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Nell'ultimo decennio, c'è stato un aumento di interesse nell'applicazione della microscopia Raman coerente (CRM) all'imaging di cellule e tessuti 1,2. Il CRM è una potente tecnica di imaging chimico con due varianti popolari: la microscopia coerente anti-scattering Raman di Stokes (CARS) e la microscopia a diffusione Raman stimolata (SRS). La SRS è sempre più popolare rispetto alle CARS perché è meno influenzata dall'interferenza di fondo non Raman e ha una dipendenza lineare dalla concentrazione3. Il CRM acquisisce informazioni sulle vibrazioni molecolari in modo simile alla spettroscopia Raman, ma offre una velocità di acquisizione significativamente migliorata4. Ciò si ottiene mediante un'eccitazione vibrazionale coerente attraverso una coppia di laser pulsati ad alta intensità di picco. Poiché il CRM fornisce una mappatura chimica spazialmente risolta ad alta risoluzione spaziale e temporale, ha trovato importanti applicazioni nella diagnosi del cancro, nel metabolismo dei lipidi, nel metabolismo cellulare, nel trasporto di farmaci e in molti altri 5,6,7,8. Tuttavia, uno dei principali colli di bottiglia che ostacola l'adozione diffusa della tecnica è la sua complessità tecnica e la mancanza di protocolli standardizzati. Sebbene i laser e i microscopi commerciali siano già disponibili, quasi tutti i sistemi attualmente utilizzati nel campo prevedono vari livelli di personalizzazione di laser, ottiche, microscopi e rivelatori, il che crea una barriera significativa per i ricercatori interessati ad entrare nel campo o ad adottare questa tecnologia. La mancanza di accesso ostacola ulteriormente le applicazioni biologiche. Lo scopo di questa raccolta di metodi è quello di fornire esempi dettagliati e indicazioni sulla strumentazione, sui nuovi approcci di imaging e sulle applicazioni di imaging cellulare o tissutale in vitro/in vivo. Abbiamo incluso sette pubblicazioni di esperti del settore che sono riassunte qui.
Clark et al. presentano un confronto fianco a fianco di SRS iperspettrale e CARS in termini di sensibilità, risoluzione spaziale e risoluzione spettrale9. Entrambe le tecniche sono implementate con la focalizzazione spettrale dei laser a femtosecondi, un approccio comunemente impiegato che utilizza i laser a femtosecondi a banda larga con chirping spettrale per ottenere una risoluzione Raman a banda stretta. Un confronto diretto consente la valutazione delle differenze di rilevamento e la selezione ottimale della modalità per le diverse applicazioni di imaging chimico.
De la Cadena et al. pubblicano un nuovo metodo SRS multiplex in grado di acquisire rapidamente immagini SRS a banda larga10. La tecnica si basa su un rilevamento differenziale personalizzato dell'amplificatore lock-in multicanale, che consente il rilevamento di un massimo di 32 canali contemporaneamente. Inoltre, viene mostrata una caratterizzazione dettagliata del rumore e viene dimostrato un metodo di rilevamento bilanciato per eliminare il rumore laser. Questo protocollo fornisce una guida pratica per gli utenti interessati alla creazione di sistemi SRS multiplex.
Shi et al. dimostrano l'uso di coloranti Raman altamente multiplex nell'imaging SRS11. Con il miglioramento della pre-risonanza, dimostrano che la SRS potrebbe fornire una sensibilità paragonabile all'immunofluorescenza standard. Questo metodo elude il limite dei canali risolvibili spettralmente nell'immunofluorescenza convenzionale e consente il monitoraggio di molte proteine contemporaneamente e lo studio delle loro interazioni. Viene fornita una guida dettagliata sull'elaborazione del campione e sulla colorazione del colorante Raman per facilitare l'adozione di questo potente metodo.
Miao et al. presentano l'imaging vibrazionale del tessuto gonfio e l'analisi (VISTA), una tecnica di imaging a super-risoluzione che combina SRS con microscopia ad espansione12. VISTA aggira gli ostacoli associati all'imaging fluorescente e raggiunge l'imaging volumetrico a super-risoluzione label-free in campioni biologici con risoluzione spaziale fino a 78 nm. Sfruttano inoltre un algoritmo di deep learning per ottenere una segmentazione multicomponente, compresi gli aggregati proteici nelle cellule e nei tessuti cerebrali.
Espinoza et al. presentano l'uso dell'imaging SRS a due colori in tempo reale di proteine e lipidi per applicazioni diagnostiche tissutali13. L'imaging SRS a due colori può generare immagini equivalenti a H&E per applicazioni patologiche. Questo protocollo descrive i dettagli dell'implementazione di una tecnica di modulazione ortogonale e della focalizzazione spettrale per l'imaging SRS simultaneo a due colori. La conversione di immagini SRS a due colori in immagini pseudo-H&E è stata dimostrata anche con tessuto cerebrale di topo per illustrare le applicazioni di diagnosi tissutale.
Yuan et al. pubblicano un sistema di camere flessibili per l'imaging SRS a lungo termine di cellule vive14. La maggior parte delle camere di osservazione esistenti su cellule vive sono progettate per l'imaging in campo chiaro e a fluorescenza. Sono incompatibili con il rilevamento SRS a causa del requisito di un obiettivo e di un condensatore ad alto NA. Gli autori dimostrano l'imaging SRS time-lapse 24 ore su 24 con la camera flessibile, che mantiene costanti temperatura, CO2 e umidità.
Infine, Wu et al. dimostrano la fluorescenza simultanea in vivo a due fotoni (TPEF) e l'imaging SRS15. Due sistemi laser separati vengono combinati per ottenere una sensibilità ottimale per entrambe le modalità di imaging e fornire informazioni complementari. In vivo L'imaging SRS dei tessuti presenta sfide uniche a causa della necessità di epi-rilevamento della luce depolarizzata e retrodiffusa. Questo protocollo discute i dettagli della configurazione ottimale di un microscopio TPEF-SRS e come può essere utilizzato per l'imaging in vivo del midollo spinale del topo.
Questa raccolta di pubblicazioni rappresenta l'attuale stato dell'arte della strumentazione CRM e i progressi tecnici. I ricercatori interessati sia allo sviluppo di metodi che alle applicazioni troveranno questa raccolta utile per confrontare le configurazioni e stabilire parametri di riferimento (sensibilità, risoluzione, ecc.) per la costruzione o l'ottimizzazione dei propri sistemi. Le linee guida e le migliori pratiche fornite in questi protocolli informeranno le applicazioni in vitro e in vivo esistenti e future. L'adozione su larga scala della tecnologia CRM attende ancora applicazioni chiave e innovative e la commercializzazione di soluzioni CRM complete. Ciononostante, la standardizzazione degli approcci di imaging e dei benchmark è essenziale per garantire la riproducibilità e l'affidabilità e facilitare un'implementazione più ampia di CRM16.
Il campo del CRM sta crescendo a una velocità elevata. Gli sviluppi tecnici che spingono la sensibilità, la specificità e il limite di risoluzione continuano a spingere la tecnologia in nuovi territori. Ad esempio, la risoluzione spaziale di SRS sta iniziando a superare il limite di diffrazione17,18. La sensibilità della SRS elettronica di pre-risonanza si sta ora avvicinando a quella della fluorescenza19. Rispetto alla fluorescenza, il CRM presenta vantaggi distinti. Ad esempio, l'uso del tracciamento del deuterio ha permesso per la prima volta lo studio in vivo della dinamica metabolica di piccole molecole a risoluzione subcellulare20. Con tag di piccole dimensioni, è possibile eseguire il rilevamento Raman altamente multiplexato di 24 o più bersagli etichettati21. I progressi nell'intelligenza artificiale abilitano nuove funzionalità per il CRM sfruttando il suo elevato contenuto informativo e le funzionalità specifiche molecolari per segmentare e classificare gli oggetti con sottili differenze di caratteristiche spaziali e spettrali22. Insieme, questi progressi tecnici nel CRM sono pronti ad accelerare e ampliare le applicazioni nell'imaging sia biologico che biomedico.