Qui, l'iniezione intra-peritoneale delle cellule leucemiche viene utilizzata per stabilire e propagare la leucemia mieloide acuta (LMA) nei topi. Questo nuovo metodo è efficace nel trapianto seriale di cellule LMA e può servire come alternativa per coloro che possono sperimentare difficoltà e incongruenze con l'iniezione endovenosa nei topi.
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Articolo metodologico
Trapianto intra-peritoneale per la generazione di leucemia mieloide acuta nei topi
In questo articolo
Sommario
Abstract
C'è un bisogno insoddisfatto di nuove terapie per trattare la leucemia mieloide acuta (LMA) e la ricaduta associata che coinvolge le cellule staminali persistenti della leucemia (LSC). Un modello sperimentale di roditore AML per testare terapie basate sul trapianto di successo di queste cellule tramite iniezioni retro-orbitali nei topi riceventi è irto di sfide. Lo scopo di questo studio era quello di sviluppare un metodo semplice, affidabile e coerente per generare un robusto modello murino di LMA utilizzando una via intra-peritoneale. Nel presente protocollo, le cellule del midollo osseo sono state trasdotte con un retrovirus che esprime oncoproteina di fusione umana MLL-AF9. È stata testata l'efficienza delle popolazioni di lignaggio negativo (Lin-) e Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) come LSC donatrici nello sviluppo della LMA primaria ed è stata adottata l'iniezione intraperitoneale come nuovo metodo per generare LMA. Il confronto tra iniezioni intra-peritoneali e retro-orbitali è stato fatto in trapianti seriali per confrontare e contrastare i due metodi. Entrambe le cellule Lin e LSK trasdotte con il virus umano MLL-AF9 si sono innestate bene nel midollo osseo e nella milza dei riceventi, portando a una LMA conclamata. L'iniezione intra-peritoneale di cellule donatrici ha stabilito la LMA nei riceventi dopo il trapianto seriale e l'infiltrazione delle cellule AML è stata rilevata nel sangue, nel midollo osseo, nella milza e nel fegato dei riceventi mediante citometria a flusso, qPCR e analisi istologiche. Pertanto, l'iniezione intraperitoneale è un metodo efficiente di induzione della LMA utilizzando il trapianto seriale di cellule leucemiche del donatore.
Introduzione
La leucemia mieloide acuta (LMA) è un tipo di tumore ematologico di diversa eziologia con prognosi infausta1. La generazione di modelli animali AML pone le basi per la comprensione delle sue complesse variazioni e patobiologia nel tentativo di scoprire nuove terapie2. La leucemogenesi nei topi comporta il trapianto di cellule donatrici che esprimono oncoproteine di fusione, comprese le fusioni che coinvolgono il gene della leucemia a linea mista (MLL) per indurre potentemente la LMA, per imitare la malattia nell'uomo3. Varie origini cellulari di cellule donatrici sono state riportate nel trapianto....
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Protocollo
Tutti gli esperimenti sono stati preapprovati dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso la Pennsylvania State University.
1. Preparazione di tamponi e reagenti
- Preparare piastre di agar LB con ampicillina integrata (AP) (piastre sterili da 10 cm). Per fare questo, sciogliere 10 g di brodo LB con agar in 400 ml di acqua distillata, mescolare e portare il volume fino a 500 ml. Sterilizzare la soluzione in autoclave, quindi lasciare raffreddare la soluzione, aggiungere 0,5 ml di ampicillina (stock: 150 mg / ml) nella soluzione e agitare per mescolare. Aggiungere immediatamente 18 mL di soluzione in una ....
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Risultati
Confronto dell'efficienza del trapianto di cellule LMA murine utilizzando vie di trapianto r.o. e i.p.
In precedenza, l'istituzione di 1° AML è stata riportata in topi riceventi trapiantati retroorbitalmente con cellule LSK trasdotte MLL-AF9 e la trapiantabilità di 1° cellule AML è stata dimostrata mediante trapianto seriale30. Il presente studio è il primo a valutare la possibilità di utilizzare le cellule Lin- del midollo osseo per eseguire il trapianto. La presenz.......
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Discussione
Questi studi sopra descritti forniscono prove a sostegno del fatto che il trapianto di cellule Lin- è paragonabile alle cellule LSK nella generazione di LMA murina 1°. Inoltre, i dati attuali mostrano anche che l'iniezione i.p. è un metodo efficiente e conveniente per stabilire la LMA murina rispetto all'iniezione endovenosa (o r.o.).
Oltre alle cellule LSK, altre popolazioni come il progenitore granulocitario-monocitario (GMP), il progenitore linfoide comune (CLP) e il progenitore .......
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Dichiarazioni
Gli autori non dichiarano alcun conflitto di interessi.
Ringraziamenti
Gli autori ringraziano la Flow Cytometry Core Facility dell'Huck Institute e la Histopathology Core Facility dell'Animal Diagnostic Laboratory, Dipartimento di Scienze Veterinarie e Biomediche, The Pennsylvania State University, per aver fornito un supporto tecnico tempestivo. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'American Institute for Cancer Research (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, numero di adesione 00000005 a K.S.P. e R.F.P.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| a-Seleziona le cellule competenti | Bioline | BIO-85027 | |
| Cloruro di ammonio (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillina | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Albumina sierica bovina (BSA), Frazione V— Basso grado di endotossine | Gemini bio-prodotti | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacina HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, alto glucosio, senza glutammina | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco' s Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, sale disodico (EDTA-2Na), diidrato, grado di biologia molecolare | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Siero fetale bovino - Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrina, bovino | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Soluzione di insulina umana | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutammina 200 mM (100×) soluzione | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB brodo, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Brodo con agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-topo CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Interleuchina di topo-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Interleuchina di topo-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Fattore di cellule staminali di topo (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Soluzione di penicillina-streptomicina, 100x | Corning | Cellule Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) | ATCC | CRL-3214 | |
| Bicarbonato di potassio (KHCO3), Granulare | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Ratto anti-topo CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| Frammento di fibronectina umana ricombinante RetroNectina | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagente | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagente | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Soluzione blu di tripano, 0,4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%), rosso | fenoloGibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoetanolo (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Saggi commerciali | |||
| EasySep Kit di isolamento delle cellule progenitrici ematopoietiche del topo | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| Thermo Fisher | Cat# 4368813 | ||
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato topi | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J topi & nbsp; | Ceppo di laboratorio Jackson | # 002014 | |
| topi CD45.2 C57BL6 / J | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Strumenti e software | |||
| Adobe illustrator | Versione 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 citometro a flusso | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys programma software | Versione 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism versione 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Sistema di PCR in tempo reale | Biosystems | ||
| applicata Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescenza Fluorescenza Imaging | G:Box Chemi |
Riferimenti
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Erns....
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Ristampe e permessi
