Quantificazione dello stress di replicazione nelle cellule tumorali ovariche mediante immunofluorescenza del DNA a singolo filamento

Sommario

Qui, descriviamo un metodo basato sull'immunofluorescenza per quantificare i livelli di DNA a singolo filamento nelle cellule. Questo metodo efficiente e riproducibile può essere utilizzato per esaminare lo stress di replicazione, una caratteristica comune in diversi tumori ovarici. Inoltre, questo test è compatibile con una pipeline di analisi automatizzata, che ne aumenta ulteriormente l'efficienza.

Abstract

Lo stress di replicazione è un segno distintivo di diversi tumori ovarici. Lo stress di replicazione può emergere da più fonti, tra cui rotture a doppio filamento, conflitti di trascrizione-replicazione o oncogeni amplificati, con conseguente inevitabilmente generazione di DNA a singolo filamento (ssDNA). Quantificare l'ssDNA, quindi, offre l'opportunità di valutare il livello di stress di replicazione in diversi tipi di cellule e in varie condizioni o trattamenti dannosi per il DNA. Prove emergenti suggeriscono anche che l'ssDNA può essere un predittore di risposte ai farmaci chemioterapici che mirano alla riparazione del DNA. Qui, descriviamo una metodologia dettagliata basata sull'immunofluorescenza per quantificare il ssDNA. Questa metodologia prevede la marcatura del genoma con un analogo della timidina, seguita dalla rilevazione basata su anticorpi dell'analogo alla cromatina in condizioni non denaturanti. Tratti di ssDNA possono essere visualizzati come fuochi al microscopio a fluorescenza. Il numero e l'intensità dei fuochi sono direttamente correlati con il livello di ssDNA presente nel nucleo. Descriviamo anche una pipeline automatizzata per quantificare il segnale ssDNA. Il metodo è rapido e riproducibile. Inoltre, la semplicità di questa metodologia la rende suscettibile di applicazioni ad alto rendimento come farmaci e screening genetici.

Introduzione

Il DNA genomico è spesso esposto ad attacchi multipli da varie fonti endogene ed esogene¹. La frequenza del danno endogeno è direttamente correlata ai livelli di sottoprodotti metabolici, come le specie reattive dell'ossigeno o le aldeidi, che sono intrinsecamente più elevati in più tipi di cancro, compresi i tumori ovarici ^2,3. È imperativo che il danno al DNA sia risolto in modo efficiente; in caso contrario, può favorire lesioni genotossiche e, di conseguenza, mutagenesi. La capacità delle cellule di riparare le lesioni genotossiche dipende dalla funzionalità di percorsi di riparazio....

Protocollo

NOTA: La linea cellulare di cancro ovarico, OVCAR3, è stata utilizzata in queste fasi, ma questo protocollo è ampiamente applicabile a più altre linee cellulari, comprese quelle derivate da fonti non ovariche. Uno schema del protocollo è mostrato nella Figura 2.

1. Placcatura delle celle

1. Realizzare copertine rivestite di poli-L-lisina.
   1. Aggiungere i coperchi autoclavati di 12 mm di diametro a un tubo conico da 50 mL con soluzione di poli-L-lisina e posizionare su un bilanciere per 15 minuti.
   2. Aspirare la soluzione in una cappa di coltura tissutale. Lavare i coprivetrin....

Risultati

Le immagini rappresentative e la quantificazione dei focolai di IdU dai nuclei derivati dalle cellule non trattate e dalle cellule trattate con idrossiurea 0,5 mM per 24 ore sono mostrate nella Figura 4. Entrambi i nuclei sono colorati e identificabili nel canale DAPI. L'analisi di queste immagini consiste nel quantificare il numero di focolai in ciascun nucleo. Il numero di fuochi è proporzionale al grado di stress di replicazione.

Discussione

Come menzionato nel protocollo, è importante includere alcuni controlli sperimentali per garantire che il test funzioni. Questi includono un campione senza trattamento con IDU e un campione non trattato con anticorpi primari. Entrambi i controlli negativi dovrebbero produrre celle colorate da DAPI ma non contengono alcun segnale IdU.

In base alle condizioni sperimentali e alle linee cellulari utilizzate, possono essere necessarie diverse diluizioni anticorpali per ottenere il miglior segnale f.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
3% Paraformaldeide (PFA)	Fisher Scientific NC0179595		10 g di saccarosio + 100 mL 10X PBS + acqua per rendere il volume a 925 mL. Aggiungere 75 mL di PFA senza metanolo al 40%, mescolare e fare aliquote da 50 mL prima di riporre Conservazione: Conservare a -20 ° C
5-iodo-2'-deossiuridina (IdU)	Sigma Aldrich	I7125-5G	MW = 354,10 g/mol. Per 10 mM di brodo: sciogliere 3,541 mg di IdU in 1 mL di ammoniaca liquida 1 N Conservazione: Conservato in -20 ° C
Anticorpo anti-BrdU	BD Biosciences	347580	Conservazione: Conservare in 4 gradi C
Anti-topo Alexa Fluor Plus 488 anticorpo secondario	Thermo Scientific	A32766	Sensibile alla luce - conservare al buio Conservazione: Conservare in 4 gradi C
Albumina sierica bovina (BSA)	Sigma Aldrich	A7906-100G	Realizzato aggiungendo massa specifica al volume di PBS Conservazione: Conservare in 4 gradi; C
Vetro di copertura circolare	Scienze della microscopia elettronica	72230-01
Software NIS GA3	Nikon
OVCAR3	ATCC	HTB-161	Terreni di crescita: RPMI integrato con L-glutammina, 0,01 mg/mL di insulina bovina; siero fetale bovino a una concentrazione finale del 20% e 1X Pen Strep Conservazione: Terreni di congelamento: terreno di crescita + 5% DMSO e conservati in -80 ° C
Soluzione di poli-L-lisina	Sigma Aldrich	P4832-50ML	Conservazione: Conservare in 4 gradi C
ProLong Diamond Antifade Mountant con DAPI	Thermo Scientific	P36962	Conservazione: Conservare in 4 gradi C
tripsina-EDTA, 0,25%	Genesee Scientific	25-510	Conservazione: conservare in 4 gradi C
Acqua, filtrato sterile	Sigma Aldrich	W3500-6X500ML	Conservazione: Conservare in 4 gradi E

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