Dall'emergere dei rivelatori diretti di elettroni e dal miglioramento del software e dell'hardware, la microscopia crioelettronica (cryo-EM) è diventata una tecnica che consente regolarmente ai ricercatori di determinare la struttura delle macromolecole con un dettaglio quasi atomico 1,2. Questa accelerazione è stata catalizzata da una serie estremamente rapida di nuovi sviluppi, dalla preparazione dei campioni alla raccolta e all'elaborazione dei dati. Per consentire un'ampia democratizzazione di questa tecnica ai non esperti, sono state create pipeline più efficienti e accessibili. Sorprendentemente, meno di 10 anni dopo la "rivoluzione della risoluzione", la crio-EM è diventata una tecnica essenziale per la caratterizzazione delle proteine, sia nel mondo accademico che nell'industria 3,4.
Uno degli aspetti più notevoli della comunità di ricerca crio-EM è stata la volontà di condividere apertamente protocolli, strategie e software5. Questa apertura tecnologica e di competenze ha contribuito in modo significativo al ritmo molto rapido dello sviluppo, ma alcune strozzature continuano a impedirne la piena accessibilità. In questa raccolta di metodi, ci proponiamo di descrivere alcuni dei recenti sviluppi nella preparazione di griglie adatte all'analisi strutturale mediante crio-EM, che è, insieme all'accesso all'hardware di analisi dei dati, il principale collo di bottiglia per molti progetti. Discutiamo anche dei nuovi protocolli che sono attualmente in fase di sviluppo in questo campo, per nuovi approcci nelle analisi crio-EM.
Come affermato in precedenza, uno degli attuali colli di bottiglia per l'applicazione di routine della crio-EM in laboratorio è la preparazione del campione. Diversi problemi possono essere riscontrati a livello di applicazione del campione alle griglie: più comunemente, l'orientamento preferito del campione nel ghiaccio e la sua denaturazione all'interfaccia aria-acqua. Schermare il campione dall'interfaccia aria-acqua è una soluzione a questo problema, utilizzando pellicole di supporto di carbonio o grafene che impediscono fisicamente al campione di entrare in contatto con l'aria. Per facilitare l'applicazione di film sottili su griglie, de Martin Garrido et al.6 hanno sviluppato un blocco di galleggiamento di supporto prodotto da una stampante 3D che consente di applicare piccole gocce d'acqua e campione in modo controllato. Utilizzando questo blocco, gli strati di grafene e carbonio vengono depositati in modo economico e facile da usare.
Un altro modo per prevenire il danno all'interfaccia aria-acqua è limitare il tempo in cui la proteina è esposta all'atmosfera. Per questo, due diversi strumenti, sviluppati da Klebs et al.7 e Budell et al.8, utilizzano nuovi approcci per la preparazione rapida (fino a 10 ms) della griglia, riducendo la probabilità di problemi con l'orientamento delle particelle. Un altro vantaggio di questi dispositivi è la possibilità di eseguire esperimenti risolti nel tempo, una nuova entusiasmante frontiera per gli studi strutturali.
In un approccio contrastante, Nguyen et al.9 riportano un metodo per congelare le griglie per l'analisi crio-EM in assenza di dispositivi commerciali o su misura, che sono molto costosi o difficili da costruire. Mostrano come griglie di qualità simile possano essere ottenute utilizzando un dispositivo economico e fatto in casa che non richiede alcuna strumentazione costosa, contribuendo alla democratizzazione della crio-EM.
Nella crio-EM, il campione di interesse non è sempre una proteina, ma può invece essere una piccola molecola o un grande sistema biologico come un'intera cellula. La preparazione di tali campioni è unica e richiede passaggi specifici, nonché diverse strategie nella raccolta dei dati.
Per la diffrazione elettronica dei microcristalli (MicroED), il campione da studiare è una piccola sostanza chimica che di solito si trova sotto forma di polvere. La polvere viene applicata direttamente sulla griglia EM per mantenere una forma cristallina. La raccolta dei dati viene quindi eseguita in modalità diffrazione, come mostrato da Martynowycz e Gonen10. Al contrario, le cellule intere sono troppo spesse per l'analisi crio-EM. Per risolvere questo problema, Bisson et al. riportano un metodo per utilizzare un SEM per perforare fisicamente un tale campione, al fine di ottenere sezioni sottili adatte per studi strutturali11.
Dal campione alla struttura, è importante tenere traccia di ogni fase del processo, poiché molti parametri vengono modificati per ogni campione proteico, dalla concentrazione proteica alle impostazioni del microscopio e all'analisi dei dati. A tal fine, Wypych et al.12 hanno sviluppato uno strumento di gestione delle informazioni basato sul web che consente agli utenti di organizzare il proprio flusso di lavoro e tenere traccia di tutti i dettagli necessari per le future pubblicazioni. Ciò è particolarmente critico in quanto l'automazione sta diventando sempre più diffusa nella crio-EM, in particolare in ambito industriale.
Cryo-EM è progredito a un ritmo eccezionale nell'ultimo decennio, sia sul fronte hardware che su quello software. Per garantire un'ampia diffusione delle migliori pratiche e l'ampia adozione di nuovi metodi, è necessario un insieme trasparente di protocolli. Questo numero speciale contribuirà a questo sforzo.