Il presente protocollo descrive un metodo per isolare, espandere e riprogrammare cellule derivate dall'urina di primati umani e non umani in cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC), nonché istruzioni per il mantenimento senza alimentatore delle iPSC appena generate.
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Articolo metodologico
Generazione e mantenimento di cellule staminali pluripotenti indotte da primati derivate dall'urina
In questo articolo
Sommario
Abstract
Gli approcci interspecie che studiano le cellule staminali pluripotenti dei primati e i loro derivati sono cruciali per comprendere meglio i meccanismi molecolari e cellulari della malattia, dello sviluppo e dell'evoluzione. Per rendere le cellule staminali pluripotenti indotte dai primati (iPSC) più accessibili, questo articolo presenta un metodo non invasivo per generare iPSC di primati umani e non umani da cellule derivate dall'urina e il loro mantenimento utilizzando un metodo di coltura senza alimentatore.
L'urina può essere campionata da un ambiente non sterile (ad esempio, la gabbia dell'animale) e trattata con un cocktail antibiotico ad ampio spettro durante la coltura cellulare primaria per ridurre efficacemente la contaminazione. Dopo la propagazione delle cellule derivate dall'urina, le iPSC sono generate da un metodo di trasduzione modificato di un sistema vettoriale del virus Sendai disponibile in commercio. Le prime colonie di iPSC possono essere già visibili dopo 5 giorni e possono essere raccolte dopo 10 giorni al più presto. Il passaggio di routine del grumo con tampone di dissociazione privo di enzimi supporta la pluripotenza delle iPSC generate per più di 50 passaggi.
Introduzione
I confronti genomici dei primati umani e non umani (NHP) sono cruciali per comprendere la nostra storia evolutiva e l'evoluzione dei tratti specifici dell'uomo1. Inoltre, questi confronti consentono l'inferenza della funzione identificando sequenze di DNA conservate2, ad esempio, per dare priorità alle varianti associate alla malattia3. I confronti di fenotipi molecolari come i livelli di espressione genica sono cruciali per interpretare meglio i confronti genomici e scoprire, ad esempio, le differenze fenotipiche cellulari. Inoltre, hanno - analogamente ai confronti a livello del DNA - il potenzi....
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Protocollo
Questa procedura sperimentale è stata approvata dal comitato etico responsabile sulla sperimentazione umana (20-122, Ethikkommission LMU München). Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti.
NOTA: L'approvazione deve essere ottenuta dal comitato etico appropriato prima di iniziare esperimenti relativi a campioni umani e NHP. Tutte le procedure sperimentali devono essere eseguite in conformità con le linee guida e i regolamenti pertinenti. Ciascuno dei seguenti passaggi deve essere eseguito utilizzando una tecnica sterile in un armadio di sicurezza biologica. Tutte le composizioni tampone e dei supporti sono....
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Risultati
Quando si isolano le cellule dall'urina umana e NHP, diversi tipi di cellule possono essere identificati direttamente dopo l'isolamento. Le cellule squamose, così come varie cellule rotonde più piccole, vengono escrete con l'urina; l'urina femminile contiene molte più cellule squamose rispetto all'urina maschile (Figura 1B - Giorno 0; Figura supplementare S1). Dopo 5 giorni di coltura nel mezzo urinario primario, si possono vedere le prime cellule proliferanti aderenti (
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Discussione
Le iPSC sono tipi di cellule preziose in quanto consentono la generazione di tipi cellulari altrimenti inaccessibili in vitro. Poiché i materiali di partenza per la riprogrammazione, ad esempio, i fibroblasti non sono facilmente disponibili da tutte le specie di primati, questo documento presenta un protocollo per la generazione di iPSC da cellule derivate dall'urina. Queste cellule possono essere ottenute in modo non invasivo, anche da campioni di urina di primati non sterili, integrando il terreno di coltura c.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato da DFG EN 1093/5-1 (numero di progetto 458247426). M.O. è stato supportato da JSPS Overseas Research Fellowship. Tutte le figure sono state create con BioRender.com. La citometria a flusso è stata eseguita con l'aiuto del Core Facility Flow Cytometry presso il Biomedical Center di Monaco. Vorremmo ringraziare Makoto Shida e Tomoyo Muto di ASHBi, Università di Kyoto, per il supporto della videografia.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Soluzione di distacco cellulare Accumax (Soluzione di distacco) | Sigma-Aldrich | SCR006 | |
| Soluzione di amfotericina B | Merck | A2941-100ML | |
| Anticorpo di topo TRA-1-60 umano... | Tecnologie delle cellule staminali | 60064 | Diluizione: 1/200 |
| Anticorpo coniugato PE TRA-1-60 anti-umano | Miltenyi Biotec | 130-122-965 | Diluizione: 1/50 |
| Bambanker™ (Mezzo di congelamento cellulare) | Nippon Genetics | BB01 | |
| Albumina sierica bovina (BSA) | Sigma-Aldrich | A3059-100G | |
| Piastra multipozzetto per colture cellulari, 12 pozzetti CELLSTAR | Greiner BIO-ONE | 665180 | |
| Countess™ II contatore di cellule automatizzato | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
| CryoKing® Provette da 1,5 mL con codice a barre 2D (Cryotubes) | Sued-Laborbedarf | 52 95-0213 | Per il congelamento è possibile utilizzare diversi tipi di provette criogeniche. Le provette con codice a barre 2D hanno il vantaggio che le informazioni sul campione possono essere memorizzate in un database con informazioni uniche sulle provette. |
| CytoTune&commercio; EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus) | Thermo Fisher Scientific | A16519 | |
| CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)Thermo | Fisher Scientific | A16518 | |
| DAPI 4',6-Diamidina-2'-fenilindolo dicloridrato | Sigma-Aldrich | 10236276001 | |
| DMEM High Glucosio | TH. Geyer | L0102 | |
| DMEM/F12 w L-glutammina | Fisher Scientific | 15373541 | |
| Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-topo IgG d'asino (H+L), Alexa Fluor™ 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21202 | Diluizione: 1/500 |
| Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio d'asino (H+L), Alexa Fluor™ 594 | Thermo Fisher Scientific | A-21207 | Diluizione: 1/500 |
| DPBS senza Calcio senza Magnesio | TH. Geyer | L0615-500 | |
| Anticorpo policlonale di coniglio ricombinante EpCAM (22 HCLC) | Thermo Fisher Scientific | 710524 | Diluizione: 1/500 |
| Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA) | Carl Roth | CN06.3 | |
| Falcon Tube 15 mL fondo conico | Greiner BIO-ONE | 188271-N | |
| Falcon Tube 50 mL fondo conico | Greiner BIO-ONE | 227261 | |
| Siero fetale bovino, qualificato, inattivato termicamente, Brasile (FBS) | Thermo Fisher Scientific 10500064 | ||
| FlowJo V10.8.2 | FlowJo | ||
| Gelatina da pelle suina | Sigma-Aldrich | G1890-1KG | |
| Geltrex™ Matrice della membrana basale con fattore di crescita ridotto senza LDEV, qualificata hESC | Thermo Fisher Scientific | A1413301 | |
| GlutaMAX™ Supplemento | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | |
| Incubatore a CO2 Heracell® 240i | Fisher Scientific | 16416639 | |
| Heraeus HeraSafe armadio di sicurezza | Kendro | 51017905 | |
| EGF umano, grado premium | Miltenyi Biotec | 130-097-749 | |
| ImageJ | Fiji | Versione 2.9.0 | |
| MEM Soluzione di aminoacidi non essenziali (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | |
| Provetta per microcentrifugazione PP, 1,5 mL | Nerbe Plus | 04-212-1000 | |
| Microscopio Nikon eclipse TE2000-S | Nikon | TE2000-S | |
| Anticorpo anti-alfa-fetoproteina per topo | R& Sistemi D | MAB1368 | Diluizione: 1/100 |
| anticorpo di actina anti-alfa-muscolo liscio di topo | R& Sistemi D | MAB1420 | Diluizione: 1/100 |
| Anticorpo della tubulina anti-beta-III di topo | R& Sistemi D | MAB1195 | Diluizione: 1/100 |
| mTeSR™ 1 | STEMCELL Technolgies | 85850 | |
| Nanog (D73G4) XP Coniglio mAb | Tecnologia di segnalazione cellulare | 4903S | Diluizione: 1/400 |
| Normocure™ (Reagente antimicrobico) | Invivogen | ant-noc | |
| Oct-4 Anticorpo di coniglio | Tecnologia di segnalazione cellulare | 2750S | Diluizione: 1/400 |
| Paraformaldeide (PFA) | Sigma-Aldrich | 441244-1KG | |
| Penicillina-Streptomicina (10.000 U/ml) (PS) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | La miscela Penicillina-Streptomicina contiene 100 U/mL di penicillina e 100 µ g/mL di streptomicina. |
| Umano ricombinante FGF-basic | PeproTech | 100-18B | |
| Umano ricombinante PDGF-AB | PeproTech | 100-00AB | |
| Centrifuga refrigerata da banco | SIGMA | 4-16KS | |
| Cellule epiteliali renali Terreno basale | ATCC | PCS-400-030 | |
| Kit per la crescita delle cellule epiteliali renali | ATCC | PCS-400-040 | |
| Sox2 (L1D6A2) MAb di topo #4900 | Tecnologia di segnalazione cellulare | 4900S | Diluizione: 1/400 |
| SSEA4 (MC813) MAb di topo | NEB | 4755S | Diluizione: 1/500 |
| StemFit® Basic02 | Nippon Genetics | 3821.00 | La produzione di questo terreno è stata interrotta, utilizzare invece StemFit Basic04CT per linee cellulari umane o StemFit Basic03 per primati non umani. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-50ML | |
| TrypLE™ Seleziona Enzima (1x), senza rosso fenolo (Enzima di dissociazione)Thermo | Fisher Scientific | 12563011 | |
| Waterbath Precision GP 05 | Thermo Fisher Scientific | TSGP05 | |
| Y-27632, sale dicloridrato (Rock Inhibitor) | Biozol | BYT-ORB153635 | |
| Tampone di diluizione degli anticorpi | tabella S1 | ||
| Tampone bloccante | Per la composizione, vedere la tabella supplementare S1 | ||
| Terreno | Per la composizione, vedere la tabella supplementare S1 | ||
| Terreno | Per la composizione, vedere la tabella supplementare S1 | ||
| coltura PSC | Per la composizione, vedere la tabella supplementare S1 | ||
| Terreno di generazione PSC | Per la composizione vedere la tabella supplementare S1 | ||
| Tampone | Per la composizione vedere la tabella supplementare S1 |
Riferimenti
- Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
- Zoonomia Consortium, A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
- Kircher, M., et al.
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Ristampe e permessi
