L'istituzione di un modello murino di guarigione dell'orbita di estrazione molare mandibolare

La guarigione dell'alveolo dopo l'estrazione del dente è uno scenario clinico comune, che può causare complicazioni sconvenienti come emorragia dell'orbita, presa secca o persino osteomielite della mascella in caso di guarigione indesiderata ^1,2,3. Queste comorbidità possono compromettere la qualità della vita dei pazienti e, peggio ancora, sfidare in modo vitale la riabilitazione protesica a causa della massiccia perdita ossea⁴. Sebbene le fasi di guarigione dell'alveolo siano state chiarite, sono inadeguate per dirigere l'assistenza clinica post-chirurgia di estrazione dentale quando si incontrano varie sfide prognosi⁴.

Sono stati condotti diversi studi basati su modelli animali per ottenere una migliore comprensione dei meccanismi sottostanti nel processo di guarigione dell'alveolo e prevenire le situazioni di cui sopra. Sp7 è un regolatore principale nella differenziazione degli osteoblasti, svolgendo un ruolo vitale nello sviluppo dello scheletro, nell'emostasi ossea e nella rigenerazione ossea ^5,6. I modelli di guarigione delle prese razionali potrebbero mostrare la ridondanza di Sp7 post-traumatica nella rigenerazione ossea. Inoltre, a differenza della guarigione delle fratture ossee lunghe, solo un singolo processo osteogenico, l'ossificazione intramembranosa, comporta il processo di guarigione della presa di estrazione⁷. Ciò rende il modello di estrazione del dente animale ottimale per lo studio di terapie basate su impianti, poiché l'osteointegrazione dell'impianto obbedisce alla stessa regola osteogenica⁸.

Per decenni, il modello di estrazione dei denti è stato eseguito su ratti, conigli e cani, poiché queste specie hanno denti grandi che sono convenienti per operare su 9,10,11. Tuttavia, date le fiorenti richieste di modificazione genetica e come background genetico più adattabile agli esseri umani, i topi vengono sempre più utilizzati per stabilire un modello di estrazione dei denti. Da quel momento in poi, i ricercatori potrebbero svelare il ruolo di una specifica popolazione cellulare nel processo di guarigione della presa usando topi modificati dal genoma invece di osservare fenotipi solo¹². Tra i modelli di presa per l'estrazione dei denti murini, studi precedenti hanno dimostrato l'istituzione e il processo di guarigione del dente masculare murino e delle prese di estrazione degli incisivi^13,14,15,16. Tuttavia, il modello di guarigione della prognosi e i punti temporali detective e osservativi possono differire tra i protocolli. Questo fa appello a un criterio universale per gli studiosi per stabilire un modello di guarigione della presa murina.

Questo studio mirava a costituire un modello praticabile di guarigione della presa murina per i problemi di cui sopra. I molari della mandibola nei topi hanno tratti morfologici distintivi rispetto ai molari mascellari e agli incisivi, portando vantaggi e svantaggi unici. Poiché i modelli incentrati sulla mandibola murina sono attualmente basati sul vuoto, questo protocollo ha cercato di fornire un metodo compiuto per estrarre il primo molare mandibolare nei topi. Speriamo che questo protocollo illumini i ricercatori di base con nuove idee per scoprire i meccanismi sottostanti della guarigione delle prese e indicare la cura clinica.

Tutte le procedure animali in questo studio sono state esaminate e approvate dal Comitato etico della West China School of Stomatology, Sichuan University (WCHSIRB-D-2017-041). Per il presente studio sono stati utilizzati topi adulti C57BL/6, ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione prechirurgica

1. Preparazione dello strumento
   1. Preparare vari aghi di siringhe monouso (26G, 25G, 23G; vedi Tabella dei materiali) da utilizzare come ascensori. Inflettere la testa dell'ago di circa 20°-40°, come mostrato nella Figura 1.
   2. Preparare pinzette oftalmiche dentate come pinze. Assicurati che si adatti alle dimensioni dei molari dei topi e possa afferrare saldamente i molari. La dimensione ideale della pinzetta è mostrata in Figura 1A, B3.
   3. Procurarsi un elastico (che può essere strappato da un guanto medico in lattice) da utilizzare come apri bocca, un pannello di schiuma o un sughero come piattaforma chirurgica, una lampada frontale per illuminare l'area chirurgica e una piastra riscaldante per il risveglio postoperatorio. Strappare un batuffolo di cotone asciutto in piccoli pezzi e applicarlo al sito chirurgico se si verifica sanguinamento durante la procedura.
2. Preparazione all'anestesia
   1. Il topo può essere anestetizzato da qualsiasi protocollo anestetico adatto che raggiunga l'anestesia generale confermata attraverso il metodo "pizzico del piede". Dopo l'anestesia, applicare un unguento veterinario sugli occhi del topo.
      NOTA: Il protocollo di anestesia generale preferito potrebbe essere: induzione e mantenimento con xilazina (10 mg/kg) e ketamina (100 mg/kg) per via intraperitoneale (IP);
      Per questo studio, l'isoflurano e l'1% di pentobarbital sodico (50 mg/kg, IP) sono stati utilizzati per l'induzione e il mantenimento dell'anestesia con dosi aggiuntive secondo necessità.
3. Preparazione per la disinfezione e la sterilizzazione
   1. Disinfettare la piattaforma operativa e la sostra all'aperto con uno spruzzatore di etanolo al 75%. Prima di ogni procedura del mouse, si raccomanda l'uso di un nuovo set di aghi monouso.
      NOTA: Le pinzette dentate sono riutilizzabili e possono essere sterilizzate utilizzando qualsiasi metodo preferito come la sterilizzazione a vapore.

2. Processo chirurgico

1. Fissazione del topo e della sua mandibola
   1. Legare il mouse a una piattaforma chirurgica in posizione supina usando del nastro adesivo. Appuntare due aghi da 26 G in linea con il piano orbitale dell'orecchio e altri due aghi da 26 G a proprio agio sotto la mandibola.
   2. Applicare l'elastico intorno agli aghi e incrociare gli incisivi per tenere la bocca aperta. Tirare leggermente fuori la lingua e fissarla sotto l'elastico opposto al lato chirurgico, per evitare che ostruisca il campo visivo (Figura 1C).
2. Eliminazione della resistenza distale
   1. Tenere il molare con una pinzetta mesialmente, forzare un ago da 23 G nell'osso alveolare buccale della radice distale e rendere un intervallo.
      NOTA: Questo passaggio deve essere preso con molta cautela, poiché un ago che è incorporato troppo in profondità probabilmente farà scattare la radice.
   2. Quindi, passare a un ago da 25 G per continuare ad espandere l'intervallo e progredire delicatamente verso l'area periapicale mentre si ruota lentamente l'ago in avanti e lingualmente (con la posizione anatomica del topo) per premere la radice fuori dalla fossa alveolare.
3. Eliminazione della resistenza mesiale
   1. Quando c'è abbastanza spazio, utilizzare un ago da 23 G da inserire nella forcella della radice e sollevare occlusalmente il molare. Dopo aver tenuto saldamente il molare, prendere un altro ago da 23 G e forzarlo nella membrana parodontale mesiale linguale per creare un intervallo.
   2. Quindi, sostituire con un ago da 25 G e ruotare lentamente in avanti e buccalmente. Se alcuni ostacoli sottostanti impediscono la lussazione del molare, utilizzare un ago da 26 G per penetrare nell'apice della radice e ripetere le operazioni.
4. Estrazione finale
   1. Estrarre il dente e, durante l'estrazione, assicurarsi che la corona si alzi in alto sopra il piano occlusale e che due radici intatte possano essere chiaramente visibili.
      NOTA: La lussazione (lussazione) del dente è considerata il momento più doloroso e angosciante della procedura. Prima di dislocare il dente, la profondità dell'anestetico deve essere rivalutata utilizzando il test del pizzicamento della punta e, di conseguenza, deve essere somministrata una dose moderata di un agente anestetico, se necessario.
5. Assistenza post-operatoria
   1. Dopo aver estratto il dente, applicare cotone asciutto per fermare il sanguinamento, riposizionare la lingua, somministrare carprofen (5 mg / kg) per via sottocutanea e mettere il topo su una piastra riscaldante a temperatura costante fino al recupero dall'anestesia.

3. Imaging della mandibola del topo e della presa di estrazione

1. Preparazione dei campioni
   1. Eutanasia del topo per dislocazione cervicale. Usa le forbici oftalmiche per tagliare i muscoli dello scheletro attaccati alla mandibola e all'arco zigomatico. Tagliare dalla gola lungo il bordo inferiore della mandibola fino al ramo ascendente e poi alla parte posteriore del condilo, quindi tirare la mandibola verso il basso e tagliare lungo la linea mediana dell'incisivo inferiore. In questo modo, vengono raccolte le due mandibole separate.
   2. Eseguire fissazione, demineralizzazione e disidratazione seguendo la procedura standard¹⁷. Quando incorporate¹⁷, assicuratevi che il piano occlusale sia parallelo al bordo della cassetta (vedere Tabella dei materiali). Fissare la mandibola sul fondo della cassetta, con il bordo inferiore armato (Figura 2).
      NOTA: Questo protocollo offre il piano sagittale dell'area della mandibola.
2. Fissaggio del campione sul microtomo
   1. Regolare il morsetto del campione nel microtomo per sporgere il condilo e il lato della corona di 5°-20° in più, per ottenere un'immagine integrata della polpa della corona concomitante con la polpa della radice (Figura 2).
3. Preparazione delle sezioni
   NOTA: Il condilo è sempre la prima struttura anatomica ad essere tagliata. Quando svanisce, l'area molare può essere tagliata in diverse fette.
   1. Spostare l'intervallo del microtomo a 5 μm, raccogliere ogni otto fette e cercare la dentina nell'ultima fetta. Se la dentina corona appare per la prima volta senza alcuna dentina apicale della radice, regolare il morsetto del campione per far sporgere l'area della radice e viceversa.
4. Raccolta delle sezioni
   NOTA: L'angolo di taglio è appropriato fino a quando la dentina non è ugualmente raggiunta sia nella corona che nell'area apicale.
   1. Tagliare lungo questa direzione e guardare le fette al microscopio fino a quando la polpa dentale appare sia nella corona che nelle radici. Raccogliere le sezioni quando un contorno oscuro di molari appare sulla superficie del campione di paraffina¹⁷.

Per chiarire l'uso pratico di questo metodo, il primo molare mandibolare destro di due topi C57BL / 6 sani (3 mesi, entrambi femmine) è stato estratto e seguito per 1 settimana e 4 settimane, rispettivamente. Le mandibole sinistre non danneggiate sono state utilizzate come controlli sani. La figura 1A mostra le caratteristiche specifiche dell'apparecchio chirurgico, tra cui aghi da 26-23 G e una pinzetta oftalmica dentata. L'ago da 26 G viene rimosso e piegato. L'ago da 25 G è piegato a circa 25° nel punto di riferimento. Gli aghi da 23 G sono il perno dell'intervento chirurgico e sono piegati a circa 25° e 35°, rispettivamente, nel punto di riferimento (Figura 1B1,B2). Le pinzette hanno un dente lungo 1 mm che si adatta alla forma dei molari murini (Figura 1B3). La figura 1C mostra lo stato del topo prima dell'intervento chirurgico. I punti chiave sono la posizione dei quattro perni intorno alla testa e il fissaggio della linguetta sotto l'elastico a sinistra.

La figura 3A mostra la posizione e la morfologia del primo molare mandibolare destro. La figura 3B indica che l'alveolo del dente viene immediatamente riempito con il coagulo post-estrazione. A 1 settimana e 2 settimane, i topi sono stati eutanasizzati, e le mandibole sono state demineralizzate, incorporate nella paraffina17 e sezionate a fette. La Figura 4A mostra il processo di guarigione della presa a 1 settimana. Si formarono alcune ossa trabecolari simili a spugna, ma il coagulo rimase. Nel processo di guarigione a 2 settimane (Figura 4B), la presa era completamente riempita con ossa di spugna, il che significa che la rigenerazione era approssimativamente completata. La colorazione con immunofluorescenza (IF) ha anche confermato i risultati della colorazione istopatologica. Nella Figura 5, la Sp7 è stata ampiamente espressa nelle cellule del midollo osseo, specialmente nel margine, che è il fronte di formazione ossea. Sotto lo stato di omeostasi, le ossa trabecolari erano coerenti e confluenti, con blocchi di cellule del midollo osseo cosparsi come isole. Tuttavia, a 1 settimana dopo l'intervento, numerose cellule che esprimono Sp7 hanno riempito la presa di estrazione, con osso trabecolare appena formato cosparso intorno. A 4 settimane dopo l'intervento chirurgico, la condizione si è invertita e si è trasformata di nuovo in osso trabecolare in gran parte fuso, e l'attività delle cellule che esprimono Sp7 è diminuita a un livello che si avvicina allo stato di omeostasi.

Figura 1: Le immagini degli oggetti degli apparecchi chirurgici e dei topi preparati alla chirurgia. (A) Gli apparecchi chirurgici consistevano principalmente di aghi da 26, 25 e 23 G e una pinzetta dentata. (B) Gli aghi erano piegati al punto preciso a 20°-40° (B1,2). Il dente delle pinzette deve avere una dimensione di circa 1 mm (B3). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Il diagramma di flusso della procedura dall'estrazione del dente al sezionamento. Questa immagine mostra un flusso schematico dall'estrazione del dente al sezionamento. Il primo molare mandibolare destro è stato estratto secondo il protocollo, quindi il topo è stato eutanasia e la mandibola è stata raccolta. Al momento della raccolta, la mandibola è stata immersa in POM al 4% per 24 ore, quindi nuovamente immersa in EDTA al 10%; Il fluido è stato rinnovato ogni giorno per 14 giorni. Successivamente, i campioni sono stati disidratati e incorporati in paraffina seguendo un protocollo universale. Il lato buccale o linguale deve essere rivolto verso il basso, poiché le fette del piano sagittale dovrebbero essere sezionate. Infine, quando si fissa il campione sul morsetto del campione, i lati del condilo e della corona devono essere sporgenti di 5°-20°. Abbreviazioni: POM = paraformaldeide; EDTA = acido etilendiamminamnico tetraacetico. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Immagini stereoscopiche del primo molare mandibolare del topo e della presa di estrazione. (A) Immagine stereoscopica del primo molare mandibolare destro, indicata dalla freccia gialla. (B) L'orbita di estrazione del primo molare mandibolare destro post-operatorio, indicata dalla freccia gialla. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Colorazione H&E. Colorazione H&E della presa di estrazione a (A) 1 settimana e (B) 4 settimane dopo l'intervento. Le frecce gialle indicano il secondo molare mandibolare in prossimità della guarigione della prima presa di estrazione molare. La linea rettangolare tratteggiata indica l'area della presa di estrazione molare di guarigione. Barre scala: 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: Rilevamento di Sp7 tramite colorazione IF. Questa immagine mostra la distribuzione dell'espressione di Sp7 nelle cellule del midollo osseo della mandibola del topo e nell'osso trabecolare circostante in uno stato di omeostasi (controllo sano), rispettivamente 1 settimana e 4 settimane dopo l'intervento. La linea tratteggiata bianca contornava la scala stimata dell'osso trabecolare. Le frecce gialle indicavano le tipiche cellule che esprimono Sp7. Barre della scala: 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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