AMEBaS: estrazione automatica della linea mediana e sottrazione di fondo di time-lapse di fluorescenza raziometrica di singole cellule polarizzate

Summary

Gli attuali metodi per analizzare la dinamica intracellulare delle singole cellule polarizzate sono spesso manuali e mancano di standardizzazione. Questo manoscritto introduce una nuova pipeline di analisi delle immagini per automatizzare l'estrazione della linea mediana di singole cellule polarizzate e quantificare il comportamento spazio-temporale dai time lapse in un'interfaccia online di facile utilizzo.

Abstract

La polarità cellulare è un fenomeno macroscopico stabilito da un insieme di molecole e strutture spazialmente concentrate che culminano nell'emergere di domini specializzati a livello subcellulare. È associato allo sviluppo di strutture morfologiche asimmetriche che sono alla base di funzioni biologiche chiave come la divisione cellulare, la crescita e la migrazione. Inoltre, l'interruzione della polarità cellulare è stata collegata a disturbi legati ai tessuti come il cancro e la displasia gastrica.

I metodi attuali per valutare le dinamiche spazio-temporali dei reporter fluorescenti in singole cellule polarizzate spesso comportano passaggi manuali per tracciare una linea mediana lungo l'asse maggiore delle cellule, che richiede tempo ed è soggetta a forti distorsioni. Inoltre, sebbene l'analisi raziometrica possa correggere la distribuzione irregolare delle molecole reporter utilizzando due canali di fluorescenza, le tecniche di sottrazione di fondo sono spesso arbitrarie e prive di supporto statistico.

Questo manoscritto introduce una nuova pipeline computazionale per automatizzare e quantificare il comportamento spazio-temporale di singole cellule utilizzando un modello di polarità cellulare: crescita del tubo pollinico/peli radicolari e dinamica degli ioni citosolici. È stato sviluppato un algoritmo in tre fasi per elaborare immagini raziometriche ed estrarre una rappresentazione quantitativa delle dinamiche e della crescita intracellulare. Il primo passo segmenta la cella dallo sfondo, producendo una maschera binaria attraverso una tecnica di soglia nello spazio di intensità dei pixel. Il secondo passaggio traccia un percorso attraverso la linea mediana della cella attraverso un'operazione di scheletratura. Infine, la terza fase fornisce i dati elaborati come timelapse raziometrico e produce un kymografo raziometrico (cioè un profilo spaziale 1D nel tempo). Per confrontare il metodo sono stati utilizzati i dati provenienti da immagini raziometriche acquisite con reporter fluorescenti geneticamente codificati da tubi di polline in crescita. Questa pipeline consente una rappresentazione più rapida, meno distorta e più accurata delle dinamiche spazio-temporali lungo la linea mediana delle cellule polarizzate, facendo così progredire il kit di strumenti quantitativi disponibili per studiare la polarità cellulare. Il codice sorgente di AMEBaS Python è disponibile all'indirizzo: https://github.com/badain/amebas.git

Introduction

La polarità cellulare è un processo biologico fondamentale in cui l'azione concertata di un insieme di molecole e strutture spazialmente concentrate culmina nella creazione di domini subcellulari morfologici specializzati^. La divisione, la crescita e la migrazione cellulare si basano su tali siti di polarità, mentre la sua perdita è stata associata al cancro nei disturbi legati al tessuto epiteliale².

Le cellule a crescita apicale sono un esempio drammatico di polarità, in cui il sito di polarità all'apice in genere si riorienta verso i segnali extracellulari³. Questi includono lo sviluppo di neuriti, ife fungine, peli radicali e tubi pollinici, dove più processi cellulari mostrano differenze pronunciate dalla punta della cellula verso lo stinco. Nei tubetti pollinici, in particolare, la polimerizzazione dell'actina, il traffico delle vescicole e le concentrazioni ioniche sono marcatamente polarizzate, mostrando gradienti focalizzati sulla punta⁴. I tubi pollinici sono i gametofiti maschili delle piante da fiore e sono responsabili della consegna degli spermatozoi all'ovulo crescendo esclusivamente all'apice della cellula a uno dei tassi di crescita più rapidi conosciuti per una singola cellula. I gradienti focalizzati sulla punta di ioni come il calcio 5 (Ca²+) e i protoni 6 (H⁺) svolgono un ruolo importante nel sostenere la crescita del tubo pollinico, che è essenziale per svolgere la sua principale funzione biologica che culmina in una doppia fecondazione ^5,6. Pertanto, metodi quantitativi per analizzare le dinamiche spazio-temporali lungo la linea mediana delle cellule in crescita apicale sono essenziali per studiare i meccanismi cellulari e molecolari alla base della crescita polarizzata ^7,8,9. I ricercatori usano spesso i chimografi, cioè una matrice che rappresenta l'intensità dei pixel della linea mediana della cellula (ad esempio, le colonne) nel tempo (ad esempio, le righe), che consente di visualizzare la crescita e la migrazione cellulare in diagonale (Figura 1). Nonostante la loro utilità, i kymografi vengono spesso estratti tracciando manualmente la linea mediana, essendo soggetti a pregiudizi ed errori umani pur essendo piuttosto laboriosi. Ciò richiede un metodo automatizzato di estrazione della linea mediana che è la prima caratteristica della pipeline qui introdotta denominata AMEBaS: un'estrazione automatica dellalinea Ee un'estrazioneBa ckground Sdi time lapse di fluorescenza raziometrica di singole cellule polarizzate.

In termini di procedure sperimentali, l'imaging quantitativo di ioni/molecole/specie di interesse in singole cellule può essere ottenuto con sonde fluorescenti geneticamente codificate¹⁰. Tra le scelte in continua espansione, le sonde raziometriche sono una delle più accurate poiché emettono diverse lunghezze d'onda di fluorescenza quando sono legate/non legate alle molecole di interesse¹¹. Ciò consente di correggere l'eterogeneità spaziale nella concentrazione intracellulare della sonda utilizzando il rapporto di due canali con il loro sfondo specifico del canale sottratto. Tuttavia, stimare la soglia di sfondo per ogni canale e punto temporale può essere un compito complesso poiché spesso varia nello spazio a causa di effetti come l'ombreggiatura, in cui gli angoli dell'immagine hanno variazioni di luminosità rispetto al centro, e nel tempo a causa dello sbiadimento del fluoroforo (fotosbiancamento)¹². Sebbene esistano diversi metodi possibili, questo manoscritto propone di determinare automaticamente l'intensità di fondo utilizzando la soglia di segmentazione ottenuta con l'algoritmo Isodata¹³, che viene poi smussata attraverso i fotogrammi attraverso la regressione polinomiale come standard. Le componenti spaziali derivanti dall'eterogeneità della fluorescenza non correlate alla cellula bersaglio rimossa in¹², tuttavia, sono state ignorate da questo metodo. La soglia automatica può essere eseguita con diversi metodi, ma l'algoritmo Isodata ha prodotto i migliori risultati empiricamente. Pertanto, la sottrazione automatica del valore di fondo e il calcolo raziometrico sono la seconda caratteristica principale di AMEBaS (Figura 1), che, nel suo insieme, riceve come input una pila di immagini di microscopia a fluorescenza a doppio canale, stima la linea mediana della cellula e lo sfondo specifico del canale e produce chimografi di entrambi i canali e del loro rapporto (output principale #1) dopo la sottrazione dello sfondo, il livellamento e la rimozione dei valori anomali. insieme a una pila di immagini raziometriche (Main Output #2).

AMEBaS è stato testato con time lapse di fluorescenza di tubi pollinici di Arabidopsis in crescita ottenuti al microscopio, con sensori raziometrici di Ca²⁺ (CaMeleon)⁸ o pH (pHluorin)⁶ espressi sotto il promotore LAT52 specifico per il polline. Le immagini di ciascun canale sono state scattate ogni 4 secondi accoppiate a un microscopio invertito, una fotocamera frontale illuminata (2560 pixel × 2160 pixel, dimensione pixel 6,45 μm), un illuminatore a fluorescenza e un obiettivo a immersione in acqua 63x, 1,2NA. Le impostazioni dei filtri utilizzati per CaMeleon erano: eccitazione 426-450 nm (CFP) e 505-515 nm (YFP), emissione 458-487 nm (CFP) e 520-550 nm (YFP), mentre per pHluorin, eccitazione 318-390 nm (DAPI) e 428-475 nm (FITC), emissione 435-448 nm (DAPI) e 523-536 nm (FITC). È stato aggiunto un set di dati completo per i test su Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.7975350)¹⁴.

Inoltre, la pipeline è stata testata con i dati dei peli radicolari, dove l'imaging è stato eseguito con un microscopio a foglio luminoso (SPIM) come descritto in precedenza ^15,16 con peli radicali di Arabidopsis che esprimono il reporter Ca²⁺ geneticamente codificato NES-YC3.6 sotto il controllo del promotore UBQ10¹⁷. Il software LabView che controllava l'acquisizione della telecamera, la traslazione del campione e l'otturatore del microscopio a foglio luminoso permetteva l'osservazione dei due canali cpVenus e CFP, ma anche la visualizzazione del loro rapporto in tempo reale. Ogni immagine del rapporto del time-lapse rappresentava una proiezione di massima intensità (MIP) tra le immagini dei canali fluorescenti cpVenus e CFP ottenute da 15 fette del campione distanziate di 3 μm l'una dall'altra. Il rapporto time-lapse cpVenus/CFP dei MIP è stato salvato e utilizzato direttamente per l'analisi AMEBaS.

Sebbene questa pipeline possa funzionare con più tipi di cellule in crescita e in migrazione, è stata specificamente progettata per analizzare le cellule in crescita che crescono esclusivamente all'estremità, come i tubi pollinici, i peli delle radici e le ife fungine, dove c'è una corrispondenza delle regioni citoplasmatiche non in crescita tra i frame. Quando tale corrispondenza non è presente, l'utente deve scegliere l'opzione complete_skeletonization nel passaggio 1.3.1.1 (vedere la sezione Discussione per maggiori dettagli).

Figura 1: Panoramica del flusso di lavoro della pipeline. La pipeline AMEBaS analizza ed elabora i time lapse microscopici in tre fasi principali: segmentazione a cellula singola, tracciamento della linea mediana e generazione del cimografo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Protocol

1. Protocollo interattivo del taccuino

Il notebook Jupyter può essere utilizzato direttamente sul Web utilizzando Google Colab all'indirizzo https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb, dove si basano le istruzioni riportate di seguito. In alternativa, il notebook Jupyter è disponibile all'indirizzo https://github.com/badain/amebas, dove può essere scaricato e configurato per l'esecuzione locale in Jupyter (Anaconda può fornire un processo di installazione semplice e multipiattaforma). I dati completi del test possono essere trovati su Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), contenenti dati a canale singolo e doppio di tubi pollinici di Arabidopsis che esprimono pH o Ca²⁺ reporter¹⁴. La pipeline è stata divisa in parti, dove ogni passaggio può essere eseguito facendo clic sul pulsante di riproduzione dopo aver impostato le opzioni specifiche dell'utente. I file necessari per questo studio sono disponibili nella cartella zip principale di AMEBaS (Supplementary Coding File 1).

1. Aprire Jupyter notebook e leggere i file time-lapse.
   1. Passare alla home page del notebook interattivo in Google Colab di cui sopra oppure scaricare e aprire il notebook AMEBaS_Local.ipynb da GitHub.
   2. Preparare l'impostazione della directory per i dati di input e output:
      1. Se si utilizza la versione locale, posizionare il time-lapse di fluorescenza come file TIFF o DV all'interno di una cartella denominata data che deve trovarsi nella cartella principale del programma. È necessario creare una cartella denominata out per ricevere i dati generati. Eseguire quindi il blocco di codice di installazione.
      2. Se si utilizza il notebook su Google Colab, eseguire il blocco di codice Setup per generare automaticamente i dati e le cartelle out .
   3. Esegui il blocco di codice File Input per leggere i dati del time lapse facendo clic sul pulsante di riproduzione. Se si utilizza la versione Google Colab del taccuino, fare clic sul pulsante Scegli file per caricare direttamente il file time lapse nella cartella dei dati.
      NOTA: Il numero di canali verrà rilevato automaticamente in base alle dimensioni dell'immagine.
   4. Scegli se verranno generati output aggiuntivi di ogni passaggio impostando il parametro 'verbose' su True o False.
2. Rilevare la cella e il segmento principali dallo sfondo (Figura 2).
   1. Esegui il blocco di codice Single Cell Segmentation per separare automaticamente la cella di interesse dallo sfondo facendo clic sul pulsante di riproduzione .
      NOTA: i filtri mediano e gaussiano verranno applicati come fase di pre-elaborazione per rimuovere il rumore indesiderato prima di segmentare il primo piano dallo sfondo mediante la soglia degli isodati e isolare la regione dell'area più grande per rimuovere gli artefatti indesiderati.
      1. Regola il valore sigma utilizzato dalla gaussiana nella variabile 'sigma' per regolare con precisione l'uniformità della maschera di segmentazione. Il valore predefinito è 2.0.
      2. Impostare la stima della variabile su False per archiviare direttamente la soglia stimata da Isodata o su True per uniformarla tra i frame adiacenti utilizzando la regressione polinomiale locale (LOESS). Ottimizza la sua funzione modificando la variabile n_points . Il valore predefinito è 40.
3. Tracciare la linea mediana lungo l'estensione della cella (Figura 3).
   1. Eseguire il blocco di codice Traccia linea mediana cella facendo clic sul pulsante di riproduzione per scheletrare automaticamente la cella utilizzando il metodo¹⁸ di Lee ed estendere la punta dell'ultima ossatura tramite estrapolazione lineare.
      1. Scegli di tracciare la linea mediana solo sull'ultimo fotogramma o una volta per fotogramma regolando l'argomento complete_skeletonization .
         NOTA: quando tutti i fotogrammi sono scheletrati, l'estrapolazione viene ignorata.
      2. Impostare la frazione di punti nell'ossatura da interpolare durante l'estrapolazione regolando la variabile interpolation_fraction . Il valore predefinito è 0,25.
      3. Scegliere la lunghezza dell'estrapolazione della linea mediana modificando la variabile extrapolation_length. Il valore di default è -1, che estende l'ossatura fino allo spigolo più vicino.
4. Generare i kymografi per ogni canale ( Figura 4).
   1. Eseguire il primo blocco di codice di Data Visualization facendo clic sul pulsante di riproduzione per generare automaticamente i kymogrammi per entrambi i canali.
      1. Scegliete la dimensione del kernel gaussiano utilizzato per lo smoothing regolando la variabile kymograph_kernel.
         NOTA: Corrisponde alla dimensione dell'ambiente (in pixel) su cui viene calcolata la media delle intensità dei pixel. Il valore predefinito è 3 x 3 pixel.
      2. Gli scheletri non estesi generano Kymograph limitati che devono utilizzare una mappa dei colori personalizzata per visualizzare correttamente le loro intensità. Scegli la percentuale frazionaria delle intensità che verranno assegnate al colore di sfondo, il nero, regolando la variabile shift_fraction . Il valore predefinito è 0,7.
5. Calcolare il rapporto tra i canali (Figura 5).
   1. Eseguire il secondo blocco di codice di Data Visualization facendo clic sul pulsante di riproduzione per generare automaticamente un kymografo raziometrico e un timelapse raziometrico (Figura 6).
      NOTA: Questo passaggio è disponibile solo quando si utilizzano time lapse a doppio canale. La soglia di intensità di fondo memorizzata al punto 1.2.1.2 viene sottratta da ciascun canale.
      1. Regolare la variabile switch_ratio per cambiare l'ordine dei canali utilizzati come numeratore e denominatore durante i calcoli del rapporto. Il valore predefinito è False.
      2. Scegli se il timelapse del rapporto deve essere ulteriormente smussato con un passaggio di filtro mediano regolando la variabile smooth_ratio . Il valore predefinito è False.
      3. Scegliere se rimuovere i valori anomali prodotti dal segnale basso del canale del denominatore manipolando la variabile reject_outliers . Il valore predefinito è True e definisce i valori anomali come valori pari a 1,5 volte l'intervallo interquartile al di sopra del terzo quartile (in cui si trova il 75% dei valori).
      4. Scegliere se lo sfondo nell'output raziometrico deve essere esportato regolando la variabile background_ratio. Il valore predefinito è False, che lo sostituisce con zeri.

Figura 2: Fase di segmentazione di una singola cella. Le tecniche di elaborazione delle immagini, come il filtraggio, la soglia e l'etichettatura dell'area, vengono utilizzate per isolare il segnale di interesse (passaggio 1.2). Questi dati particolari avevano i seguenti valori per l'intensità più bassa: 2556, la mediana: 3441 e l'intensità massima: 32125. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 3: Panoramica del tracciamento della linea mediana- La linea mediana della singola cella si ottiene calcolando il suo scheletro (bianco). La punta (magenta) viene estrapolata linearmente dagli ultimi punti all'estremità dello scheletro (passaggio 1.3). In questa composizione sia la linea mediana che la sua punta sono sovrapposte alla cella originale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 4: Chimografi di Timelapse - Confronto dei kymografi per ciascun canale generato con 'complete_skeletonization' disattivato (passaggio 1.4). L'asse verticale descrive la progressione del tempo, mentre l'asse orizzontale traccia l'intensità media del percorso estrapolato della linea mediana seguito da una singola cella. Per questi dati particolari, la mappa dei colori rappresenta i seguenti valori per l'intensità più bassa del canale 1: 2886, mediana: 3167, intensità massima: 21021. Canale 2 Intensità più bassa: 3030, Mediana: 3400, Intensità massima: 29688. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 5: Livellamento della soglia di sfondo: la soglia di segmentazione dello sfondo viene stimata tramite l'algoritmo isodata e quindi livellata tramite la regressione polinomiale locale (passaggio 1.5). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 6: Risultati raziometrici- (A) Confronto tra l'ultimo fotogramma del timelapse raziometrico e il primo canale originale segmentato. (B) Kymograph generato dal timelapse raziometrico (passo 1.5). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Protocollo in modalità batch

1. Scaricare e inserire il file pipeline.py dall'archivio GitHub AMEBaS nella stessa directory dei dati.
2. Digitare il percorso del file nella riga di comando dopo il file di programma.
3. Includere - -v come argomento posizionale per mostrare i passaggi interni della pipeline, se lo si desidera.
4. Includere --s da scegliere nel valore sigma utilizzato nella fase di pre-elaborazione del filtro gaussiano in preparazione per la segmentazione delle celle. Il valore predefinito è 2.
5. Includi - -a per tracciare la linea mediana per ogni fotogramma del time lapse. Per impostazione predefinita, la pipeline utilizza solo l'ultimo fotogramma.
6. Includere - -f per scegliere la frazione [0,1] dell'ossatura da utilizzare nell'interpolazione. Il valore predefinito è 0,25.
7. Includi -e per scegliere la lunghezza in pixel dello scheletro estrapolato. Il valore di default è -1, che estende l'ossatura fino allo spigolo più vicino.
8. Includi - -sf per scegliere la frazione della gamma di colori che verrà spostata sullo sfondo nei chimografi non estrapolati. Il valore predefinito è 0,7.
9. Includere - -k per determinare la dimensione del kernel utilizzato nel filtro gaussiano del kymograph. Il valore predefinito è 3.
10. Includere - -eb per stimare l'intensità della soglia di sfondo globale tramite la regressione polinomiale LOESS delle intensità di soglia di sfondo specifiche del fotogramma.
    1. Personalizzare il numero di punti utilizzati nello smoothing LOESS dei valori di soglia di sfondo modificando il parametro - -n. Il valore predefinito è 40.
11. Cambia i canali utilizzati come numeratore e denominatore durante i calcoli del rapporto, inclusi - r o - -switch_ratio, se il timelapse ha due canali. Per impostazione predefinita, il secondo canale è il numeratore e il primo è il denominatore.
12. Scegli se il timelapse del rapporto deve essere ulteriormente smussato con un passaggio del filtro mediano con l'argomento - -sm . Il valore predefinito è False.
13. Includi -o per rifiutare i pixel con intensità anomale durante la generazione del time-lapse raziometrico.
14. Scegli se lo sfondo nell'output raziometrico deve essere esportato usando l'argomento - -b. Il valore predefinito è False, che lo sostituisce con zeri.
15. Premere Invio per eseguire. L'output verrà generato nella stessa directory del file di programma.

Results

La pipeline AMEBaS automatizza l'estrazione della dinamica della linea mediana di singole cellule polarizzate dalle pile di immagini al microscopio a fluorescenza, rendendola meno dispendiosa in termini di tempo e meno soggetta a errori umani. Il metodo quantifica questi intervalli di tempo generando chimografi e pile di immagini raziometriche (Figura 1) in singole cellule in crescita. Può essere regolato per lavorare sulla migrazione di singole cellule, ma sono necessari ulteriori esperimen...

Discussion

Il nuovo metodo qui presentato è un potente strumento per semplificare e automatizzare l'analisi delle pile di immagini al microscopio a fluorescenza di cellule polarizzate. I metodi attuali descritti in letteratura, come i plug-in ImageJ Kymograph, richiedono il tracciamento manuale della linea mediana della cella polarizzata di interesse, un compito che non solo richiede tempo ma è anche soggetto a errori umani. Poiché la definizione della linea mediana in questa pipeline è supportata da un metodo numerico

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Github	Github		https://github.com/badain/amebas
Google Colab	Google		https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb