Le cellule metaplastiche pancreatiche sono precursori di cellule maligne che danno origine ai tumori pancreatici. Tuttavia, isolare le cellule pancreatiche vitali intatte è difficile. Qui presentiamo un metodo efficiente per la dissociazione del tessuto pancreatico. Le cellule possono quindi essere utilizzate per il sequenziamento di RNA a singola cellula (scRNA-seq) o per la co-coltura bi- o tridimensionale.
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Articolo metodologico
Dissezione del tessuto pancreatico per isolare singole cellule vitali
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il pancreas comprende due sistemi principali: il sistema endocrino, che produce e secerne ormoni, e il sistema esocrino, che rappresenta circa il 90% del pancreas e comprende cellule che producono e secernono enzimi digestivi. Gli enzimi digestivi sono prodotti nelle cellule acinose pancreatiche, immagazzinate in vescicole chiamate zimogeni, e vengono quindi rilasciati nel duodeno attraverso il dotto pancreatico per avviare i processi metabolici. Gli enzimi prodotti dalle cellule acinari possono uccidere le cellule o degradare l'RNA privo di cellule. Inoltre, le cellule acinari sono fragili e i comuni protocolli di dissociazione si traducono in un gran numero di cellule morte e proteasi e RNasi prive di cellule. Pertanto, una delle maggiori sfide nella digestione del tessuto pancreatico è il recupero di cellule intatte e vitali, in particolare cellule acinose. Il protocollo presentato in questo articolo mostra un metodo in due fasi che abbiamo sviluppato per soddisfare questa esigenza. Il protocollo può essere utilizzato per digerire la pancreata normale, la pancreata che include lesioni pre-maligne o i tumori pancreatici che includono un gran numero di cellule stromali e immunitarie.
Introduzione
L'adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è uno dei tipi di cancro più aggressivi1. L'evidenza clinica supporta l'idea che il PDAC si sviluppi da cellule del sistema esocrino, comprese le cellule acinari, nel corso di molti anni, guidate da mutazioni nel proto-oncogeneKRAS 2.
I tumori del pancreas comprendono molti tipi di cellule diverse ed è stato dimostrato che le cellule maligne contano solo per il 20%-50% della massa tumorale3. Diversi tipi di cellule interagiscono con le cellule epiteliali, supportano la loro trasformazione e migliorano la formazione e la cresci....
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Protocollo
Il comitato etico congiunto (Institutional Animal Care and Use Committee) dell'Università Ebraica (Gerusalemme, Israele) e dell'Hadassah Medical Center (Gerusalemme, Israele) ha approvato il protocollo di studio per il benessere degli animali (MD-18-15417-5 "Dinamica tissutale nel cancro del pancreas nei topi") e il protocollo qui presentato è conforme a tutte le normative etiche pertinenti per la sperimentazione e la ricerca sugli animali. L'Università Ebraica è un istituto accreditato a livello internazionale per la valutazione e l'accreditamento della cura degli animali da laboratorio.
NOTA: Il ceppo di topo #007908, il ceppo #019378 e i....
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Risultati
In un lavoro5 pubblicato di recente, abbiamo applicato il protocollo sopra descritto per esplorare le prime fasi dello sviluppo di PDAC utilizzando un modello murino. Il topo è stato geneticamente modificato per includere le cassette Ptf1a-CreER, LSL-Kras-G12D, LSL-tdTomato7, che consentono l'espressione di KRAS costitutivamente attivo nelle cellule acinari dopo l'iniezione di tamoxifene.
Dopo la luss.......
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Discussione
In questo articolo presentiamo un protocollo per la dissociazione del tessuto pancreatico. Il protocollo è semplice, facile da usare e fornisce uno strumento per isolare singole cellule vitali dal tessuto pancreatico in diverse fasi del processo di malignità, compresi i tumori solidi. In studi precedenti, diversi tipi di collagenasi sono stati utilizzati per digerire il pancreas 8,9. L'uso di una collagenasi molto potente, come la collagenasi D, si traduce in una.......
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Dichiarazioni
Gli autori dichiarano di non avere interessi contrastanti.
Ringraziamenti
Vorremmo ringraziare il Dr. Avital Sarusi-Portuguez per l'aiuto nell'analisi dei dati e il Dr. Dror Kolodkin-Gal per l'assistenza nello stabilire il protocollo in uno studio precedente. Ringraziamo tutti i membri passati e presenti del laboratorio Parnas. Ringraziamo la Dott.ssa Gillian Kay e il Dott. Michael Kanovsky per il loro aiuto nell'editing. Questo progetto ha ricevuto finanziamenti dalla sovvenzione della Israel Science Foundation (n. 526/18 O.P.), dal programma Alex U. Soyka e da una sovvenzione dell'Israel Cancer Research Fund (Research Career Development Award).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Reagente o risorsa | |||
| 70 µ m maglia di nylon | Corning | cat##431751 | |
| BSA | Sigma Aldrich | cat# A7906 | |
| Collagenase P | Roche | cat# 11213857001 | |
| Critical Commercial Assay | |||
| DAPI | Sigma Aldrich | cat#MBD0015 | |
| Dnase I | Roche | cat# 10104159001 | |
| Modelli sperimentali: Organismi/ Ceppi | |||
| Fetale Siero Bovino Sud America | ThermoFisher | Gatto#10270106 | |
| Hanks' Soluzione salina bilanciata | Industrie biologiche | gatto#02-018-1A | |
| KRASLSL-G12D Jackson | Laboratory | JAX008179 | |
| Kit per la rimozione delle cellule morte MACS Kit per la rimozione delle cellule morte | Milteny Biotec | #130-090-101 | |
| PBS | Industrie biologiche | cat#02-023-1A | |
| Ptf1a-CreER topi | Jackson Laboratory | JAX019378 | |
| Ptf1a-CreER; Rosa26LSL-tdPomodoro topi | Jackson Laboratory | JAX007908 | |
| Tripsina C-EDTA 0.05% | Industrie biologiche | cat# 03-053-1A | |
| Tripsina inibitore | Roche cat#T6522 |
Riferimenti
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2019. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 69 (1), 7-34 (2019).
- Yachida, S., et al. Distant metastasis occurs late during the genetic evolution of pancreatic cancer. Nature. 467 (7319), 1114-1117....
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Ristampe e permessi
