Articolo metodologico

Differenziazione di cellule staminali pluripotenti umane in gruppi di isole produttrici di insulina

DOI:

10.3791/64840

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23 giugno 2023

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1Department of Cellular & Physiological Sciences, Life Science Institute, University of British Columbia, 2School of Biomedical Engineering, University of British Columbia, 3STEMCELL Technologies Inc, 4Department of Surgery, University of British Columbia

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

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La differenziazione delle cellule staminali in cellule insulari fornisce una soluzione alternativa al trattamento convenzionale del diabete e alla modellizzazione della malattia. Descriviamo un protocollo dettagliato di coltura di cellule staminali che combina un kit di differenziazione commerciale con un metodo precedentemente convalidato per aiutare a produrre isole derivate da cellule staminali secernenti insulina in un piatto.

Abstract

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La differenziazione delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) in cellule beta secernenti insulina fornisce materiale per studiare la funzione delle cellule beta e il trattamento del diabete. Tuttavia, permangono sfide nell'ottenere cellule beta derivate da cellule staminali che imitano adeguatamente le cellule beta umane native. Sulla base di studi precedenti, sono state generate cellule insulari derivate da hPSC per creare un protocollo con risultati di differenziazione e coerenza migliorati. Il protocollo qui descritto utilizza un kit di progenitori pancreatici durante le fasi 1-4, seguito da un protocollo modificato da un articolo precedentemente pubblicato nel 2014 (denominato "protocollo R" di seguito) durante le fasi 5-7. Sono incluse procedure dettagliate per l'utilizzo del kit di progenitori pancreatici e piastre a micropozzetti da 400 μm di diametro per generare cluster di progenitori pancreatici, protocollo R per il differenziamento endocrino in un formato di sospensione statica a 96 pozzetti e caratterizzazione in vitro e valutazione funzionale di isole derivate da hPSC. Il protocollo completo richiede 1 settimana per l'espansione iniziale delle hPSC, seguita da ~5 settimane per ottenere le isole hPSC produttrici di insulina. Il personale con tecniche di coltura di base di cellule staminali e formazione in saggi biologici può riprodurre questo protocollo.

Introduzione

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Le cellule beta pancreatiche secernono insulina rispondendo all'aumento dei livelli di glucosio nel sangue. I pazienti che non hanno una produzione sufficiente di insulina a causa della distruzione autoimmune delle cellule beta nel diabete di tipo 1 (T1D)1, o a causa della disfunzione delle cellule beta nel diabete di tipo 2 (T2D)2, sono in genere trattati con la somministrazione di insulina esogena. Nonostante questa terapia salvavita, non può eguagliare con precisione lo squisito controllo della glicemia ottenuto dalla secrezione dinamica di insulina dalle cellule beta in buona fede. Pertanto, i pazienti spesso subiscono le conseguenze di episodi ipoglicemici potenzialmente letali e altre complicanze derivanti da escursioni iperglicemice croniche. Il trapianto di isole da cadavere umano ripristina con successo uno stretto controllo glicemico nei pazienti con diabete di tipo 1, ma è limitato dalla disponibilità di donatori di isole e dalle difficoltà nel purificare le isole sane per il trapianto 3,4. Questa sfida può, in linea di principio, essere risolta utilizzando le hPSC come materiale di partenza alternativo.

Le attuali strategie per la generazione di isole che secernono insulina da hPSC in vitro spesso mirano a imitare il processo di sviluppo del pancreas embrionale in vivo 5,6. Ciò richiede la conoscenza delle vie di segnalazione responsabili e l'aggiunta temporizzata di fattori solubili corrispondenti per imitare le fasi critiche del pancreas embrionale in via di sviluppo. Il programma pancreatico inizia con l'impegno nell'endoderma definitivo, che è caratterizzato dai fattori di trascrizione forkhead box A2 (FOXA2) e dalla regione Y-box 17 che determina il sesso (SOX17)7. La differenziazione successiva dell'endoderma definitivo comporta la formazione di un tubo intestinale primitivo, che si sviluppa in un intestino anteriore posteriore che esprime l'omeobox pancreatico e duodenale 1 (PDX1)7,8,9 e l'espansione epiteliale nei progenitori pancreatici che co-esprimono PDX1 e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)10,11.

Un ulteriore impegno per le cellule delle isole endocrine è accompagnato dall'espressione transitoria della neurogenina-3 (NGN3)12 e dall'induzione stabile dei fattori di trascrizione chiave della differenziazione neuronale 1 (NEUROD1) e dell'homeobox 2 NK2 (NKX2.2)13. Le principali cellule che esprimono ormoni, come le cellule beta produttrici di insulina, le cellule alfa produttrici di glucagone, le cellule delta produttrici di somatostatina e le cellule PPY produttrici di polipeptidi pancreatici, vengono successivamente programmate. Con questa conoscenza, così come le scoperte di studi di screening farmacologico estesi e ad alto rendimento, i recenti progressi hanno permesso la generazione di isole hPSC con cellule simili alle cellule beta in grado di secernere insulina 14,15,16,17,18,19.

Sono stati riportati protocolli graduali per la generazione di cellule betasensibili al glucosio 6,14,18,19. Sulla base di questi studi, il presente protocollo prevede l'uso di un kit di progenitori pancreatici per la generazione di cellule progenitrici pancreatiche PDX1+/NKX6.1+ in una coltura planare, seguita dall'aggregazione di piastre a micropozzetti in cluster di dimensioni uniformi e da un'ulteriore differenziazione verso le isole hPSC secernenti insulina con il protocollo R in una coltura statica in sospensione 3D. Vengono eseguite analisi di controllo della qualità, tra cui citometria a flusso, immunocolorazione e valutazione funzionale, per una rigorosa caratterizzazione delle cellule differenzianti. Questo articolo fornisce una descrizione dettagliata di ogni fase del differenziamento diretto e delinea gli approcci di caratterizzazione in vitro.

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Protocollo

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Questo protocollo si basa sul lavoro con linee hPSC, tra cui H1, HUES4 PDXeG e Mel1 INSGFP/W, in condizioni di alimentazione libera. Una procedura passo-passo è descritta in dettaglio in questa sezione, con i dati di supporto della differenziazione di Mel1 INSGFP/W nella sezione dei risultati rappresentativi. Si consiglia di eseguire un'ulteriore ottimizzazione quando si lavora con altre linee hPSC non indicate qui. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli relativi a tutti i reagenti e le soluzioni utilizzate in questo protocollo.

1. Preparazione dei mezzi e delle soluzioni di differenziazione

NOTA: Vedere la Tabella 1 per tutte le soluzioni da preparare e la Tabella 2 per i mezzi di differenziazione.

  1. Preparare tutti i terreni e i reagenti per la coltura cellulare in una cabina sterile per la biosicurezza. Riscaldare brevemente le soluzioni relative alle colture cellulari e i terreni basali a 37 °C in un bagno prima dell'uso.
    NOTA: Come descritto di seguito, prepara ogni giorno nuovi mezzi di differenziazione aggiungendo integratori e usali lo stesso giorno. In alternativa, il kit di progenitori pancreatici offre la possibilità di preparare in anticipo un volume maggiore che può essere utilizzato per diversi giorni seguendo il protocollo del produttore. Entrambi i metodi per la preparazione dei supporti si rivelano efficaci. Si noti che non è consigliabile lasciare i supporti per un tempo prolungato a bagnomaria. Quando si preparano terreni freschi ogni giorno, si consiglia di aliquotare gli integratori per evitare ripetuti cicli di gelo-disgelo.

2. Differenziazione delle hPSCs in cellule progenitrici pancreatiche

  1. Mantenere le hPSC indifferenziate sui vasi rivestiti di Matrigel nel terreno completo mTeSR1 ed eseguire cambi di terreno ogni giorno. Durante la coltura di mantenimento, le hPSC passano ogni 3-4 giorni quando le cellule raggiungono ~70% di confluenza utilizzando il reagente di dissociazione cellulare seguendo il protocollo del produttore. Per avviare la differenziazione, dissociare le cellule in singole cellule e seminarle su piastre trattate con coltura tissutale a 6 o 12 pozzetti (con volumi di terreno rispettivamente di 2 mL o 1 mL per pozzetto).
    NOTA: Vedere la Tabella 1 per le istruzioni relative alla conservazione del terreno basale dell'endoderma e delle sue aliquote.
  2. Prerivestire i pozzetti di coltura con Matrigel qualificato hESC (diluito in DMEM/F12 ghiacciato come raccomandato dal protocollo del produttore) e porre la piastra in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 per 30 min.
  3. Portare la piastra rivestita in Matrigel a temperatura ambiente (utilizzare entro 3 ore).
  4. Aspirare il terreno esausto dalla coltura hPSC e risciacquare una volta con DPBS. Dissociare la coltura di hPSC in singole cellule con enzima di dissociazione cellulare a 37 °C per 3-5 minuti. Risciacquare le cellule aggiungendo un terreno caldo DMEM/F12, trasferire in una provetta conica da 15 mL o 50 mL e centrifugare a 300 × g per 5 min.
  5. Risospendere il pellet cellulare con terreno completo di cellule staminali più 10 μM Y-27632 ed eseguire il conteggio delle cellule vive (tripano blu negativo) con un emocitometro o un contatore automatico di cellule. Aspirare Matrigel diluito e seminare immediatamente cellule vive ad una densità di 1,60-1,80 × 105/cm2 su pozzetti rivestiti di Matrigel e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore. Procedere alla fase 1.
    NOTA: Ciò si tradurrà in una confluenza iniziale del ~95% per avviare la differenziazione. Secondo il protocollo del produttore, si consiglia una densità di semina di 2,6 × 105/cm2 . Si consiglia di testare varie densità di semina per determinare il valore ottimale per una linea cellulare e per verificare la vitalità cellulare. Se la redditività è inferiore all'80%, non procedere con la differenziazione. La bassa vitalità cellulare può essere il risultato di un'eccessiva digestione o di un'eccessiva triturazione durante la raccolta o di lasciare le cellule per un tempo prolungato nel terreno DMEM/F12 prima della semina.
  6. Nella fase 1 giorno 1, riscaldare brevemente il mezzo basale dell'endoderma a 37 °C in un bagno e scongelare il supplemento MR e CJ. Preparare il terreno di fase 1A aggiungendo il supplemento MR e CJ al terreno basale dell'endoderma. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
  7. Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno di fase 1A e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
    NOTA: Le fasi di lavaggio non sono necessarie. Rimuovere tutte le cellule non attaccate dalla coltura agitando delicatamente la piastra di coltura prima dello scambio di terreno. Evitare di rompere il monostrato non toccando il puntale della pipetta con il fondo del pozzetto durante la rimozione del fluido e aggiungendo delicatamente il fluido.
  8. Nella fase 1 giorno 2, riscaldare brevemente il terreno basale endodermico in un bagno a 37 °C e scongelare il supplemento CJ. Preparare il terreno di Fase 1B aggiungendo il Supplemento CJ al terreno basale dell'endoderma. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
  9. Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno Stage 1B e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
  10. Nella fase 1 giorno 3, ripetere i passaggi 2.8-2.9. Procedere alla fase 2.
  11. Nella fase 2 giorno 1, riscaldare il terreno basale pancreatico Stadio 2-4 in un bagno a 37 °C e scongelare i supplementi 2A e 2B. Preparare il terreno di fase 2A aggiungendo il supplemento 2A e 2B al terreno basale pancreatico stadio 2-4. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
  12. Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno di fase 2A e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% di CO2 per 24 ore.
  13. Nella fase 2 giorno 2, riscaldare il terreno basale pancreatico Stage 2-4 in un bagno a 37 °C e scongelare il supplemento 2B. Preparare il terreno di fase 2B aggiungendo il supplemento 2B al terreno basale pancreatico Stage 2-4. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
  14. Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno Stage 2B e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
  15. Nella fase 2 giorno 3, ripetere i passaggi 2.13-2.14. Procedere alla fase 3.
  16. Nella fase 3 giorno 1, riscaldare il terreno basale pancreatico stadio 2-4 in un bagno a 37 °C e scongelare il supplemento 3. Preparare il terreno di Stadio 3 aggiungendo l'Integratore 3 al terreno basale di Stadio pancreatico 2-4. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
  17. Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno di fase 3 e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% di CO2 per 24 ore.
  18. Nella fase 3, giorno 2 e giorno 3, ripetere i passaggi 2.16-2.17. Procedi alla fase 4.
  19. Nella fase 4 giorno 1, riscaldare il terreno basale pancreatico stadio 2-4 in un bagno a 37 °C e scongelare il supplemento 4. Preparare il terreno di Stadio 4 aggiungendo il Supplemento 4 al terreno basale di Stadio pancreatico 2-4. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
  20. Aspirare il terreno esausto dai pozzetti, aggiungere il terreno Stage 4 e incubare in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
  21. Nella fase 4 dal giorno 2 al giorno 4, ripetere i passaggi 2.19-2.20. Procedere con i passaggi di aggregazione.

3. Aggregazione in cluster di progenitori pancreatici utilizzando piastre a micropozzetti da 400 μm di diametro

  1. Nella fase 4 giorno 5, pretrattare i micropozzetti (ad es. formato piastra a 24 pozzetti) con 500 μL di soluzione di risciacquo antiaderenza per pozzetto.
  2. Preparare una piastra di bilanciamento e centrifugare la piastra per micropozzetti a 1.300 × g per 5 minuti.
    NOTA: Controllare la piastra al microscopio per assicurarsi che non rimangano bolle nei micropozzetti. Centrifugare di nuovo per altri 5 minuti se le bolle rimangono intrappolate nei micropozzetti.
  3. Aspirare la soluzione di risciacquo antiaderente dai pozzetti e risciacquare una volta con 1 mL di DPBS. Aspirare il DPBS dai pozzetti e aggiungere 1 mL di terreno di aggregazione a ciascun pozzetto.
  4. Rimuovere il terreno esausto dalle colture dei progenitori pancreatici e lavare una volta con DPBS. Dissociare le colture in singole cellule con reagente di dissociazione a 37 °C per 10-12 min. Risciacquare le cellule con DMEM/F12 caldo, trasferirle in un tubo e centrifugare a 300 × g per 5 min.
  5. Risospendere il pellet cellulare nel mezzo di aggregazione ed eseguire il conteggio delle cellule vive. Inizializzare 2,4-3,6 milioni di cellule totali per pozzetto (cioè 2.000-3.000 cellule per micropozzetto) e aggiungere il terreno di aggregazione a ciascun pozzetto per ottenere un volume finale di 2 mL per pozzetto.
  6. Pipettare delicatamente le cellule su e giù più volte con un puntale per pipette P1000 per garantire una distribuzione uniforme delle cellule in tutto il pozzetto. Non introdurre bolle nei micropozzetti. Centrifugare la piastra per micropozzetti a 300 × g per 5 minuti per catturare le cellule nei micropozzetti. Incubare la piastra a micropozzetti in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% di CO2 per 24 ore di aggregazione e procedere alla differenziazione delle fasi 5-7.
    NOTA: Fare attenzione a non disturbare la piastra durante il tempo di aggregazione. Possono essere necessarie fino a 48 ore di incubazione per una formazione ottimale dell'aggregato.

4. Differenziamento di cluster di progenitori pancreatici derivati da kit in isole hPSC

  1. Nella fase 5 giorno 1, riscaldare il terreno basale della fase 5-7 in un bagno a 37 °C e scongelare gli integratori (vedere Tabella 1 e Tabella 2). Preparare il terreno di Stage 5 aggiungendo supplementi (alle concentrazioni di lavoro finali) al terreno basale di Stage 5-7. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
  2. Dopo la formazione dell'aggregato, pipettare delicatamente gli aggregati su e giù più volte con un puntale per pipette P1000 per far galleggiare le cellule non aggregate. Lasciare che gli aggregati si depositino per gravità (attendere ~1 min). Rimuovere delicatamente il più possibile il terreno esausto (contenente le cellule galleggianti non aggregate) dal pozzetto, evitando di aspirare gli aggregati.
  3. Erogare energicamente il terreno fresco Stage 5 sulla superficie della piastra per micropozzetti per rimuovere gli aggregati dai micropozzetti. Trasferimento degli aggregati in 6 pozzetti a attacco ultrabasso (ULA). Risciacquare una volta con il terreno Stage 5 per recuperare completamente gli aggregati dai micropozzetti.
  4. Raccogliere tutti gli aggregati nei 6 pozzetti dell'ULA, risospendere gli aggregati nel terreno di fase 5 e regolare la densità a 20 cluster per 100 μL (ad esempio, si prevede di recuperare ~1.200 cluster da ciascun pozzetto. Risospendere 1.200 cluster in 6 mL di terreno di fase 5). Utilizzare una pipetta multicanale per erogare 50 μL di terreno Stage 5 in ciascun pozzetto di una piastra ULA a fondo piatto da 96 pozzetti. Riempire i pozzetti angolari e perimetrali con 200 μL di DPBS.
    NOTA: Evitare di utilizzare i pozzetti perimetrali per la coltura di aggregati poiché sono soggetti a una maggiore evaporazione; In caso contrario, utilizzare una piastra a 96 pozzetti progettata per ridurre al minimo l'evaporazione lungo i bordi (ad es. piastre a 96 pozzetti con fossati incorporati) o posizionare la piastra di coltura in un incubatore per colture cellulari ad alta umidità microclimatica.
  5. Aggiungere 100 μL di risospensione del cluster in ciascun pozzetto della piastra a fondo piatto a 96 pozzetti ULA, ottenendo un totale di 150 μL di terreno di coltura contenente una media di 20 cluster per pozzetto.
    NOTA: Miscelare delicatamente la risospensione del cluster ogni volta prima di erogare in 96 pozzetti.
  6. Posizionare le piastre di coltura su una superficie piana in un'incubatrice umidificata a 37 °C, 5% CO2 per 24 ore.
  7. Nella fase 5 giorno 2, preparare la fase 5 media seguendo la fase 4.1.
  8. Utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere ~90 μL di terreno esausto da ciascun pozzetto e aggiornare con 100 μL di terreno di fase 5.
  9. Nella fase 5 giorno 3, ripetere i passaggi 4.7-4.8. Procedi alla fase 6.
  10. Nella fase 6 giorno 1, riscaldare il terreno basale della fase 5-7 in un bagno a 37 °C e scongelare gli integratori (vedere Tabella 1 e Tabella 2). Preparare il terreno di Stage 6 aggiungendo supplementi (alle concentrazioni di lavoro finali) al terreno basale di Stage 5-7. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
  11. Utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere ~90 μL del terreno esausto e aggiornare con 100 μL di terreno Stage 6 per pozzetto.
  12. Nella fase 6 dal giorno 2 al giorno 8, ripetere i passaggi 4.10-4.11. Procedi alla fase 7.
  13. Nella fase 7 giorno 1, riscaldare il terreno basale della fase 5-7 in un bagno a 37 °C e scongelare gli integratori (vedere Tabella 1 e Tabella 2). Preparare il terreno di Stage 7 aggiungendo supplementi (alle concentrazioni di lavoro finali) al terreno basale di Stage 5-7. Mescolare bene e utilizzare immediatamente.
  14. Utilizzare una pipetta multicanale per rimuovere ~90 μL di terreno esausto e aggiornare con 100 μL di terreno Stage 7 per pozzetto.
  15. Nella fase 7 dal giorno 2 al giorno 12, ripetere i passaggi 4.13-4.14. Procedere alla caratterizzazione in vitro .

5. Analisi citofluorimetrica

  1. Rimuovere i terreni di coltura e lavarli una volta con DPBS. Dissociare le colture (cellule progenitrici planari o cluster differenzianti) in singole cellule con reagente di dissociazione incubando a 37 °C per 10-12 min. Risciacquare con tampone FACS e centrifugare a 300 × g per 5 min.
  2. Risospendere il pellet cellulare nel tampone FACS ed eseguire il conteggio delle cellule. Centrifugare le pile a 300 × g per 5 min. Risospendere le singole cellule in 500 μL di tampone Fix/Perm per 10 minuti a temperatura ambiente.
    NOTA: Portare il tampone Fix/Perm a temperatura ambiente prima dell'uso. Il tampone Fix/Perm contiene paraformaldeide (PFA). Maneggiare con cura il PFA in una cappa aspirante e smaltirlo secondo le linee guida istituzionali.
  3. Centrifugare a 500 × g per 3 min, lavare due volte con 500 μL di 1x tampone Perm/Wash e risospendere in 300 μL di 1x tampone Perm/Wash. Trasferire 100 μL di risospensione a singola cellula (ciascuna contenente 2,5-3 × 105 cellule) in tre provette microfuge per il controllo non colorato, il controllo dell'isotipo e la colorazione degli anticorpi (vedere la tabella dei materiali per informazioni sugli anticorpi e sulla diluizione del campione). Incubare per 45 minuti a temperatura ambiente e coprire con un foglio.
  4. Centrifugare a 500 × g per 3 min. Lavare due volte con 500 μL di 1x tampone Perm/Wash. Risospendere i campioni in 100 μL di tampone FACS e analizzare le cellule colorate (vedere la tabella dei materiali per la colorazione intracellulare dei marcatori in fasi specifiche) con un citometro a flusso e un software (ad es. FlowJo).
    NOTA: Se i campioni non vengono analizzati immediatamente, conservarli a 4°C al riparo dalla luce. Per la strategia di gating, i dati di flusso vengono prima controllati dalle proprietà di dispersione (FSC-A e SSC-A) per rimuovere i piccoli detriti cellulari, seguite dalle proprietà FSC-A e FSC-width per identificare i singoletti. Il gating positivo e negativo è determinato dai controlli con cellule staminali e/o dai controlli isotipici non colorati.

6. Immunocolorazione a montaggio intero

  1. Raccogli i grappoli in un tubo di microfuga. Sedimentare gli ammassi per gravità. Aspirare il terreno esausto e risciacquare una volta con 1 mL di PBS (con calcio e magnesio). Fissare i cluster con 1 mL di PFA al 4% a 4°C per una notte.
  2. Risciacquare una volta con PBST e permeabilizzare 20-30 cluster con 500 μL di TritonX-100 allo 0,3% in una provetta microfuge a temperatura ambiente per almeno 6 ore su uno scuotitore inclinabile.
    NOTA: Per i cluster di grandi dimensioni è necessario un tempo di permeabilizzazione più lungo (fino a 24 ore).
  3. Incubare i cluster in 100 μL di tampone bloccante a temperatura ambiente per 1 ora su un tilt shaker. Rimuovere il tampone bloccante e incubare i cluster con 100 μL di anticorpi primari diluiti in tampone di diluizione anticorpale a temperatura ambiente per una notte su un tilt shaker.
    NOTA: Se il fondo è forte durante l'imaging, incubare con anticorpi primari a 4 °C.
  4. Lavare accuratamente 3 x 30 min con 500 μL di PBST su uno scuotitore inclinabile (angolo di inclinazione impostato su 8, velocità impostata su 20).
  5. Incubare i cluster con 100 μL di anticorpi secondari in tampone di diluizione anticorpale a temperatura ambiente per una notte su un tilt shaker. Coprire i tubi con un foglio.
    NOTA: Se il fondo è forte durante l'imaging, incubare con anticorpi secondari a 4 °C.
  6. Risciacquare una volta con 500 μL di PBST. Aggiungere 100 μL di soluzione di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) (10 μg/mL in PBST) e colorare a temperatura ambiente per 10-15 minuti. Coprire con un foglio di alluminio e proteggere dalla luce.
  7. Lavare accuratamente 3 x 30 min con 500 μL di PBST su uno scuotitore inclinabile. Coprire i tubi con un foglio durante la fase di lavaggio.
  8. Fissare i cluster sui vetrini della camera di imaging (vedere la tabella dei materiali) prerivestiti con adesivo per tessuti secondo il protocollo del produttore e i protocolli pubblicati20,21.
  9. Montare con un terreno di purificazione dei tessuti (glicerolo all'80% in soluzione PBS) e coprire con vetrini coprioggetti. Proteggere dalla luce fino all'imaging confocale.
    NOTA: Se i campioni non vengono acquisiti immediatamente, conservarli a 4 °C al riparo dalla luce.

7. Saggio statico GSIS

  1. Tampone caldo di bicarbonato di Kreb a basso contenuto di glucosio (3,3 G KRB), tampone KRB ad alto contenuto di glucosio (16,7 G) e tampone KRB KCl da 30 mM in un bagno a 37 °C.
  2. Prelevare a mano i cluster di dimensioni corrispondenti e risciacquare con 2 mL di tampone KRB caldo da 3,3 G. Trasferire i cluster in una piastra a 6 pozzetti non trattata con coltura tissutale ed equilibrarli in un tampone KRB da 2 mL o caldo da 3,3 G per 1 ora in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 .
  3. Dopo l'equilibrazione, riempire la camera del saggio (vedere la tabella dei materiali) con 100 μL di tampone caldo KRB da 3,3 G. Prelevare a mano cinque grappoli e trasferirli al centro della camera del saggio. Incubare per 30 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 .
    NOTA: Utilizzare puntali per pipette da 10 μL per il trasferimento di cluster con volume di terreno minimo.
  4. Prelevare con cura ~100 μL del surnatante e conservarlo a -30 °C fino alla misurazione della secrezione basale di insulina (vedere punto 7.9). Non asciugare o perdere i grappoli in questa fase. Aggiungere immediatamente 100 μL di tampone KRB caldo da 16,7 G nella camera del saggio e incubare gli stessi cluster per 30 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% di CO2 .
  5. Prelevare con cura ~100 μL del surnatante e conservarlo a -30 °C fino alla misurazione della secrezione di insulina stimolata dal glucosio (vedere punto 7.9). Aggiungere immediatamente 100 μL di tampone caldo 30 mM KCl KRB nella camera del saggio e incubare gli stessi cluster per 30 minuti in un incubatore umidificato a 37 °C, 5% CO2 .
  6. Prelevare con cura ~100 μL del surnatante e conservare a -30 °C fino alla misurazione della secrezione di insulina stimolata da KCl (vedere punto 7.9). Aggiungere immediatamente 100 μL di tampone di lisi RIPA nella camera del saggio e trasferire il tampone di lisi contenente tutti e cinque i cluster in una provetta per microfuge.
  7. Facoltativo) Rompere manualmente i cluster mediante una vigorosa triturazione con un puntale per pipette P200. Vortice per 30 secondi e incubazione su ghiaccio per 30 minuti seguiti da altri 30 secondi di vortice.
    NOTA: Garantire una lisi completa mediante vortex e un tempo sufficiente di incubazione sul ghiaccio.
  8. Centrifugare a 8.000 × g per 1 min. Raccogliere il surnatante e conservare a -30 °C fino alla misurazione del contenuto totale di insulina (vedere punto 7.9).
  9. Misurare l'insulina umana nei campioni surnatanti utilizzando un kit ELISA per insulina umana secondo il protocollo del produttore e i protocolli pubblicati20,22.
    NOTA: Evitare il congelamento e lo scongelamento ripetuti dei campioni surnatanti. I campioni con più di tre cicli di congelamento e disgelo non devono essere analizzati.

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Risultati

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Abbiamo sviluppato una strategia ibrida per differenziare le cellule staminali in isole hPSC secernenti insulina in sette fasi, che utilizza un kit di progenitori pancreatici per i primi quattro stadi in coltura planare, seguito da un protocollo modificato basato su un metodo6 precedentemente riportato in una coltura in sospensione statica per gli ultimi tre stadi (Figura 1). Con questo protocollo, garantire una coltura vicina alla confluenza (90%-100%) a 24 ore dalla...

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Discussione

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Questo documento descrive un protocollo ibrido a sette stadi che consente la generazione di isole hPSC in grado di secernere insulina in seguito a provocazione del glucosio entro 40 giorni dalla coltura in vitro. Tra queste molteplici fasi, si ritiene che l'induzione efficiente dell'endoderma definitivo costituisca un importante punto di partenza per gli esiti finali della differenziazione18,27,28. Nel protocollo del pr...

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Dichiarazioni

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Timothy J. Kieffer era un dipendente di ViaCyte durante la preparazione di questo manoscritto. Gli altri autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.

Ringraziamenti

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Riconosciamo con gratitudine il supporto di STEMCELL Technologies, Michael Smith Health Research BC, Stem Cell Network, JDRF e Canadian Institutes of Health Research. Jia Zhao e Shenghui Liang hanno ricevuto il Michael Smith Health Research BC Trainee Award. Mitchell J.S. Braam ha ricevuto la borsa di studio Mitacs Accelerate. Diepiriye G. Iworima ha ricevuto la borsa di studio Alexander Graham Bell Canada Graduate e il CFUW 1989 Ecole Polytechnique Commemorative Award. Ringraziamo sinceramente il Dr. Edouard G. Stanley dell'MCRI e della Monash University per aver condiviso la linea Mel1 INS GFP/W e l'Alberta Diabetes Institute Islet Core per l'isolamento e la distribuzione delle isole umane. Riconosciamo anche il supporto delle strutture di imaging e citometria a flusso dell'Istituto di Scienze della Vita presso l'Università della British Columbia. La Figura 1 è stata creata con BioRender.com.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
3,3',5-Triiodo-L-tironina (T3)SigmaT6397Ormone tiroideo
4% soluzione di PFASanta Cruz Biotechnologysc-281692Deve essere maneggiato in cappa aspirante
a 96 pozzetti, attacco ultrabasso, fondo piattoCorning Costar (VWR)CLS3474Fondo piatto; per la coltura in sospensione statica nelle ultime tre fasi
AccutaseSTEMCELL Technologies07920Reagente di dissociazione per cellule di stadio 4
Piastre Aggrewell400STEMCELL Technologies34415400 µ piastre per micropozzetti di diametro m
piastre Aggrewell800 STEMCELLTechnologies34815800 µ piastre per micropozzetti di diametro m
Alexa Fluor 488 Capra anti-Umano FOXA2 (capra IgG)R& D SystemsIC2400G1:100 in citometria a flusso; utilizzato per il dosaggio di cellule di stadio 1
Alexa Fluor 488 Controllo dell'isotipo IgG di capraR& D SystemsIC108G1:100 in citometria a flusso
Alexa Fluor 488 Mouse anti-Human SST (topo IgG2B)BD Sciences5660321:250 in citometria a flusso; utilizzato per il dosaggio di cellule allo stadio 7
Alexa Fluor 488 Mouse IgG2B Isotype ControlR& D SystemsIC0041G1:500 in citometria a flusso
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human C-peptide (topo IgG1κ)BD Pharmingen5658311:2.000 in citometria a flusso; utilizzato per il dosaggio di cellule allo stadio 7
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human INS (IgG1κ) di topoBD Sciences5656891:2.000 in citometria a flusso
Alexa Fluor 647 Topo anti-umano NKX6.1 (topo IgG1κ)BD Sciences5633381:33 in citometria a flusso; utilizzato per il saggio di cellule allo stadio 4
Alexa Fluor 647 Mouse anti-Human SOX17 (IgG1κ) di topoBD Sciences5625941:50 in citometria a flusso; utilizzato per il dosaggio di cellule di stadio 1
Alexa Fluor 647 IgG1 di topoκ Controllo isotipicoBD Sciences5577141:50 in citometria a flusso
ALK5i IICayman Chemicals14794Inibitore della segnalazione TGF-beta
Soluzione di risciacquo antiaderente STEMCELL Technologies7010soluzione di risciacquo per micropozzetti
CellvisD35-10-1-NPer GSIS statico e imaging confocale
Albumina sierica bovina (BSA)Thermo Fisher ScientificBP1600-100Per la procedura di immunocolorazione
Anticorpo CK19DAKOM08881:50 in immunofluorescenza a montatura intera
D-glucosioSigmaG8769Integratore medio
DAPISigmaD9542Per controcolorazione nucleare
DMEM/F12, HEPESThermo Fisher Scientific11330032Matrix soluzione diluente
Donkey anti-capra Alexa Fluor 555Life technologiesA214321:500 in immunofluorescenza a montatura intera
Donkey anti-goat Alexa Fluor 647Life technologiesA214471:500 in immunofluorescenza a montatura intera
Asino anti-topo Alexa Fluor 555Life technologiesA315701:500 in immunofluorescenza a montatura intera
Asino anti-topo Alexa Fluor 647Life technologiesA315711:500 in immunofluorescenza a montatura intera
Asino anti-coniglio Alexa Fluor 555Life technologiesA315721:500 in immunofluorescenza a montatura intera
Asino anti-coniglio Alexa Fluor 647Life technologiesA315731:500 in immunofluorescenza a montatura intera
Asino anti-pecora Alexa Fluor 647Life technologiesA214481:500 in immunofluorescenza a montatura intera
DPBSSigmaD8537Senza Ca2+ e Mg2+
ELISA, insulina, umanoAlpco80-INSHU-E01.1Per la misurazione dell'insulina umana
Proliant68700senza acidi grassiIntegratore medio
Kit di soluzioni per la fissazione e la permeabilizzazioneBD Sciences554714Fix/Perm e 10x Perm/Wash incluse
Reagente per dissociazione cellulare delicataSTEMCELL Technologies7174Per il passaggio di grumi di hPSC durante la coltura di mantenimento
Anticorpo glucagoneSigmaG26541:400 in immunofluorescenza a montatura intera
Anticorpo GLUT1Thermo Fisher ScientificPA1-377821:200 in immunofluorescenza a montatura intera
GlutaMAX-I (100x)Gibco35050061integratore di L-glutammina
GlycerolThermo Fisher ScientificG33-4Per la pulizia e il montaggio dei tessuti
GSi XXSigma Millipore565789Inibitore di Notch
EparinaSigmaH3149Integratore medio
ITS-X (100x)Thermo Fisher Scientific51500056Insulin-Transferrina-Selenio-Etanolammina; integratore medio
LDN193189 STEMCELL Technologies72147Antagonista BMP
Anticorpo MAFAAbcamab264051:200 in immunofluorescenza a montatura intera
Matrigel, qualificato hESCThermo Fisher Scientific08-774-552Matrice extracellulare per il rivestimento superficiale dei vasi
MCDB131 mediumLife technologies10372019Base medium
completo per terreni mTeSR1STEMCELL Tecnologie85850terreno di cellule staminali e 5x integratore incluso
N-Cys (N-acetil cisteina)SigmaA9165antiossidante
NaHCO3SigmaS6297Integratore medio
NEUROD1 anticorpoR & D SystemsAF27461:20 in immunofluorescenza a montatura intera
NKX6.1 anticorpoDSHBF55A12-c1:50 in immunofluorescenza a montatura
intera Anticorpo polipeptide pancreaticoR& D SystemsAF62971:200 in immunofluorescenza a montatura intera
PBSSigmaD8662Con Ca2+ e anticorpo Mg2+
PDX1Abcamab472671:200 in immunofluorescenza a montatura intera
PE Topo anti-umano GCG (topo IgG1κ)BD Sciences5658601:2.000 in citometria a flusso; utilizzato per il dosaggio di cellule di stadio 7
PE Topo anti-umano NKX6.1 (IgG1k di topo)BD Sciences5630231:250 in citometria a flusso
PE Topo anti-umano PDX1 (IgG1k di topo)BD Sciences5621611:200 in citometria a flusso; utilizzato per il dosaggio di cellule di stadio 4
PE IgG1 di topoκ Controllo dell'isotipoBD Sciences5546801:2.000 in citometria a flusso
PE Cromogranina A topo-umana (CHGA, IgG1k di topo)BD Sciences5645631:200 in citometria a flusso
R428 Cayman Chemicals21523AXL inibitore della tirosin-chinasi
Acido retinoide, all-transSigmaR2625
Tampone di lisi RIPA fotosensibile, 10xSigma20-188Per l'estrazione ormonale
SANT-1SigmaS4572SHH inibitore
SLC18A1 anticorpoSigmaHPA0637971:200 in immunofluorescenza a montatura intera
Anticorpo somatostatinaSigmaHPA0194721:100 in immunofluorescenza a montatura intera
STEMdiff Kit progenitore pancreatico STEMCELLTechnologies05120Terreni basali e integratori inclusi
Anticorpo sinaptofisinaNovusNB120-166591:25 in immunofluorescenza a montatura intera
Triton X-100SigmaX100Per la permeabilizzazione
Trolox Sigma Millipore648471analogo della vitamina E
TrypLE Enzyme ExpressLife tecnologie12604-021reagente enzimatico per il passaggio di singole cellule hPSC
Anticorpo Trypsin1/2/3R& D SystemsAF35861:25 in immunofluorescenza a montatura intera
Y-27632STEMCELL Technologies72304Inibitore ROCK
Solfato di zincoSigmaZ0251Integratore medio
Camera di saggio della BSA Kit

Riferimenti

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Differenziamento delle cellule betacluster di progenitori pancreaticicoltura in sospensione staticadifferenziamento endocrinosecrezione di insulina stimolata dal glucosiotipi cellulari delle isoleespressione di PDX1espressione di NKX6 1

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