Articolo metodologico

Analisi dell'isolamento e del trascrittoma di tipi di cellule vegetali

DOI:

10.3791/64913

⸱

7 aprile 2023

 ,  ,  , 
1Joint Center for Single Cell Biology, School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fattibilità e l'efficacia dei metodi scRNA-seq ad alto rendimento annunciano un'era a singola cellula nella ricerca sulle piante. Presentata qui è una procedura robusta e completa per isolare specifici tipi di cellule radice di Arabidopsis thaliana e la successiva costruzione e analisi della libreria di trascrittomi.

Abstract

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Negli organismi multicellulari, la programmazione dello sviluppo e le risposte ambientali possono essere altamente divergenti in diversi tipi di cellule o anche all'interno delle cellule, che è noto come eterogeneità cellulare. Negli ultimi anni, l'isolamento di singole cellule e di tipo cellulare combinato con tecniche di sequenziamento di nuova generazione (NGS) sono diventati strumenti importanti per studiare i processi biologici a risoluzione singola cellulare. Tuttavia, isolare le cellule vegetali è relativamente più difficile a causa della presenza di pareti cellulari vegetali, che limita l'applicazione di approcci unicellulari nelle piante. Questo protocollo descrive una solida procedura per l'isolamento basato su cellule singole e cellulari attivate da fluorescenza (FACS) con cellule vegetali, adatta per l'analisi multi-omica a valle e altri studi. Utilizzando le linee marcatrici fluorescenti della radice di Arabidopsis , dimostriamo come particolari tipi di cellule, come le cellule del periciclo xilematico-polo, le cellule iniziali della radice laterale, le cellule del cappuccio radicale laterale, le cellule della corteccia e le cellule endodermiche, sono isolate. Inoltre, viene fornito anche un efficace metodo di analisi del trascrittoma a valle utilizzando Smart-seq2. Il metodo di isolamento cellulare e le tecniche di analisi del trascrittoma possono essere adattati ad altri tipi di cellule e specie vegetali e hanno un ampio potenziale applicativo nella scienza delle piante.

Introduzione

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le cellule sono l'unità fondamentale di tutti gli organismi viventi e svolgono funzioni strutturali e fisiologiche. Sebbene le cellule negli organismi multicellulari mostrino un'apparente sincronicità, cellule di diversi tipi e singole cellule presentano differenze nei loro trascrittomi durante lo sviluppo e le risposte ambientali. Il sequenziamento dell'RNA a singola cellula ad alto rendimento (scRNA-seq) fornisce una potenza senza precedenti per comprendere l'eterogeneità cellulare. L'applicazione di scRNA-seq nelle scienze vegetali ha contribuito a costruire con successo un atlante cellularevegetale 1, è stato utilizzato per identificare taxa cellulari rari nei tessuti vegetali2, ha fornito informazioni sulla composizione dei tipi di cellule nei tessuti vegetali ed è stato utilizzato per identificare l'identità cellulare e importanti funzioni impiegate durante lo sviluppo e la differenziazione delle piante. Inoltre, è possibile dedurre traiettorie di sviluppo spazio-temporali nei tessuti vegetali 1,2,3 per scoprire nuovi geni marcatori4 e studiare le funzioni di importanti fattori di trascrizione 5 utilizzando scRNA-seq al fine di rivelare la conservazione evolutiva dello stesso tipo cellulare in piante diverse 3. Gli stress abiotici sono tra le più importanti influenze ambientali sulla crescita e lo sviluppo delle piante. Esplorando i cambiamenti nella composizione dei tipi di cellule nei tessuti vegetali in diverse condizioni di trattamento attraverso il sequenziamento del trascrittoma a singola cellula, si può anche risolvere il meccanismo di risposta allo stress abiotico6.

Il potenziale per risolvere l'eterogeneità trascrizionale tra i tipi di cellule utilizzando il sequenziamento scRNA dipende dal metodo di isolamento cellulare e dalla piattaforma di sequenziamento. La selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS) è una tecnica ampiamente utilizzata per isolare una sottopopolazione di cellule per scRNA-seq basata sulla diffusione della luce e sulle proprietà di fluorescenza delle cellule. Lo sviluppo di linee di marcatori fluorescenti mediante tecnologia transgenica ha notevolmente migliorato l'efficienza dell'isolamento cellulare mediante FACS7. Condurre scRNA-seq usando Smart-seq28 migliora ulteriormente la capacità di sezionare l'eterogeneità cellulare. Il metodo Smart-seq2 ha una buona sensibilità per il rilevamento genico e può rilevare geni anche con un basso input di trascrizione9. Oltre alla raccolta di tipi di cellule di massa, i moderni selezionatori di cellule forniscono un formato di ordinamento dell'indice a singola cellula, consentendo l'analisi del trascrittoma a risoluzione di singola cellula utilizzando Smart-seq210 o altri metodi multiplexed RNA-seq, come CEL-seq211. La selezione a cella singola o a cella può essere potenzialmente utilizzata per molte altre applicazioni a valle, come gli studi multiomici paralleli12,13. Presentato qui è un protocollo robusto e versatile per isolare i tipi di cellule vegetali, come le cellule del periciclo xilematico-polo, le cellule del cappuccio della radice laterale, le cellule iniziali della radice laterale, le cellule della corteccia e le cellule endodermiche dalle radici delle linee cellulari marcatrici di Arabidopsis thaliana mediante FACS. Il protocollo prevede inoltre la costruzione della libreria Smart-seq2 per l'analisi del trascrittoma a valle.

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Protocollo

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Il seguente protocollo è stato ottimizzato per i semi wild-type ( WT) di A. thaliana senza fluorescenza e linee marcatrici fluorescenti per i seguenti tipi di cellule radicali: cellule del periciclo xilematico-polo (J0121), cellule iniziali della radice laterale, cellule del cappuccio radicale laterale (J3411), cellule dell'endoderma e della corteccia (J0571) (Figura 1A). Tutte le linee marcatrici sono state ottenute da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali), ad eccezione della linea marcatrice della cella di iniziazione della radice laterale, che è stata generata introducendo un costrutto GFP guidato dal promotore GATA23 in un impianto di Arabidopsis wild-type a seguito di un rapporto precedentemente pubblicato14.

1. Preparazione del materiale vegetale

  1. Sterilizzare i semi di A. thaliana WT e i semi della linea marcatrice fluorescente incubando i semi in candeggina al 20% in un'incubatrice rotante a temperatura ambiente per 15 minuti.
  2. Risciacquare i semi in acqua bidistillata (ddH2O) da tre a cinque volte. Eseguire questo passaggio su una panca pulita sterile.
  3. Placcare i semi WT e reporter line su mezzi Murashige e Skoog (MS) a mezza forza con agar (w/v)15 allo 0,8%. Coltivare le piante verticalmente per 5 giorni (16 h luce a 23 °C) dopo stratificare per 2 giorni a 4 °C.

2. Protoplasting

  1. Preparare le soluzioni di protopertura2,5, denominate Soluzione A e Soluzione B (vedere Tabella dei materiali).
    1. Preparare la soluzione A contenente 400 mM di mannitolo, 0,05% BSA, 20 mM MES (pH 5,7), 10 mM CaCl2 e 20 mM KCl (vedere Tabella dei materiali). Conservare la soluzione A a -20 °C per un massimo di 1 mese.
    2. Preparare la soluzione B aggiungendo l'1% (p/v) di cellulasi R10, l'1% (p/v) di cellulasi RS, l'1% (p/v) di emicellulasi, lo 0,5% (p/v) di pectoliasi e l'1% (p/v) di macerozima R10 in una nuova aliquota della soluzione A. Conservare la soluzione B a -20 °C per un massimo di 1 mese.
  2. Scongelare delicatamente la soluzione A e la soluzione B sul ghiaccio prima di iniziare l'esperimento.
  3. Tagliare le radici usando una lama pulita o delle forbici e tagliare le radici in pezzi di ~ 0,5 cm. Immergere le radici in 1,5 ml di soluzione B seguita da una leggera rotazione (a circa 18 giri/min) a temperatura ambiente per 1,5-2 ore.
  4. Filtrare i protoplasti radicali attraverso la maglia del filtro da 40 μm (vedere la tabella dei materiali).
  5. Risciacquare la rete del colino con 1-2 mL di soluzione A.
  6. Unire i liquidi del punto 2.4 e del punto 2.5 e centrifugare a 300 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante con una pipetta, risospendere il pellet cellulare in 500-600 μL di soluzione A, quindi metterlo immediatamente sul ghiaccio.
  7. Trasferire la soluzione cellulare risospesa in una nuova provetta da 5 ml per la selezione delle cellule.

3. Selezione cellulare attivata dalla fluorescenza (FACS)

  1. Accendere e completare le fasi di configurazione dello strumento sullo smistatore (vedere Tabella dei materiali). Selezionare i canali di fluorescenza, utilizzare un impianto WT (senza fluorescenza) come controllo per determinare la linea di base per l'autofluorescenza e regolare il gate di selezione in base all'intensità di fluorescenza e ai singoletti FSC/SSC (Figura 2).
  2. Aggiungere 500 μL di soluzione A (fase 2.1.1) in una provetta di raccolta da 1,5 mL per evitare che le cellule vengano danneggiate. Raccogliere 2.000-3.000 cellule per provetta.
  3. Dopo la cernita, porre immediatamente i campioni su ghiaccio, centrifugare la provetta di raccolta contenente le cellule a 300 x g per 5 minuti a 4 °C e rimuovere il surnatante con una pipetta.
  4. Prendere 2 μL di cellule selezionate e verificare la fluorescenza utilizzando un microscopio a fluorescenza (vedere Tabella dei materiali).
  5. Conservare le celle ordinate a -80 °C o utilizzarle immediatamente per la costruzione della libreria (fase 4).
  6. Per l'ordinamento degli indici a cella singola, inserire la piastra a 96 pozzetti nell'adattatore. Calibrare la posizione della piastra in modo che la goccia cada nel foro centrale della piastra. Selezionare la modalità di ordinamento a cella singola durante l'ordinamento, immettere il numero di celle di destinazione come 1 e avviare l'ordinamento.

4. Preparazione della libreria Smart-seq2

  1. Come risultato della quantità ultra-bassa di input, eseguire la costruzione di librerie di RNA-seq di tipo a singola cellula in un ambiente privo di contaminazione. Prima di iniziare l'esperimento, pulire il banco con un decontaminante superficiale8 (vedi Tabella dei materiali) e etanolo al 75%.
  2. Preparare il tampone di lisi (miscela A) (Tabella 1) combinando 0,33 μL di Triton X-100 al 10%, 0,55 μL di inibitore della RNasi e 0,22 μL di 0,1 M DTT (vedere Tabella dei materiali).
  3. Aggiungere 1 μL di miscela A nel campione selezionato e macinare con un pestello sterile. Il volume del campione preferibile è ≤0,5 μL; utilizzare acqua priva di RNasi per portare il volume a 14 μL. Trasferire ogni singolo campione di cellula in una provetta PCR a parete sottile da 0,2 ml.
  4. Preparare la miscela B contenente 0,44 μL di oligo-dT 30 VN di primer di reazione a trascrizione inversa (RT) (100 μM) e 4,4 μL di dNTP (10mM) (Tabella 2) (vedere Tabella dei materiali).
  5. Aggiungere 4,4 μL di miscela B ai 14 μL di campione in ciascuna provetta, pipettare delicatamente per miscelare il campione e incubare il campione a 72 °C per 3 minuti. Dopo l'incubazione, mettere immediatamente i campioni sul ghiaccio per ibridare l'oligo-dT alla coda poli A.
  6. Preparare la miscela di reazione di trascrizione inversa (miscela C) (Tabella 3) (vedi Tabella dei materiali). Aggiungere 21,6 μL di miscela C a ciascuna provetta contenente i campioni. Accendere il programma RT su uno strumento PCR comune (Tabella 4).
  7. Eseguire la reazione di preamplificazione su ghiaccio. Preparare la miscela D combinando 44 μL di miscela 2x PCR polimerasi e 0,88 μL di primer IS PCR (10 μM) (Tabella 5) (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere 40,8 μL di miscela D ai 40 μL del prodotto di reazione RT ed eseguire il programma di preamplificazione (Tabella 6).
  8. Purificare i prodotti della reazione di preamplificazione utilizzando le sfere Ampure XP (vedere Tabella dei materiali). Aggiungere 48 μL di perline (rapporto 0,6:1) in ciascun campione del punto 4.7 e mescolare delicatamente i campioni mediante pipettaggio.
  9. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 10 minuti. Posizionare le provette da 1,5 mL contenenti i campioni su un supporto di separazione magnetica per 5 minuti. Scartare con attenzione il surnatante dai campioni senza disturbare le perline.
  10. Lavare le perle risospendendole in 200 μL di etanolo all'80% e posizionare i campioni sul supporto di separazione magnetica (vedere Tabella dei materiali) per altri 3 minuti prima di scartare il surnatante contenente etanolo.
  11. Asciugare all'aria i campioni per 10 minuti e coprire il tubo per evitare contaminazioni e contaminazioni incrociate durante l'essiccazione all'aria.
  12. Risospendere le sfere in 20 μL di ddH2O, incubare i campioni a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi posizionarli sul supporto di separazione magnetica per 5 minuti.
  13. Pipettare 18 μL di surnatante da ciascuna provetta e trasferire i campioni in nuove provette da centrifuga da 1,5 ml. Utilizzare 1 μL del campione per valutare la qualità del cDNA utilizzando un kit di quantificazione del DNA, determinare la distribuzione dimensionale di ciascuna prelibreria utilizzando un analizzatore di frammenti (vedi Tabella dei materiali) e conservare il campione rimanente a -20 °C.
  14. Costruire una libreria di cDNA8 per il sequenziamento Illumina 16 dal prodotto prelibrary del passo4.13 usando un kit di preparazione della libreria di sequenziamento (vedere Tabella dei materiali).
  15. Purificare le librerie (dal punto 4.14) usando le perline Ampure XP, quantificare le librerie purificate e determinare la distribuzione delle dimensioni di ciascuna libreria seguendo il passaggio 4.13.
    NOTA: Pool uguale nanomoli di ogni libreria, assicurando che nessuno di essi abbia la stessa combinazione di indice Illumina. In caso contrario, le librerie possono essere raggruppate in un rapporto basato sull'output di sequenziamento desiderato e sequenziate insieme sulla stessa corsia del sequencer Illumina. Generalmente, il sequenziamento di ogni libreria a una profondità di 4-6 GB, che produce >10 milioni di letture mappate, fornisce una copertura 20x-30x del genoma di Arabidopsis . Anche profondità di sequenziamento inferiori sono accettabili, ma potrebbero influenzare il significato dell'analisi di espressione differenziale.

5. Analisi dei dati RNA-seq

  1. Tagliare le letture grezze usando Trim-Galore17 seguito dalla mappatura al genoma di riferimento usando hisat2 18 (daehwankimlab.github.io/hisat2) e rimuovere i frammenti duplicati PCR usando Picard19 (broadinstitute.github.io/picard).
  2. Eseguire l'elaborazione del conteggio grezzo e la successiva analisi dei geni differenzialmente espressi (DEG) con DESeq220 utilizzando almeno tre repliche biologiche per ciascun campione. Eseguire il clustering dell'espressione genica con il pacchetto Pheatmap e visualizzarlo in una mappa termica di espressione.
    NOTA: I valori RPKM (letture per kilobase per milione di letture mappate) dei geni e dei TE (elementi trasponibili) sono stati calcolati con Stringtie18 (github.com/gpertea/stringtie) e visualizzati in un browser del genoma.

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Risultati

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Isolamento del protoplasto
Questo protocollo è efficace per la selezione dei protoplasti delle linee marcatrici fluorescenti delle radici di A. thaliana. Queste linee di marcatori sono state sviluppate dalla fusione di proteine fluorescenti con geni espressi specificamente in tipi di cellule bersaglio, o utilizzando linee trappola enhancer (Figura 1). Numerosi tessuti e organi sono stati sezionati in tipi cellulari che esprimono specifici marcatori fluorescenti i...

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Discussione

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Il protocollo basato su Smart-seq2 può generare librerie di sequenziamento affidabili da diverse centinaia di celle8. La qualità del materiale di partenza è essenziale per l'accuratezza dell'analisi del trascrittoma. FACS è un potente strumento per la preparazione delle celle di interesse, ma questa procedura, in particolare la fase di protopertura, deve essere ottimizzata per le applicazioni dell'impianto. La microdissezione a cattura laser (LCM) o le cellule sezionate manualmente possono anche e...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Abbiamo istituito questo protocollo nella struttura multi-omica a cellula singola della School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiao Tong University, e siamo stati supportati dalla National Natural Science Foundation of China (Grant No. 32070608), Shanghai Pujiang Program (Grant No. 20PJ1405800) e Shanghai Jiao Tong University (Grant Nos. Agri-X20200202, 2019TPB05).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
0,22 µ m filtroSorfa 622110
AgarYeasen70101ES76
Analizzatore di frammenti AgilentAglient Aglient 5200
Kit DNA ad alta sensibilità AgilentDNF-474-0500
Perline Ampure XPBECKMANA63881
BetainayuanyeS18046-100g
CandegginaMr MuscleFnBn83BK20% (v/v) candeggina
BSAsigma9048-46-8
CaCl2yuanyeS24109-500g
Cellulase R10Yakult (Giappone)9012-54-8
Cellulase RSYakult (Giappone)9012-54-8
Provetta da centrifuga (1,5 mL)Eppendolf30121589
Decontaminanti per superfici lontane da DNasi, RNasi, DNA e RNABeyotimeR0127
dNTP (10 mM)NEBN0447S
DTT (0,1 m)
invitrogen		18090050
EthanolSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd100092680
FACSBD FACS MelodyBD-65745
FACSSonySH800S
Punta del filtro  (1000 µ L)Thermo ScientificTF112-1000-Q
Punta filtrante  (200 µ L)Thermo ScientificTF140-200-Q
Puntale filtrante (10 & micro; L)Thermo ScientificTF104-10-Q
Puntale filtrante (100 & micro; L)Thermo ScientificTF113-100-Q
Microscopio fluorescenteNikonEclipse Ni-E
Miscelatore rotante quadridimensionaleKylin -BellBE-1100
Emicellulasisigma9025-56-3
IS PCR primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
T-3'KAPA
HiFi HotStart ReadyMix( 2X)Roche 
KClSinopharm Chemical Reagent Co., Ltd7447-40-7
Macerozyme R10Yakult (Giappone)9032-75-1
Supporto di separazione magneticainvitrogen12321D
Mannitoloaladdina69-65-8
MESaladdin145224948
MgCl2 yuanyeR21455-500ml
MicrocentrifugheEppendorfCentrifuge 5425
Micro-mini-centrifugaTitanTimi-10k
MSPhytotechM519
Nextera XT Kit di preparazione della libreria del DNAilluminaFC-131-1024
oligo-dT30VN primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
TTTTTTTTTTVN-3'PCR
TermociclatoreA24811
PectolyaseYakult (Giappone)9033-35-6
Linee di marcatura delle pianteNottingham Arabidopsis Stock Centre (NASC)
Qubit 1x dsDNA HS Assay KitinvitrogenQ33231
Qubit 2.0 fluorimetroinvitrogenQ32866
Inibitore della RNasi Thermo ScientificEO0382
di 10977023invertitored'acqua senza RNasi
A400 mM di mannitolo, 0,05 % BSA, 20 mM di MES (pH5,7), 10 mM di CaCl2, 20 mM di KCl
Soluzione B1 % (p/v)cellulasi R10, 1 % (p/v) cellulasi RS, 1 %  (p/v)emicellulasi, 0,5 %  (p/v)pectoliasi e 1 % (w/v) Macerozyme R10 in un'aliquota fresca di soluzione A
Pestello sterileBIOTREAT453463
Colino (40 &5; m )Sorfa 251100
Trascrittasi inversa SuperScript IV (200 U/µ L)invitrogen18090050
tampone SuperScript IV (5x)invitrogen18090050
Provetta (5 mL)BD Falcon352052
Provette per PCR a parete sottile con tappi (0,5 mL)AXYGENPCR-05-C
Triton X-100Sangon BiotechA600198-0500
TSO primer5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG
TACATrGrG+G-3'Vortex
TitanVM-T2
7958935001 Soluzione

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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