA)	Sigma-Aldrich	EDS-1KG	10%
Paraformaldeide (PFA)	Microscopia elettronica	Scienze 15713	4%
Silicone tubo	Easy Thru, Cina
Soluzione salina	Taobao, China
Reagenti per colorazione istologica
Eosiin Soluzione	Sigma-Aldrich	R03040	acquosa di
ematossilina	Sigma-Aldrich	HHS32
Trichrome Stain ( Masson)  Kit	Sigma-Aldrich	HT15