Articolo metodologico

Sistema di rilevamento del virus del DNA basato su RPA-CRISPR/Cas12a-SPM e Deep Learning

DOI:

10.3791/64833

⸱

10 maggio 2024

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Precision Medicine and Healthcare, Tsinghua-Berkeley Shenzhen Institute, 2Institute of Biopharmaceutics and Health Engineering, Tsinghua Shenzhen International Graduate School

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Presentiamo un protocollo che combina l'amplificazione della polimerasi ricombinasi con un sistema CRISPR/Cas12a per il rilevamento di tracce di virus a DNA e costruisce una microscopia portatile per smartphone con una classificazione assistita dall'intelligenza artificiale per il rilevamento di virus a DNA point-of-care.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Segnaliamo un sistema di rilevamento del DNA virus veloce, facile da implementare, altamente sensibile, specifico per la sequenza e point-of-care (POC), che combina l'amplificazione della ricombinasi polimerasi (RPA) e il sistema CRISPR/Cas12a per il rilevamento di tracce di virus a DNA. Il DNA bersaglio viene amplificato e riconosciuto separatamente da RPA e CRISPR/Cas12a, che innesca l'attività di scissione collaterale di Cas12a che slega un reporter di DNA marcato con fluoroforo e generalizza la fluorescenza. Per il rilevamento POC, la microscopia portatile per smartphone è progettata per acquisire immagini fluorescenti. Inoltre, all'interno del sistema vengono implementati modelli di deep learning per la classificazione binaria di campioni positivi o negativi, ottenendo un'elevata precisione. Il virus della rana 3 (FV3, generi Ranavirus, famiglia Iridoviridae) è stato testato come esempio per questo sistema di rilevamento POC del virus a DNA e i limiti di rilevamento (LoD) possono raggiungere 10 aM entro 40 minuti. Senza operatori qualificati e strumenti ingombranti, l'RPA-CRISPR/Cas12a-SPM portatile e miniaturizzato con classificazione assistita dall'intelligenza artificiale (AI) mostra un grande potenziale per il rilevamento del virus POC DNA e può aiutare a prevenire la diffusione di tali virus.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Negli ultimi anni si sono verificate frequentemente epidemie di malattie infettive causate da diversi virus, tra cui l'epidemia di malattia da virus Ebola (EVD) nel 20141 e nel 20182, la sindrome respiratoria del Medio Oriente (MERS) nel 20153, l'epidemia di malattia da virus Zika nel 20154, la malattia da coronavirus 2019 (COVID-19) causata dalla sindrome respiratoria acuta grave coronavirus 2 (SARS-CoV-2)5 e il continuo vaiolo delle scimmie causato dal virus del vaiolo delle scimmie (MKPV) nel 20226. Questi improvvisi focolai di malattie infettive epidemiche causano un gran numero di morti e portano enormi perdite economiche e disordini sociali. È urgentemente necessario un sistema di rilevamento rapido e accurato per diagnosticare rapidamente l'infezione e prevenire l'ulteriore diffusione del virus.

Recentemente, le brevi ripetizioni palindromiche (CRISPR) e le proteine associate a CRISPR (Cas) hanno guadagnato l'attenzione di tutto il mondo e hanno mostrato risultati promettenti nella rilevazione degli acidi nucleici 7,8,9,10,11,12,13,14,15 . La proteina CRISPR/Cas12a, guidata dall'RNA CRISPR (crRNA), si lega e scinde il DNA bersaglio. Questa attività porta al rilascio di DNA a filamento singolo (ssDNA) aspecifico, noto come trans-scissione, e può essere utilizzata per migliorare il segnale di rilevamento per il rilevamento dell'acido nucleico. Alcuni metodi di rilevamento tradizionali come la reazione a catena della polimerasi (PCR), la PCR quantitativa in tempo reale (qPCR) e il saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA) sono complicati, dispendiosi in termini di tempo e costosi per il rilevamento point-of-care (POC). Il nostro lavoro precedente ha sviluppato con successo un sistema di rilevamento automatizzato, integrato ed economico per il virus della peste suina africana (ASFV) basato sulla tecnologia CRISPR/Cas12a. In questo sistema, abbiamo raggiunto un limite di rilevamento di 1 pM in un intervallo di tempo di 2 ore senza la necessità di amplificazione. Il sistema CRISPR/Cas12a e l'amplificazione della polimerasi ricombinasi (RPA) sono combinati per migliorare la sensibilità e la specificità per il rilevamento di tracce di DNA. Rispetto ad altre tecniche di amplificazione isotermica, l'RPA è semplice nel design e conveniente nel funzionamento poiché ha un tempo di reazione più breve senza sofisticate apparecchiature di controllo della temperatura.

Per il rilevamento POC di agenti patogeni, vengono sviluppati strumenti come la microscopia per smartphone (SPM), il fluorimetro portatile o le strisce a flusso laterale per le letture dei risultati 16,17,18. SPM cattura le immagini attraverso una fotocamera e le carica su alcune applicazioni mobili per una rapida analisi dei dati. Tale microscopia rende un sistema di acquisizione del segnale portatile, economico e miniaturizzato con un'elevata sensibilità e ha mostrato vantaggi nel rilevare agenti patogeni come H5N1, il virus Zika e SARS-CoV-219,20. Pertanto, costruiamo un SPM portatile per catturare i segnali di fluorescenza innescati dal rilevamento RPA-CRISPR/Cas12a del virus a DNA bersaglio. La sonda reporter ssDNA che collega un fluoroforo e un quencher verrà tagliata quando CRISPR/Cas12a riconosce il virus a DNA bersaglio e la fluorescenza emessa dal fluoroforo può essere catturata da SPM.

Rispetto al software professionale solitamente utilizzato per ottenere le informazioni sui risultati dalle immagini a fluorescenza di SPM21, alcuni esperti utilizzano l'apprendimento automatico e l'apprendimento profondo per quantificare le concentrazioni di DNA virale dopo aver ottenuto immagini a fluorescenza22, il che richiede più tempo. Quando si tratta di classificare le immagini mediche, le reti neurali convenzionali (CNN) vengono spesso utilizzate per apprendere le caratteristiche dalle immagini pixelate grezze in modo end-to-end 23,24,25,26. I popolari modelli di deep learning basati su CNN come AlexNet, DenseNet-121 ed EfficientNet-B7 sono stati applicati con successo in questo campo27,28. Tuttavia, ottenere grandi set di dati in domini specifici può essere impegnativo, richiedendo l'apprendimento del trasferimento29,30. Questo approccio esegue il pre-training di un modello di deep learning con un set di dati di grandi dimensioni e il modello pre-addestrato viene utilizzato come punto di partenza per una nuova attività con un set di dati di piccole dimensioni. Questa tecnica può ridurre la necessità di grandi set di dati, combattere l'overfitting e ridurre i tempi di addestramento31. In questo caso, utilizziamo modelli di deep learning con transfer learning per la classificazione binaria delle immagini di fluorescenza dei campioni positivi e negativi.

In questo metodo, combiniamo RPA e il sistema CRISPR/Cas12a per il rilevamento di tracce di virus a DNA. Il DNA bersaglio viene amplificato e riconosciuto separatamente da RPA e CRISPR/Cas12a, che innesca l'attività di scissione collaterale di Cas12a che slega un reporter di DNA marcato con fluoroforo e generalizza la fluorescenza. Costruiamo un SPM portatile per acquisire le immagini fluorescenti per il rilevamento POC e sviluppiamo modelli di deep learning per la classificazione binaria. Lo schema del sistema di rilevamento POC integrato è mostrato nella Figura 1. Senza operatori qualificati e strumenti ingombranti, l'RPA-CRISPR/Cas12a-SPM con classificazione assistita dall'intelligenza artificiale (AI) mostra un grande potenziale per il rilevamento del virus POC DNA.

figure-introduction-1
Figura 1: Lo schema del sistema di rilevamento RPA-CRISPR/Cas12-SPM insieme alla classificazione AI per le immagini raccolte. Gli acidi nucleici dei campioni di origine animale vengono rilasciati da PINDBK. Il DNA bersaglio del virus viene amplificato e riconosciuto in modo specifico dal sistema RPA-CRISPR/Cas12a. CRISPR/Cas12a si lega al crRNA e il complesso Cas12a-crRNA si lega al DNA bersaglio, che innesca la scissione collaterale di CRISPR/Cas12a sulle sonde reporter ssDNA. Il fluoroforo sul reporter viene rilasciato e la fluorescenza viene rilevata da un lettore di piastre commercializzato o dall'SPM che costruiamo. Per classificare le immagini a fluorescenza vengono utilizzati tre diversi modelli di deep learning, tra cui AlexNet, DenseNet-121 ed EfficientNet-B7 con transfer learning. Questa figura è riutilizzata con il permesso di Lei et al.35. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocollo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Trattamento dei campioni

  1. Prendiamo il Frog Virus 3 (FV3, generi Ranavirus, famiglia Iridoviridae), un virus a DNA a doppio filamento. Selezionare il gene del capside maggiore (mcp) come bersaglio per la rilevazione di FV3 poiché è altamente conservato e solitamente considerato come bersaglio per la rilevazione del ranavirus. La sequenza di destinazione selezionata è mostrata nella Tabella 1.
    NOTA: Frog Virus 3 è preso come esempio in questo protocollo.
  2. Per la preparazione dei frammenti di DNA bersaglio, utilizzare frammenti di DNA del gene mcp di FV3 e del virus della necrosi renale e della milza infettiva (ISKNV, un altro Ranavirus).
    NOTA: In questo studio, i frammenti di DNA bersaglio sono stati ottenuti commercialmente da una società elencata nella Tabella dei materiali. Sono considerati l'obiettivo e il controllo del rilevamento successivo.
NomeSequenza
Centralina multifunzione FV3NTS: 5' ... gtaacccggctttcGGGCAGCAGTTTCGGTCGGCGTtcccaggtcgg... 3' (240 pb)
TS: 5' ... ccgacctgggaACGCCGACCGAAACTGCTGCCCtgctgcccgaaagc... 3' (240 pb)
ISKNV MCPNTS: 5' ... ggccatgccaatttTGGGCAGGAGTTTAGTGTGACGgtggcgaggg... 3' (231 pb)
TS: 5' ... ccctcgccaccgtcACACTAAACTCCTGCCCAAAATtggcatggcc... 3' (231 pb)

Tabella 1: sequenza target selezionata in questo metodo.

2. Reazione RPA

  1. Progettare e sintetizzare le coppie di primer RPA per la sequenza target. Le sequenze di coppie di primer RPA sono descritte nella Tabella 2.
  2. Preparare il tampone di reazione RPA 5x (Tabella 3) e MgCl2 (100 mM).
  3. Mescolare i quattro enzimi RPA chiave (UvsX, UvsY, GP32, proteina Bsu) nel tampone di reazione RPA 1x, insieme ai primer progettati in anticipo, come dettagliato nella Tabella 4.
  4. Agitare accuratamente la miscela.
  5. Aggiungere 1 μL del bersaglio ottenuto dalla fase 1 per ogni reazione RPA e mescolarlo accuratamente a vortice di nuovo.
  6. Aggiungere 7 μL di MgCl2 (100 mM) per avviare la reazione. Il volume finale di ciascuna reazione RPA è di 50 μL.
  7. Eseguire il test a 37 °C per 30 min.
  8. Il prodotto RPA può essere conservato a 4 °C per alcuni giorni. Man mano che i prodotti RPA si degradano, utilizzarli per ulteriori rilevamenti il prima possibile per ottenere risultati di diagnosi migliori.
  9. [Facoltativo] Condurre l'elettroforesi su gel di DNA.
    1. Estrarre 5 μL di prodotti RPA, aggiungere un volume appropriato di tampone di caricamento del DNA 6x ed eseguire l'elettroforesi su gel di DNA nel tampone EDTA (TAE) di acetato di tris.
    2. Eseguire l'elettroforesi a 120 V per circa 20 minuti fino a quando le bande del tampone di caricamento raggiungono il fondo del gel.
    3. Determinare se la sequenza target viene amplificata con successo dal campione confrontando la dimensione delle bande del campione con le bande del marcatore.
NomeSequenza
RPA primer FATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
RPA primer RGGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG

Tabella 2: Primer RPA utilizzati in questo metodo.

ComponenteConcentrazione originaleAddizione
PESO 20.000-114 mg
ATP100 mM125 μL
dNTP25 mM48 μl
Tris-HCl1 M125 μL
DTT1 M125 μL
Creatinfosfato1 M250 μl
Creatinchinasi10 μg/μL50 μl
ddH2O-277 μl
Volume totale-1 ml

Tabella 3: La composizione del tampone di reazione RPA 5x (pH 7,5).

ComponenteConcentrazione originaleAddizione
5x tampone di reazione RPA-10 μl
Proteina UvsX5 mg/ml2,6 μl
Proteina UvsY5 mg/ml0,9 μl
Proteina GP325 mg/ml2,54 μL
Proteina Bsu5 mg/ml0,88 μl
Primer in avanti100 μM0,25 μl
primer invertito100 μM0,25 μl
ddH2O-24,58 μL
Bersaglio-1 μl
*MgCl2100 mM7 μl
Volume totale50 μl
*MgCl2 deve essere aggiunto per ultimo per avviare la reazione RPA.

Tabella 4: La composizione della reazione RPA.

3. Rilevamento CRISPR/Cas12a senza SPM

  1. Utilizzare i crRNA (Table of Materials) della sequenza target e la sonda reporter ssDNA che collega un fluoroforo e un quencher per CRISPR/Cas12a. Qui, la carbossi-tetrametilrodamina (TAMRA) è legata come fluoroforo alle estremità 5' delle sonde reporter ssDNA e Black Hole Quencher-2 (BHQ2) come quencher alle estremità 3'. La sequenza dettagliata del crRNA e del reporter ssDNA è descritta nella Tabella 5.
  2. Preparare la proteina del batterio delle Lachnospiraceae Cas12a (LbCas12a) con 10 tamponi di reazione CRISPR/Cas12a.
  3. Sciogliere 1 μL di prodotto di reazione RPA dalla sezione 2 in 1 tampone di reazione CRISPR/Cas12a con complessi LbCas12a-crRNA e sonda reporter ssDNA da 500 nM in un volume di reazione di 100 μL.
  4. Dopo aver mescolato LbCas12a e crRNA, lasciare riposare la miscela per almeno 5 minuti per formare un complesso funzionale. Dopo l'incubazione, aggiungere altri componenti alla miscela di reazione ed eseguire l'intera reazione a 37 °C. Il volume finale di ciascuna reazione CRISPR/Cas12a è di 100 μl. Le concentrazioni dettagliate di ciascun componente in ciascuna reazione CRISPR/Cas12a sono descritte nella Tabella 6.
  5. Eseguire la reazione di rilevamento CRISPR/Cas12a da 100 μl a 37 °C per 30 min.
  6. Esaminare costantemente i segnali di fluorescenza da un lettore di micropiastre a una lunghezza d'onda di eccitazione di 535 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 595 nm con un guadagno di 60.
    NOTA: Il rilevamento di diverse lunghezze d'onda della luce di eccitazione ed emissione dipende dalla scelta del fluoroforo e del quencher nelle sonde reporter ssDNA precedentemente progettate.
  7. Per questi dati raccolti, dividere il valore di controllo per la misurazione dei campioni positivi per normalizzare tutti i dati, quindi integrarli per un'analisi t-test a due campioni.
NomeSequenza
LbCas12a crRNA per FV3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGGGCGT
Reporter ssDNA/5TAMRA/TTATT/3BHQ2

Tabella 5: Sequenze di crRNA CRISPR/Cas12a e reporter ssDNA utilizzate in questo metodo.

ComponenteConcentrazione originaleAddizione
NEBuffer r2.1-10 μl
Lba Cas12a (CPF1)10 μM0,5 μl
crRNA10 μM0,625 μl
Attendere almeno 5 minuti per consentire al complesso LbCas12a/crRNA di combinarsi.
Reporter del DNA100 μM0,5 μl
ddH2O-87,375 μL
Bersaglio-1 μl
Volume totale-100 μl

Tabella 6: La composizione della reazione CRISPR/Cas12a.

4. Configurazione SPM

  1. Per il percorso di eccitazione, impostare un raggio laser in modo che passi attraverso i filtri a densità neutra (ND) per attenuare l'intensità del laser.
  2. Generare un fascio collimato da una lente asferica (di seguito denominata L1) e rifletterlo dallo specchio dicroico (DM).
  3. Dirigere la luce sul vetrino dove è posizionato il campione attraverso l'obiettivo (20x) per illuminare ed eccitare la fluorescenza del campione. Il tavolino del campione consente una regolazione precisa del piano focale, dirigendo il fascio verso il piano focale posteriore dell'obiettivo. I passaggi sopra menzionati formano il percorso di eccitazione dello strumento SPM.
  4. Per il percorso di emissione, posizionare una lente esterna (di seguito denominata L2) per formare un'immagine intermedia sull'altro lato dell'obiettivo. L'obiettivo illumina contemporaneamente il campione e raccoglie il segnale di emissione.
  5. Registrare il segnale di fluorescenza dal campione utilizzando lo smartphone posto alla fine del percorso di emissione. Utilizzare una staffa stabile per evitare scosse.
  6. Imposta un filtro passa-banda tra L1 e la fotocamera dello smartphone per filtrare la luce eccitata consentendo solo alla luce emessa dal campione di raggiungere la fotocamera, il che può ottimizzare il rilevamento.
  7. Immobilizzare la configurazione SPM su una breadboard per la distribuzione portatile.
    NOTA: Lo schema e l'aspetto fisico del dispositivo SPM per il rilevamento della fluorescenza basato sulla reazione RPA-CRISPR/Cas12a sono mostrati nella Figura 2. Il rilevamento CRISPR/Cas12a avviene sul vetrino pretrattato descritto nella fase successiva.

figure-protocol-1
Figura 2: Schema e aspetto fisico del dispositivo SPM utilizzato per la rilevazione della fluorescenza. (A) L'aspetto fisico del dispositivo SPM per la raccolta di immagini a fluorescenza dopo la reazione RPA-CRISPR/Cas12a. (B) Schema del dispositivo SPM per la rilevazione della fluorescenza basato sulla reazione RPA-CRISPR/Cas12a. Questa figura è stata modificata (posizione e colore dell'immagine regolati) con il permesso di Lei et al.35. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

5. Trattamento del vetrino per il rilevamento con SPM

  1. Preparare il polidimetilsilossano (PDMS) mescolando la base e l'agente indurente in rapporto 10:1, quindi cuocere su una piastra a 80 °C per 2 ore.
  2. Trattare sia il PDMS che il vetrino (Lunghezza: 75 mm; Altezza: 50 mm) con trattamento al plasma ad ossigeno per 120 s, quindi premerli insieme.
  3. Cuocere il bicchiere/PDMS a 95 °C per 2 h; è sigillato in modo permanente dal legame Si-O-Si. Il PDMS ha un'elevata trasparenza e nessuna autofluorescenza, il che favorisce il rilevamento SPM. Il trattamento del vetrino e del PMDS viene eseguito secondo He et al.32

6. Rilevamento CRISPR/Cas12a con SPM

  1. Utilizzare i crRNA (Table of Materials) della sequenza target e la sonda reporter ssDNA che collega un fluoroforo e un quencher per CRISPR/Cas12a. In questo metodo, la carbossi-tetrametilrodamina (TAMRA) è legata come fluoroforo alle estremità 5' delle sonde reporter ssDNA e Black Hole Quencher-2 (BHQ2) come quencher alle estremità 3'. La sequenza dettagliata del crRNA e del reporter ssDNA è descritta nella Tabella 5.
  2. Preparare la proteina del batterio delle Lachnospiraceae Cas12a (LbCas12a) con 10x tampone di reazione CRISPR/Cas12a.
  3. Sciogliere 1 μL di prodotto di reazione RPA dalla sezione 2 in 1 tampone di reazione CRISPR/Cas12a con complessi LbCas12a-crRNA e sonda reporter ssDNA da 500 nM in un volume di reazione di 100 μL.
  4. Dopo aver mescolato LbCas12a e crRNA, lasciare riposare la miscela per almeno 5 minuti per formare un complesso funzionale. Dopo l'incubazione, aggiungere altri componenti alla miscela di reazione e completare la reazione a 37 °C. Il volume finale di ciascuna reazione CRISPR/Cas12a è di 100 μl. Le concentrazioni dettagliate di ciascun componente in ciascuna reazione CRISPR/Cas12a sono descritte nella Tabella 6.
  5. Eseguire la reazione di rilevamento CRISPR/Cas12a da 100 μl sul vetrino pretrattato e coprirlo con un vetrino coprioggetti. Incubare il vetrino con reazione a RT per 10 min.
  6. Misurare i segnali di fluorescenza tramite l'SPM. Posizionare il vetrino con la reazione di rilevamento sul tavolino dell'SPM, mantenere una distanza adeguata, regolare la lunghezza focale e la chiarezza, quindi cercare il campo visivo della reazione e metterlo a fuoco per catturare un'immagine.
    NOTA: È necessario ottenere prima una curva standard in modo che i dati dei campioni possano essere scalati all'intervallo di concentrazione approssimativo. Vengono utilizzate varie concentrazioni di bersagli purificati, tra cui 10 nM, 1 nM, 100 pM e 10 pM, un altro virus come controllo negativo (prima dell'RPA).

7. Aumento di set di dati e dati

  1. Raccogliere le immagini di fluorescenza dal saggio di rilevamento nella sezione 6 come set di dati. Ripetere almeno tre rilevamenti paralleli per ogni campione per garantire il parallelismo dei dati.
    1. È possibile approvare alcuni modi appropriati per ottenere un parallelismo più elevato. Ad esempio, quando raccogli le immagini a fluorescenza da ciascun campione, metti a fuoco manualmente e cerca un campo relativamente più luminoso per scattare le immagini. Allo stesso tempo, fotografa ogni campione per ottenere il segnale di fluorescenza in più di cinque posizioni diverse.
  2. Misurare il valore medio di grigio di ciascuna immagine e la deviazione standard del valore medio di grigio in un gruppo di concentrazione mediante ImageJ.
  3. Impostare un intervallo di intensità [mediana - deviazione standard, mediana + deviazione standard] per la pulizia dei dati.
    NOTA: Nelle immagini ottenute nei primi passaggi, potrebbero esserci immagini con grandi differenze, quindi è necessario schermare le immagini. Se le intensità delle immagini sono al di fuori della soglia impostata, devono essere considerate anomale ed escluse.
  4. Etichettare le immagini per il bersaglio purificato a concentrazioni crescenti con 0-6 in ordine crescente, rispettivamente.
  5. Per migliorare la robustezza del sistema e prevenire l'overfitting, implementa tecniche di aumento delle immagini come il capovolgimento orizzontale, il capovolgimento verticale e il rumore casuale attraverso le funzioni di trasformazione in Python. Ciò consente di introdurre variazioni nel set di dati.

8. Trasferisci l'apprendimento

  1. Come rete backbone, adotta il modello di deep learning AlexNet33 per la classificazione.
  2. Per soddisfare il vincolo del modello pre-addestrato nella sezione 7, rimodellare le immagini di input a 224 pixel x 224 pixel x 3 canali (altezza e larghezza di 224 pixel e una profondità di 3 canali per i canali di colore rosso, verde e blu) tramite le funzioni di trasformazione in Python.
    NOTA: questo passaggio è una pre-elaborazione comune per dati eterogenei nell'apprendimento del trasferimento, inclusa la trasformazione.
  3. Utilizza una rete backbone pre-addestrata con il set di dati ImageNet per estrarre le feature sfruttando i pesi dei livelli nascosti intermedi che sono stati appresi.
  4. Nel contesto del lavoro di classificazione della fluorescenza, sostituire lo strato finale completamente connesso della rete neurale, che originariamente includeva 1000 neuroni per l'attività ImageNet, con uno strato completamente connesso con 2 o 7 neuroni.
  5. Valutare le prestazioni del modello di training di configurazione usando una serie di metriche, tra cui matrice di confusione, accuratezza, precisione, richiamo e punteggio F1 basato su Lawton e Viriri34.

Risultati

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Questo metodo si concentra su un sistema di rilevamento veloce, facile da implementare, altamente sensibile e point-of-care (POC) per i virus a DNA. La progettazione di coppie di primer per la reazione RPA e la progettazione di crRNA per la reazione CRISPR/Cas12a sono due delle parti essenziali poiché influenzeranno l'efficienza della reazione RPA-CRISPR/Cas12a e influenzeranno la successiva rilevazione e classificazione.

In questo metodo, FV3 è considerato un esempio di rilevamento del virus a DNA. Sono state progettate alcune coppie di primer RPA per FV3 e quella più efficiente viene scelta e assicurata che mostri una buona efficienza di amplificazione, che può essere confermata garantendo la luminosità e la dimensione delle bande attraverso l'elettroforesi su gel dei prodotti RPA come menzionato nel passaggio 2.8. Allo stesso tempo, abbiamo progettato crRNA CRISPR/Cas12a e scelto quello più efficiente in base al segnale di fluorescenza più forte innescato nella reazione CRISPR/Cas12a senza RPA. La sequenza dei tre primer in avanti e dei tre all'indietro per RPA e dei tre crRNA per Cas12a è mostrata nella Tabella 7. Sulla base dei risultati dell'elettroforesi su gel di agarosio mostrati nella Figura 3, la 6acoppia di primer offre una migliore efficienza di amplificazione (F2 e R1), selezionata per il metodo. Come mostrato nella Figura 4, il crRNA-3 è il più efficiente per la scissione collaterale, che viene selezionato nel metodo.

RPA primer F1ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCAAAG
RPA primer F2ATGTCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACA
RPA primer F3TCTTCTGTAACTGGTTCAGGTATCACAAGTGGT
RPA primer R1GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGG
RPA primer R2GGCGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAA
RPA primer R3CGTTGAGGATGTAATCCCCCGACCTGGGAACG
LbCas12a crRNA-1uaauuucuacuaaguguagauATCGACTTGGCCACTTATGACAA
LbCas12a crRNA-2uaauuucuacuaaaguguagauTCAAGGAGCACTACCCCGTGGGG
LbCas12a crRNA-3uaauuucuacuaaguguagauGGGCAGCAGTTTTCGGTCGGGGCGT

Tabella 7: I primer RPA e le sequenze di crRNA per l'ottimizzazione della reazione.

figure-results-1
Figura 3: Risultati dell'elettroforesi su gel di agarosio per la valutazione dell'efficienza RPA. Le reazioni RPA sono state effettuate utilizzando diverse combinazioni di primer nelle stesse condizioni con un bersaglio purificato da 1 nM. Il numero 1 era considerato come la combinazione di RPA-F3 e RPA-R3, 2 come RPA-F3 e RPA-R2, 3 come RPA-F3 e RPA-R1, 4 come RPA-F2 e RPA-R3, 5 come RPA-F2 e RPA-R2, 6 rappresentava RPA-F2 e RPA-R1, 7 come RPA-F1 e RPA-R3, 8 come RPA-F1 e RPA-R2, 9 come RPA-F1 e RPA-R2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 4: Rilevamento dei frammenti bersaglio di FV3 con tre diversi crRNA da parte di CRISPR/Cas12a. Le concentrazioni di frammenti purificati applicati nella rilevazione erano da 10 nM a 100 pM di DNA bersaglio rispetto a 10 nM di DNA di controllo con 30 minuti di incubazione. Questa figura è riutilizzata con il permesso di Lei et al.35. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per generare i dati nella Figura 5, abbiamo applicato primer RPA ottimizzati, crRNA e la configurazione SPM. Per avere un'idea migliore della concentrazione nei campioni, abbiamo amplificato frammenti di DNA di 240 bp del gene del capside maggiore (MCP) altamente conservato da FV3 e virus della necrosi renale e della milza infettiva (ISKNV, Iridoviridae) come bersaglio e controllo attraverso un kit di amplificazione PCR, che viene eseguito con le procedure mostrate nella Tabella 8. La dimensione del DNA amplificato è confermata attraverso l'elettroforesi su gel di agarosio e abbiamo estratto il bersaglio e il controllo del dsDNA purificato dal gel. I frammenti di DNA purificati vengono quantificati utilizzando uno spettrofotometro NanoDrop 2000.

figure-results-3
Figura 5: Le immagini a fluorescenza del DNA bersaglio purificato e del DNA di controllo. (A) Il controllo negativo. (B) DNA bersaglio purificato (100 pM). Questa figura è riutilizzata con il permesso di Lei et al.35. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

PalcoTemperatura (°C)OreCiclo(i)
Avvio a caldo955 minuti1
Denaturazione9530 secondi35
Ricottura6045 secondi
Estensione7230 secondi
Estensione725 minuti1
Immagazzinamento4--

Tabella 8: La procedura dell'amplificazione PCR.

Solo per riferimento, un set di dati che include 162 immagini a fluorescenza viene ottenuto dopo la pulizia dei dati. Il numero di immagini a fluorescenza per ulteriori analisi deve essere ampliato e abbiamo addestrato il set di dati utilizzando 337 immagini a fluorescenza per la classificazione binaria e 398 per la classificazione multiclasse.

Abbiamo ottenuto il rilevamento in circa 40 minuti, inclusi 30 minuti per l'amplificazione RPA e 10 minuti per il rilevamento LbCas12a dopo RPA. Quando si utilizza il sistema di rilevamento sviluppato con primer RPA selezionati e crRNA, l'intensità del segnale di 10 aM FV3 e il controllo mostrano differenze significative, come mostrato nella Figura 1 supplementare.

Figura 1 supplementare: Le statistiche dell'intensità del segnale per le immagini a fluorescenza raccolte nelle reazioni RPA-LbCas12a con varie concentrazioni di frammenti purificati. *: p < 0,05; **: p < 0,01; : p < 0,001; : p < 0,0001; F: FV3, I: ISKNV; U.A.: Unità di assorbanza. Questa figura è riutilizzata con il permesso di Lei et al.35. Fare clic qui per scaricare questo file.

Discussione

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Con questo metodo, sviluppiamo un sistema di rilevamento del virus a DNA veloce, facile da implementare, altamente sensibile, specifico per la sequenza e POC con l'assistenza dell'intelligenza artificiale. Dopo aver ottenuto i campioni, viene applicata RPA per amplificare la sequenza target, quindi CRISPR/Cas12a può riconoscere il DNA target e rilasciare fluorescenza, che amplia il segnale di rilevamento. La microscopia portatile per smartphone è costruita per acquisire immagini a fluorescenza e i modelli di deep learning con transfer learning vengono utilizzati per la classificazione binaria delle immagini dei campioni positivi e negativi. FV3 viene prelevato come campione positivo in questo metodo e quindi studiato da più prospettive per migliorare la specificità e la sensibilità del sistema proposto.

La prima strategia consiste nel progettare primer RPA specifici e selezionare i primer più efficienti. L'efficienza di amplificazione della reazione RPA è influenzata da diversi primer36. La specificità dei primer utilizzati per amplificare il gene bersaglio dei ceppi virali a DNA può essere confermata mediante blasting contro il database standard di sequenziamento nucleotidico. Poiché non esiste una guida per la progettazione di coppie di primer RPA efficienti, è necessaria la convalida sperimentale37.

Un altro approccio consiste nel progettare il crRNA del virus bersaglio per la reazione CRISPR/Cas12a poiché l'efficienza di scissione collaterale contribuisce in modo significativo alla sensibilità di rilevamento38,39. La forza del segnale di fluorescenza innescato nella reazione CRISPR/Cas12a senza RPA deve essere considerata nella selezione del crRNA migliore. Inoltre, l'attività collaterale della proteina LbCas12a è costantemente attivata per 24 ore32, il che può giovare al rilevamento.

Allo scopo di identificare i virus e visualizzare le particelle virali, è stata applicata la microscopia a fluorescenza 40,41. Tuttavia, la microscopia convenzionale è ingombrante e costosa per una rapida diagnosi POC. Pertanto, nel sistema proposto, viene costruito un SPM portatile a costi inferiori per ottenere il segnale di fluorescenza catturando le immagini per il rilevamento POC. Tale SPM portatile costa molto meno di un lettore di piastre commercializzato o di una macchina per PCR in tempo reale, che è conveniente per la configurazione del sistema di rilevamento.

Questa piattaforma proposta deve essere ulteriormente migliorata anche sotto alcuni aspetti. Quando si applica questa piattaforma di rilevamento ad altri virus a DNA, sia il primer RPA che la sequenza Cas12a-crRNA devono essere riprogettati. Poiché non esiste una guida per la loro progettazione, è necessario effettuare esperimenti per valutarne l'efficienza. Sebbene il sistema proposto possa soddisfare i vantaggi della portabilità, le dimensioni dell'intero sistema devono ancora essere ulteriormente ridotte per ottenerne uno più leggero. Poiché la stessa fotocamera del telefono cellulare non è facile da mettere a fuoco per le riprese a distanza ravvicinata, ci vuole tempo per regolare durante il processo di ottenimento di immagini fluorescenti, incluso il campo visivo, per immagini di migliore qualità.

Con i progressi nella tecnologia correlata e le nuove applicazioni, l'efficienza nel rilevamento POC continuerà a migliorare. Il metodo qui presentato è un esempio di un miglioramento che può aiutare con il rilevamento POC basato sul sistema CRISPR/Cas12a e sulla piattaforma SPM, con una nuova assistenza AI. Inoltre, il sistema integrato potrebbe essere utilizzato per identificare qualsiasi bersaglio di DNA a causa della riprogrammabilità del crRNA. Il sistema RPA-CRISPR/Cas12a-AI avrà una posizione significativa nell'identificazione dei patogeni del DNA in termini di sensibilità di rilevamento, specificità, tempo e affidabilità.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è supportato dalla National Natural Science Foundation of China 31970752, Science, Technology, Innovation Commission of Shenzhen Municipality JCYJ20190809180003689, JSGG20200225150707332, JSGG20191129110812708, WDZC20200820173710001; Finanziamento aperto del laboratorio della baia di Shenzhen, SZBL2020090501004; Fondazione scientifica post-dottorato cinese 2020M680023; e Amministrazione generale delle dogane della Repubblica popolare cinese 2021HK007.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Amplificazione 20xOLYMPUSOPLN20X
Laser verde a 532 nmThorlabsPL201con potenza di uscita di 0,9 mW
d'onda di taglio 535 nmcromatoAT535
6x tampone di caricamento del DNAThermo scientificR0611
Micropiastra nera a 96 pozzettiCorning Incorporated3603Black con fondo piatto e trasparente
Lente asfericaLubangN/A
Filtro passa-bandaSEMROCKFF01-542/27-25
Bsu DNA polimerasiATG BiotecnologiaM103Grande frammento
crRNASangon BiotechN/A
Frammenti di DNASangon BiotechN/A
Supporti dicroiciRuicageN/A
Specchio dicroicoSEMROCKFF555-Di03-25x36con lunghezza d'onda di taglio di 535 nm
E.Z.N.A Kit di estrazione del gelOmega BiotekD2500-02
EnGen Lba Cas12a (Cpf1)New England Biolabs (Beijing) LTDM0653T
PortafiltriRuicageN/A
Fluorophore-ssDNA-Quencher sonde reporterSangon BiotechN/ATAMRA (carbossi tetrametilrodamina) come fluoroforo alle 5 estremità; BHQ2 (Black Hole Quencher-2) come il quencher alle 3 estremità
GP32ATG BiotechnologyM104
ImageJOpen-sourceVersione 1.53t 24Scaricato da https://imagej.nih.gov/ij/ 
Lettore di micropiastreSPARK, TECANN/A
Strumento PCR per termociclatore multibloccoLongGeneN/A
NanoDrop 2000/2000c SpettrofotometriThermo ScientificND-2000
NEBuffer r2.1New England Biolabs (Pechino) LTDB6002S10x CRISPR/Cas12a Tampone di reazione
Trattamento al plasma di ossigeno Elettrotecnica  ProdottiN/A
Patogeno Inattivato, Senza estrazione di acidi nucleici, Tampone diretto alla PCR con proteinasi K (PINDBK)EbioPINDBK -25mL
Coppie di primer PCRSangon BiotechN/A
PDMSDow CorningSylgard 184
Coppie di primer RPASangon BiotechN/A
SmartphoneHuaweiMate10
Stadi di traslazioneRuicageN/A
Filtri a densità neutra trasmessaThorlabsND40A
Lenti acromatiche tripletteThorlabsTRH127-020-A
UvsXATG BiotechnologyM105
UvsYATG BiotechnologyM106
Lunghezza

Riferimenti

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