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Articolo metodologico

Misurazione della cinetica del tessuto adiposo in vivo nell'uomo utilizzando l'approccio di marcatura del deuterio (2ore)

718 visualizzazioni

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DOI:

10.3791/64883

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21 luglio 2023

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1Pennington Biomedical Research Center, Louisiana State University System, 2University of California at Berkeley

In questo articolo

Sommario

Di seguito viene presentato un protocollo per misurare la cinetica del tessuto adiposo in vivo nell'uomo utilizzando il metodo di marcatura con deuterio (2H).

Abstract

Il tessuto adiposo bianco è un organo altamente plastico necessario per mantenere l'omeostasi energetica di tutto il corpo. La massa del tessuto adiposo e i cambiamenti nella massa o distribuzione del grasso sono regolati da cambiamenti nella sintesi e nella scomposizione (cioè nel turnover) delle cellule adipose e dei triacilgliceroli. L'evidenza suggerisce che il modo e l'entità dell'espansione del tessuto adiposo sottocutaneo (cioè ipertrofia vs. iperplasia) e il turnover possono influenzare la salute metabolica, poiché l'adipogenesi è stata implicata nella patogenesi dell'obesità e delle malattie correlate. Nonostante il potenziale ruolo del turnover adiposo nella salute umana, c'è una mancanza di conoscenza sulla cinetica in vivo delle cellule adipose. Ciò è dovuto, in parte, al lento tasso di turnover delle cellule nel tessuto adiposo e alla complessità pratica di marcare direttamente i loro precursori metabolici in vivo. In questo articolo, descriviamo i metodi per misurare la cinetica adiposa in vivo e i tassi di turnover nell'uomo attraverso il consumo di acqua marcata con deuterio (2H). L'incorporazione di 2H nelle frazioni desossiribonucleotidiche del DNA nei pre-adipociti e negli adipociti fornisce una misura accurata della formazione e della morte cellulare (turnover adiposo). Nel complesso, si tratta di un approccio innovativo alla misurazione della cinetica adiposa in vivo e rappresenta un sostanziale allontanamento da altre valutazioni in vitro .

Introduzione

L'obesità è una malattia caratterizzata da un eccesso di tessuto adiposo bianco (AT) ed è un fattore di rischio significativo per lo sviluppo del diabete di tipo II e delle malattie cardiovascolari1. L'AT bianco è un organo altamente plastico che immagazzina energia sotto forma di trigliceridi (TG) ed è essenziale per l'omeostasi metabolica2. L'AT bianco mantiene la capacità di espandersi, ridursi e rimodellarsi durante l'età adulta3 e la massa dell'AT è determinata da cambiamenti dinamici nel volume degli adipociti (tramite sintesi e degradazione dei TG), dalla formazione continua di adipociti attraverso la proliferazione e la differenziazione dei pre-adipociti (cioè iperplasia o adipogenesi) e dalla morte delle cellule adipose4.

L'evidenza suggerisce che esiste un legame importante tra il turnover sottocutaneo dell'AT (ad esempio, la formazione e la morte degli adipociti) e la salute cardiometabolica 5,6,7,8, e il ruolo dell'adipogenesi nella patogenesi dei disturbi correlati all'obesità rimane discutibile4. Tuttavia, si sa poco sul turnover dell'AT in vivo nell'uomo a causa, in parte, del lento tasso di turnover dei componenti cellulari dell'AT e della complessità di marcare direttamente i loro precursori metabolici in vivo. Sebbene i metodi in vitro abbiano fornito alcune informazioni, questi approcci non forniscono una valutazione completa in vivo all'interno dell'ambiente naturale dell'AT.

Il laboratorio Hellerstein9 ha sviluppato un metodo per valutare il turnover dell'AT in vivo utilizzando l'incorporazione dell'isotopo stabile deuterio (2H) dall'acqua pesante (2H2O) nell'AT (Figura 1)10. Il protocollo, che è stato convalidato nei topi e nell'uomo, include un aumento iniziale di 2H2O per aumentare l'arricchimento di 2H dell'acqua corporea, seguito da un'adeguata assunzione giornaliera per mantenere valori di arricchimento stabili e vicini al plateau. Il 2H del 2H2O (cioè l'acqua pesante) è incorporato nella porzione desossiribosio (dR) dei desossiribonucleotidi nel DNA delle cellule adipose e l'arricchimento isotopico è misurato nel DNA tramite spettrometria di massa e l'applicazione dell'analisi della distribuzione isotopomera di massa (MIDA)9,10,11. La marcatura della porzione desossiribosica dei desossiribonucleotidi purinici nel DNA con precursori di isotopi stabili presenta diversi vantaggi rispetto ai metodi precedenti, come quelli che prevedevano la marcatura con porzioni di basi nucleotidiche pirimididiche (ad esempio, da 3H-timidina o bromo-deossiuridina). Da notare che la reincorporazione endogena delle basi, specialmente per le pirimidine, ma non per il dR, nel DNA replicante ha precedentemente confuso l'interpretazione dell'incorporazione dell'etichetta12. Inoltre, l'incorporazione di un'etichetta di isotopi stabili in dR non provoca genotossicità, a differenza dell'incorporazione di agenti radioattivi o genotossici come il 3H (trizio) o la bromo-deossiuridina. Pertanto, l'uso a lungo termine di questa tecnica nei modelli animali e nell'uomo è sicuro.

La misurazione della sintesi di DNA marcata con 2H denota il passaggio di una cellula attraverso la fase S della divisione cellulare e identifica i pre-adipociti e gli adipociti di nuova formazione (tramite la differenziazione pre-adipocitaria) o adipogenesi13. Le cellule che subiscono un rapido turnover (ad esempio, i monociti) sostituiscono rapidamente il loro DNA e raggiungono un plateau nell'arricchimento 2H, fornendo così un riferimento interno per il saggio. Il rapporto tra l'arricchimento di 2H del DNA delle cellule adipose e quello dei monociti (cellule di riferimento) o la misurazione del corpo integrato 2H2O consente il calcolo della frazione di cellule adipose di nuova sintesi. In questo documento, questo protocollo descrive i metodi per misurare i tassi di turnover delle cellule adipose (adipogenesi) in vivo nell'uomo tramite il protocollo di marcatura metabolica 2H, comprese tecniche raffinate per purificare gli adipociti tramite selezione immunitaria negativa e per arricchire la popolazione pre-adipocitaria14.

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Protocollo

L'Institutional Review Board (IRB) del Pennington Biomedical Research Center ha approvato tutte le procedure (#10039-PBRC) e tutti i soggetti umani hanno dato il consenso informato scritto.

1. Otto settimane 2ore2O-marcature

  1. Somministrare aliquote di acqua marcata con deuterio al 70% o al 99,9% (2H2O) in contenitori di plastica sterili.
  2. Istruire i partecipanti a bere dosi da 35 ml di 2H2O arricchite al 99,9% o dosi da 40 ml di 2H2O arricchite al 70% tre volte al giorno nella settimana 1 (periodo di priming) e di bere due dosi da 35 ml o 50 ml, rispettivamente, al giorno nelle settimane 2-8.
    NOTA: Vertigini transitorie o vertigini sono gli unici effetti avversi noti dell'assunzione di 2H2O e sono correlati a rapidi cambiamenti nel flusso d'acqua di massa, che vengono percepiti dai follicoli piliferi dell'orecchio interno. Quindi, istruire i partecipanti a prendere le dosi ad almeno ~2 ore di distanza per evitare il raro verificarsi di vertigini transitorie o vertigini15. Per lo stesso motivo, non compensare le dosi dimenticate raddoppiando una singola dose. La somministrazione della dose come descritto sopra (separata da ≥2 ore) rende questo effetto avverso estremamente raro nei soggetti umani (<1% di diverse centinaia di soggetti).
  3. Monitorare il rispetto dell'assunzione di 2H2O attraverso la raccolta delle urine per misurare l'arricchimento di 2H nell'acqua corporea e anche con il ritorno settimanale delle fiale vuote per il conteggio.
    1. Pulire i campioni di urina utilizzando carbone attivo e un filtro.
      1. Aggiungere 8 ml di urina in una provetta da 10 ml con 1 ml di carbone attivo.
      2. Posizionare il campione su un bilanciere per 10 minuti e centrifugare per 5 minuti a 800 x g in modo che il carbone si sposti sul fondo della provetta. Filtrare il campione con un filtro per siringa da 0,2 μm.
    2. Misurare l'arricchimento di 2H2O nell'acqua corporea (urina) mediante spettrometria di massa isotopica (IRMS).
      NOTA :L'arricchimento 2 H2O può essere analizzato con diversi metodi, tra cui gascromatografia-spettrometria di massa16, analizzatore elementare a conversione ad alta temperatura (TC/EA) accoppiato con IRMS17, spettroscopia infrarossa IRIS (Cavity Ring-Down Infrared Spectros)18 o con un H/Device collegato a uno spettrometro di massa (ad esempio, IRMS)19.
    3. Utilizzare gli arricchimenti medi di 2H2O misurati nelle urine durante il periodo di marcatura di 8 settimane per calcolare l'esposizione al precursore 2H2O e la frazione di cellule AT di nuova sintesi (vedere paragrafi 7 e 8 di seguito).

NOTA: Il protocollo di marcatura 2H2O mantiene l'arricchimento di 2H nell'acqua corporea nell'intervallo 1,0%-2,5% per la durata del periodo di marcatura di 8 settimane (Figura 2)10.

2. Raccolte di biopsia del tessuto adiposo da soggetti umani

  1. Dopo aver pulito la pelle con una soluzione di iodio povidone, somministrare l'anestesia topica (ad es. 2% lidocaina/0,5% bupivacaina), praticare un'incisione di ~0,75 cm nella pelle e raccogliere biopsie AT sottocutanee tramite la tecnica della lipoaspirazione con ago in condizioni sterili13.
  2. Pesare una provetta sterile da 50 mL contenente 5 mL di tampone HEPES 1 M a temperatura ambiente (RT), pH 7,3. Posizionare immediatamente l'AT nella provetta con il tampone HEPES per la lavorazione.
  3. Pesare la provetta da 50 ml contenente l'AT e registrare il peso.

3. Isolamento degli adipociti purificati

  1. Aggiungere una soluzione di collagenasi/HEPES di tipo 1 (2 mg/mL) a 2 g/mL di AT.
  2. Digerire l'AT incubandolo a bagnomaria agitando (100 giri/min) per 1 ora a 37 °C fino a ottenere una miscela omogenea con alcuni pezzi grandi e intatti di AT.
  3. Centrifugare la provetta a 500 x g per 8 minuti a RT per separare gli adipociti e la frazione stromale-vascolare (SVF).
  4. Rimuovere delicatamente lo strato di grasso superiore (adipociti) e trasferirlo in una provetta separata. Non rompere il pellet (SVF) sul fondo del tubo.
  5. Come descritto in precedenza14, purificare gli adipociti utilizzando la separazione cellulare immunomagnetica.
    NOTA: Questo passaggio importante viene eseguito per "pulire" gli adipociti, poiché altri tipi di cellule con un rapido ricambio cellulare, comprese le cellule ematopoietiche, endoteliali e staminali, possono aderire agli adipociti fluttuanti e influire sulle misurazioni.
    1. Inserire ~400 μL di adipociti in una provetta da 5 mL per l'immunopurificazione negativa.
    2. Aggiungere l'anticorpo bloccante FcR (100 μL/mL).
    3. Aggiungere un cocktail di anticorpi biotinilati contro i marcatori delle cellule endoteliali (anti-umano CD31; 1:100), delle cellule ematopoietiche (anti-umano CD45; 1:400) e delle cellule staminali mesenchimali (anti-umano CD34; 1:100) alla soluzione di adipociti per 15 minuti a RT.
    4. Aggiungere un cocktail di selezione di biotina (100 μL/mL) alla soluzione di adipociti, mescolare bene e incubare per 15 minuti a RT con leggera inclinazione/rotazione.
    5. Mescolare le nanoparticelle magnetiche pipettandole su e giù, aggiungere le particelle (50 μL/mL) alla soluzione di adipociti, mescolare bene e incubare per 10 minuti a RT con una leggera rotazione (10 giri/min).
    6. Aggiungere tampone PBS/2% FBS/1 mM EDTA alla soluzione di adipociti per un volume totale di 1 mL.
    7. Posiziona il tubo nel magnete e lascialo riposare per 5 minuti.
    8. Prendi il magnete e, con un movimento continuo, capovolgi il magnete contenente il tubo e versa il contenuto in un nuovo tubo da 5 ml. Non picchiettare il tubo durante il versamento. Le cellule attaccate agli anticorpi vengono legate dalle nanoparticelle magnetiche e rimosse, mentre gli adipociti immunopurificati vengono trattenuti.
    9. Congelare gli adipociti purificati nel liquido N2 e conservarli a -80 °C fino all'estrazione del DNA.

4. Isolamento dei pre-adipociti

  1. Per isolare una popolazione arricchita di pre-adipociti, utilizzare un protocollo per sfruttare la loro capacità di attaccarsi alla plastica dopo una coltura a breve termine della SVF20.
  2. In una cappa a flusso laminare, risospendere il pellet SVF in 5 mL di tampone di lisi eritrocitaria per 5-10 minuti a RT (mescolare accuratamente) e centrifugare a 800 x g. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in FBS al 10% in alfa (α)MEM.
  3. Piastra le cellule su un piatto di coltura di plastica per ~8-12 ore in un incubatore di coltura tissutale a 37 °C e con un'atmosfera di CO2 al 5%.
  4. Dopo ~8-12 ore, lavare delicatamente le cellule non aderenti dalla piastra di coltura con PBS all'interno di una cappa a flusso laminare.
  5. Dopo aver aspirato il PBS, aggiungere 1-1,5 mL di tripsina allo 0,25%/1 mM EDTA alla piastra di coltura per staccare le cellule aderenti (popolazione arricchita di pre-adipociti). Posizionare la piastra di coltura nell'incubatore a 37 °C per ~5-8 minuti per aiutare a sollevare le cellule.
  6. Aggiungere il 10% di FBS/αMEM alla piastra e lavare accuratamente la piastra per raccogliere tutte le cellule dalla piastra. Trasferire la soluzione cellulare in una provetta da 15 mL o 50 mL e centrifugare a 800 x g per 8 min.
  7. Rimuovere il surnatante e conservare il pellet (pre-adipociti) a -80 °C fino all'estrazione del DNA.

5. Isolamento dei monociti del sangue

NOTA: I monociti vengono analizzati per rappresentare una popolazione cellulare (quasi) completamente capovolta, e la misurazione dell'arricchimento di 2H nei monociti può essere utilizzata come marcatore di riferimento dell'esposizione a 2H2O in ciascun individuo. In alternativa, l'arricchimento corporeo di 2H2O può essere misurato e utilizzato per calcolare l'esposizione di 2H2O.

  1. Aspirare sangue fresco intero da soggetti umani in provette vacutainer contenenti EDTA.
  2. Centrifugare il sangue a 1.000-2.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
    NOTA: Non utilizzare il freno.
  3. Rimuovere lo strato superiore di plasma. Fai attenzione a non toccare il buffy coat bianco appena sotto il plasma.
  4. Aspirare il buffy coat bianco utilizzando una pipetta di trasferimento e trasferirlo in una provetta da 50 ml. Aggiungere ~10 ml di PBS al buffy coat.
  5. Aggiungere delicatamente 10 ml di un mezzo a gradiente di densità per sovrapporre il buffy coat.
    NOTA: Assicurarsi che la punta della pipetta tocchi il fondo della provetta ed espellerla con cautela in modo che vi sia uno strato chiaro di mezzo di gradiente di densità sul fondo. Evitare di introdurre bolle.
  6. Centrifugare la provetta a 800 x g per 30 minuti con il freno disinserito.
  7. Pipettare (~10 mL) lo strato bianco (frazione mononucleare), facendo movimenti circolari con la punta della pipetta di trasferimento vicino al bordo ma senza toccare lo strato superiore. Trasferire in una nuova provetta da 50 ml e aggiungere 10 ml di PBS. Centrifugare a 800 x g per 5 minuti (non usare il freno) e scartare il surnatante.
  8. Aggiungere 5 mL di tampone di lisi eritrocitaria al pellet. Mescolate e lasciate riposare per 2 minuti a RT.
  9. Aggiungere 5 mL di PBS con BSA allo 0,1% alla soluzione tampone/pellet per lisi eritrocitaria, centrifugare a 800 x g per 5 minuti ed eliminare il surnatante.
  10. Isolare i monociti come cellule CD14+ utilizzando biglie immunomagnetiche. Eseguire l'isolamento delle cellule CD14+ seguendo il protocollo del produttore.
  11. Conservare i monociti isolati a -80 °C fino all'estrazione del DNA.

6. Preparazione del DNA (isolamento, idrolisi e derivatizzazione)

  1. Isolare il DNA dai pre-adipociti, dagli adipociti e dai monociti del sangue utilizzando un kit di estrazione del DNA seguendo le istruzioni del produttore.
  2. Per liberare i desossiribonucleosidi, idrolizzare enzimaticamente il DNA (~200 μL) durante la notte (non più di 24 ore) a 37 °C in 50 μL di cocktail di idrolisi enzimatica contenente 1 mL di nucleasi S1, 1 mL di enzima fosfatasi e 36,8 mL di tampone di idrolisi 5x in provette di vetro con tappo a vite da 16 mm x 100 mm (10 mL). Inoltre, includi i seguenti campioni: un bianco d'acqua, un bianco per cocktail di idrolisi, un bianco per colonna dal kit di estrazione del DNA e 500 ng di standard di DNA.
    1. Per preparare il tampone per idrolisi 5x, mettere 94 ml di acqua pura di biologia molecolare in un becher sterile. Pesare 3,08 g di acetato di sodio e 21,5 mg di solfato di zinco, aggiungere acqua e mescolare fino a quando non si saranno sciolti. Regolare il pH a 5,0 con acido acetico glaciale e testare con carta per pH. Aggiungere acqua per raggiungere un volume totale di 100 ml.
    2. Per preparare l'enzima fosfatasi, risospendere una fiala di fosfatasi acida in 1 mL di acqua pura.
    3. Per preparare l'enzima nucleasi S1 0,5 U/μL, diluire 2,5 μL di nucleasi S1 in 2 mL di tampone di idrolisi 1x (aggiungere 1 mL di tampone di idrolisi 5x a 4 mL di acqua pura).
  3. Derivatizzare gli idrolizzati in derivati della pentafluorobenzilidrossilammina (PFBHA). In particolare, aggiungere quanto segue direttamente ai campioni di DNA digerito, compresi gli standard e i bianchi, in provette con tappo a vite da 16 mm x 100 mm (10 mL): 100 μL di pentafluorobenzil idrossilammina cloridrato (PFBHA; 1 mg/mL) e 75 μL di acido acetico glaciale. Agitare (brevemente), tappare le fiale e posizionare i campioni di idrolizzato su un blocco riscaldante impostato a 100 °C per 30 minuti.
  4. Rimuovere i campioni e lasciarli raffreddare per ~5 minuti fino a RT. Dopo il raffreddamento, aggiungere 2 mL di anidride acetica e 100 μL di 1-metilimidazolo a ciascuna provetta sotto una cappa aspirante. Posizionare i tubi su un blocco termico a 100 °C per 5 minuti.
  5. Rimuovere i campioni, quindi lasciarli raffreddare per ~15-20 minuti. Una volta raffreddato, aggiungere 3 ml di acqua di biologia molecolare a ciascun campione, agitare brevemente e lasciarli riposare per 10 minuti.
  6. Aggiungere 2 mL di diclorometano (DCM) alle provette e agitare vigorosamente i campioni per 15 s per estrarre il derivato nella fase organica.
  7. Centrifugare a 800 x g per 5 min per separare le fasi. Trasferire con cautela lo strato inferiore di diclorometano in un flaconcino GC pulito da 1,6 mL.
    NOTA: Non trasferire nessuna fase acquosa, poiché ciò aumenterebbe lo sfondo.
  8. Evaporare a secco con azoto per ~20 minuti per rimuovere il DCM e l'acido acetico residuo, seguito da un ~10 minuti di asciugatura in vuoto a velocità RT per rimuovere tutte le tracce dei reagenti.

7. Analisi gascromatografica-spettrometria di massa (GC-MS) del DNA

  1. Una volta asciutti, risospendere i derivati PFBHA in 150 μL di acetato di etile e chiudere. Successivamente, analizzare l'incorporazione di 2H nel DNA su uno strumento di gascromatografia (GC)/spettrometria di massa (MS) dotato di una colonna DB-225 che utilizza la ionizzazione chimica negativa al metano e raccoglie gli ioni in modalità di monitoraggio ionico selettivo a m/z 435, m/z 436 e m/z 437 (che rappresentano gli isotopomeri di massa M0, M1 e M2 ), rispettivamente). Seguire le istruzioni del produttore per lo strumento utilizzato.
    1. Impostare le condizioni GC come segue: colonna: 30 m x 0,25 mm ID x 0,25 μm di rivestimento in pellicola; cromatografo: gas di trasporto dell'elio a flusso costante di 1,0 mL/min; iniezioni pulsate split-less; temperatura dell'iniettore: 250 °C; Linea di trasferimento MS: 325 °C; condizioni del forno: temperatura iniziale 100 °C, mantenimento 2 min, rampa a 40 °C/min a una temperatura di 220 °C, mantenimento 7,5 min, seconda rampa a 40 °C/min a 320 °C, mantenimento per 1 min. La durata totale è di 16,0 min. I tempi tipici di eluizione dR sono di 10,5 min e 10,8 min rispettivamente per il primo e il secondo picco.
    2. Impostare le condizioni MS come segue: sorgente di ionizzazione chimica negativa al metano con rilevamento in modalità di monitoraggio a singolo ione; ioni raccolti per dR: m/z 435, m/z 436 e m/z 437 (che rappresentano rispettivamente gli isotopomeri di massa M0, M1 e M2 ).
      NOTA: Siliconare il rivestimento in vetro aperto con un piccolo tappo di lana di vetro siliconata nella parte inferiore del rivestimento. Cambia spesso questa fodera (ogni ~100 iniezioni).
  2. Calcolare i rapporti M1 dell'abbondanza degli isotopomeri di massa nella derivata dR non arricchita (abbondanza naturale) come segue:
    Rapporto M1 = abbondanza M1/(somma delle abbondanze M0, M1 e M2)
    Quindi, sottrarre i rapporti M1 di abbondanza naturale dai rapporti M1 nel dR dei campioni etichettati per calcolare gli arricchimenti (abbondanze isotopiche in eccesso, o %EM1)21.
  3. Misurare le abbondanze di massa degli isotopomeri degli standard di DNA di base (non arricchiti) contemporaneamente su un intervallo di abbondanze di ioni M0 che coprono l'intervallo di abbondanze di ioni M0 nei campioni analizzati.
    NOTA: Questo passaggio è essenziale per correggere la "sensibilità all'abbondanza" dei rapporti isotopici misurati da GC/MS22.
  4. Costruisci un grafico dell'abbondanza di ioni M0 misurata rispetto ai rapporti M1 dell'isotopomero di massa misurati negli standard non etichettati per determinare la concentrazione del campione sulla colonna che è più accurata per l'isotopomero di massa M1 (cioè, dove è più vicina al rapporto M1 di abbondanza naturale noto e calcolato, o il "punto debole"). Il rapporto M1 per questo derivato dR non arricchito è 0,1669.
  5. Iniettare i campioni sperimentali in modo che siano il più vicino possibile nell'area del picco M0 a questo "punto ottimale". Utilizzare una regressione quadratica del rapporto M1 degli standard non arricchiti rispetto all'area del picco M0 per stimare un rapporto M1 di "abbondanza naturale aggiustata" per ciascun campione alla sua particolare concentrazione M0. Sottrai questo rapporto dal rapporto M1 del campione di cellule adipose per ottenere la percentuale di arricchimento superiore all'abbondanza naturale, o %EM1 (Figura 3)23.
  6. Calcolare l'arricchimento teorico massimo di M1 (EM1*) nelle cellule adipose utilizzando le equazioni24 dell'analisi della distribuzione degli isotopomeri di massa (MIDA) basate sull'esposizione corporea a 2H2O (misurata nelle urine) integrata nel periodo di 8 settimane (Figura 4) o agli arricchimenti di monociti misurati ad interim (passaggio 7.5).

8. Calcolo della frazione di cellule di nuova sintesi, o adipogenesi in vivo

  1. Calcola la frazione di nuove cellule (%), che è una misura dell'adipogenesi in vivo o della formazione di pre-adipociti o adipociti di nuova sintesi, utilizzando la seguente formula:
    Frazione di nuove cellule (%) = [(Arricchimento M1 nelle cellule [adipose] campione)/EM1* (arricchimento massimo teorico M1 )] x 100
    NOTA: *L'arricchimento di 2H nei monociti può essere utilizzato anche come denominatore dell'equazione. Questa misurazione nei monociti rappresenta un marcatore cellulare di riferimento dell'esposizione a 2H2O in ciascun individuo e può essere utilizzata per confermare i calcoli dell'arricchimento massimo teorico di M1dai valori di 2H2O misurati nel corpo.

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Risultati

Il protocollo di marcatura 2H2O (sezione 1) mantiene l'arricchimento nell'acqua corporea vicino al plateau 2H nell'intervallo 1,0%-2,5% per la durata del periodo di marcatura di 8 settimane10, come mostrato nella Figura 2. Uno studio precedente ha utilizzato il protocollo di marcatura 2H2O per valutare la cinetica adiposa attraverso l'incorporazione di 2H nel DNA delle cellule adipose, come des...

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Discussione

Le valutazioni in vivo sono necessarie per fornire nuove conoscenze sulle dinamiche del turnover dell'AT bianco e sul suo ruolo nell'obesità e nelle malattie metaboliche correlate, poiché le valutazioni in vitro non comprendono l'ambiente naturale dell'AT. Sebbene l'uso della datazione retrospettiva al radiocarbonio per valutare la dinamica adiposa sia stato informativo 7,25, questo approccio non è adatto per ca...

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Dichiarazioni

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Ringraziamenti

Gli autori ringraziano il Mass Spectrometry Core presso il Pennington Biomedical Research Center.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1-metilimidazoloMilliporeSigma336092
2H2OSigma Aldrich
Anidride aceticaAldridge539996
ACK Lysing Buffer (tampone di lisi eritrocitaria)Quality Biological Inc (VWR)10128-802
Agilent 6890/5973 GC/MS Agilent
Anti-umano CD31 (PECAM-1) BiotinaInvitrogen13-0319-82
Anti-umano CD34 BiotinaInvitrogen13-0349-82
Anti-umano CD45BioLegend304004
Soluzione antibiotica antimicoticaMilliporeSigmaA5955
Collagenasi di tipo 1Worthington Biochemical CorporationLS004196
Desossiribosio (2-deossi d-ribosio)MilliporeSigma31170
Ossido di deuterioMilliporeColonna Sigma756822
DB-225 (30m, 0.25mm, 0.25um)J& W Scientific122-2232
Diclorometano (DCM)MilliporeSigma34856
DNA standard (DNA del timo di vitello)MilliporeSigmaD4764
Dneasy Blood and Tissue Kit (kit di estrazione del DNA)Qiagen69504
Easy Sep Kit di biotina umanaTecnologie delle cellule staminali17663
EasySep Human CD14 Selezione positiva CocktailStem Cell Technologies18058C
Acetato di etileFisherEX0241-1
Falcon 5 mL Provetta in polistirene a fondo tondoVWR60819-295
Ficoll-Paque PlusMilliporeSigmaGE17-1440-02
Fiale GC (2 mL)FisherC-4011-1W
Inserti per fiale GCFisherC-4011-631; C-4012-530
Acido acetico glacialeFisherAC14893-0010
Provette di vetro (per idrolisi)Fisher14-959-35AA
Tampone HEPESThermoFisher15630080
Hyclone Water, grado di biologia molecolareThomas ScientificSH30538.02
MEM alphaFisher Scientific32561-037
PFBHA (o-(2, 3, 4, 5, 6)-penatfluorobenzilidrossilamina cloridrato)MilliporeStrisce indicatrici di pH Sigma194484
987618
Acido fosfatasiCalbiochem (VWR)80602-592
S1 nucleasi (da Aspergillus oryzae)MilliporeSigmaN5661
Solfato di sodioMilliporeSigma23913
Fisher

Riferimenti

  1. Cypess, A. M. Reassessing human adipose tissue. The New England Journal of Medicine. 386 (8), 768-779 (2022).
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