AMEBaS: estrazione automatica della linea mediana e sottrazione di fondo di time-lapse di fluorescenza raziometrica di singole cellule polarizzate

Summary

Gli attuali metodi per analizzare la dinamica intracellulare delle singole cellule polarizzate sono spesso manuali e mancano di standardizzazione. Questo manoscritto introduce una nuova pipeline di analisi delle immagini per automatizzare l'estrazione della linea mediana di singole cellule polarizzate e quantificare il comportamento spazio-temporale dai time lapse in un'interfaccia online di facile utilizzo.

Abstract

La polarità cellulare è un fenomeno macroscopico stabilito da un insieme di molecole e strutture spazialmente concentrate che culminano nell'emergere di domini specializzati a livello subcellulare. È associato allo sviluppo di strutture morfologiche asimmetriche che sono alla base di funzioni biologiche chiave come la divisione cellulare, la crescita e la migrazione. Inoltre, l'interruzione della polarità cellulare è stata collegata a disturbi legati ai tessuti come il cancro e la displasia gastrica.

I metodi attuali per valutare le dinamiche spazio-temporali dei reporter fluorescenti in singole cellule polarizzate spesso comportano passaggi manuali per tracciare una linea mediana lungo l'asse maggiore delle cellule, che richiede tempo ed è soggetta a forti distorsioni. Inoltre, sebbene l'analisi raziometrica possa correggere la distribuzione irregolare delle molecole reporter utilizzando due canali di fluorescenza, le tecniche di sottrazione di fondo sono spesso arbitrarie e prive di supporto statistico.

Questo manoscritto introduce una nuova pipeline computazionale per automatizzare e quantificare il comportamento spazio-temporale di singole cellule utilizzando un modello di polarità cellulare: crescita del tubo pollinico/peli radicolari e dinamica degli ioni citosolici. È stato sviluppato un algoritmo in tre fasi per elaborare immagini raziometriche ed estrarre una rappresentazione quantitativa delle dinamiche e della crescita intracellulare. Il primo passo segmenta la cella dallo sfondo, producendo una maschera binaria attraverso una tecnica di soglia nello spazio di intensità dei pixel. Il secondo passaggio traccia un percorso attraverso la linea mediana della cella attraverso un'operazione di scheletratura. Infine, la terza fase fornisce i dati elaborati come timelapse raziometrico e produce un kymografo raziometrico (cioè un profilo spaziale 1D nel tempo). Per confrontare il metodo sono stati utilizzati i dati provenienti da immagini raziometriche acquisite con reporter fluorescenti geneticamente codificati da tubi di polline in crescita. Questa pipeline consente una rappresentazione più rapida, meno distorta e più accurata delle dinamiche spazio-temporali lungo la linea mediana delle cellule polarizzate, facendo così progredire il kit di strumenti quantitativi disponibili per studiare la polarità cellulare. Il codice sorgente di AMEBaS Python è disponibile all'indirizzo: https://github.com/badain/amebas.git

Introduction

La polarità cellulare è un processo biologico fondamentale in cui l'azione concertata di un insieme di molecole e strutture spazialmente concentrate culmina nella creazione di domini subcellulari morfologici specializzati^. La divisione, la crescita e la migrazione cellulare si basano su tali siti di polarità, mentre la sua perdita è stata associata al cancro nei disturbi legati al tessuto epiteliale².

Le cellule a crescita apicale sono un esempio drammatico di polarità, in cui il sito di polarità all'apice in genere si riorienta verso i segnali extracellulari³. Questi i....

Protocol

1. Protocollo interattivo del taccuino

Il notebook Jupyter può essere utilizzato direttamente sul Web utilizzando Google Colab all'indirizzo https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb, dove si basano le istruzioni riportate di seguito. In alternativa, il notebook Jupyter è disponibile all'indirizzo https://github.com/badain/amebas, dove può essere scaricato e configurato per l'esecuzione locale in Jupyter (Anaconda può fornire un processo di installazione semplice e multipiattaforma). I dati completi del test possono essere trovati su Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350), co....

Results

La pipeline AMEBaS automatizza l'estrazione della dinamica della linea mediana di singole cellule polarizzate dalle pile di immagini al microscopio a fluorescenza, rendendola meno dispendiosa in termini di tempo e meno soggetta a errori umani. Il metodo quantifica questi intervalli di tempo generando chimografi e pile di immagini raziometriche (Figura 1) in singole cellule in crescita. Può essere regolato per lavorare sulla migrazione di singole cellule, ma sono necessari ulteriori esperimen.......

Discussion

Il nuovo metodo qui presentato è un potente strumento per semplificare e automatizzare l'analisi delle pile di immagini al microscopio a fluorescenza di cellule polarizzate. I metodi attuali descritti in letteratura, come i plug-in ImageJ Kymograph, richiedono il tracciamento manuale della linea mediana della cella polarizzata di interesse, un compito che non solo richiede tempo ma è anche soggetto a errori umani. Poiché la definizione della linea mediana in questa pipeline è supportata da un metodo numerico

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Github	Github		https://github.com/badain/amebas
Google Colab	Google		https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb