Method Article

Un protocollo per valutare e quantificare le patologie dell'epitelio pigmentato retinico in modelli murini di degenerazione maculare legata all'età

DOI:

10.3791/64927

⸱

March 10th, 2023

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medical Genetics, University of Wisconsin-Madison, 2McPherson Eye Research Institute, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Ophthalmology, Duke University, 4Department of Cell Biology, Duke University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

I modelli murini possono essere strumenti utili per studiare la biologia dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). È stato stabilito che i topi possono sviluppare una serie di patologie RPE. Qui, descriviamo un protocollo di fenotipizzazione per chiarire e quantificare le patologie RPE nei topi utilizzando luce, elettrone di trasmissione e microscopia confocale.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è una malattia debilitante della retina nelle popolazioni che invecchiano. È opinione diffusa che la disfunzione dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) sia un evento patobiologico chiave nell'AMD. Per comprendere i meccanismi che portano alla disfunzione RPE, i modelli murini possono essere utilizzati dai ricercatori. È stato stabilito da studi precedenti che i topi possono sviluppare patologie RPE, alcune delle quali sono osservate negli occhi di individui con diagnosi di AMD. Qui, descriviamo un protocollo di fenotipizzazione per valutare le patologie RPE nei topi. Questo protocollo include la preparazione e la valutazione delle sezioni trasversali retiniche mediante microscopia ottica e microscopia elettronica a trasmissione, nonché quella dei supporti piani RPE mediante microscopia confocale. Descriviamo in dettaglio i tipi comuni di patologie RPE murine osservate da queste tecniche e i modi per quantificarle attraverso metodi imparziali per i test statistici. Come prova del concetto, utilizziamo questo protocollo di fenotipizzazione RPE per quantificare le patologie RPE osservate nei topi che sovraesprimono la proteina transmembrana 135 (Tmem135) e nei topi C57BL/6J wild-type invecchiati. L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di presentare metodi standard di fenotipizzazione RPE con valutazioni quantitative imparziali per gli scienziati che utilizzano modelli murini di AMD.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è una malattia accecante comune che colpisce le popolazioni di età superiore ai 55anni 1. Molti ricercatori ritengono che la disfunzione all'interno dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) sia un evento patobiologico precoce e cruciale nell'AMD2. L'RPE è un monostrato di cellule polarizzate che ha il compito di mantenere l'omeostasi dei fotorecettori vicini e dei vasi sanguigni coroideali3. Esistono vari modelli per studiare i meccanismi associati alla malattia all'interno dell'RPE, compresi i modelli di coltura cellulare 4,5 e topi 6,7,8. Un recente rapporto ha descritto protocolli standardizzati e criteri di controllo della qualità per i modelli di coltura cellulare RPE4, ma nessun rapporto ha tentato di standardizzare la fenotipizzazione dell'RPE nei modelli murini. In effetti, molte pubblicazioni su modelli murini di AMD mancano di una descrizione completa dell'RPE o della quantificazione delle patologie RPE in essi. L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di presentare metodi standard di fenotipizzazione RPE con valutazioni quantitative imparziali per gli scienziati che utilizzano modelli murini AMD.

Pubblicazioni precedenti hanno notato la presenza di diverse patologie RPE nei topi attraverso tre tecniche di imaging. Ad esempio, la microscopia ottica consente ai ricercatori di visualizzare la morfologia grossolana della retina murina (Figura 1A) e rilevare patologie RPE come assottigliamento RPE, vacuolizzazione e migrazione. L'assottigliamento dell'RPE in un modello di mouse AMD è esemplificato da una deviazione nell'altezza dell'RPE dai rispettivi controlli (Figura 1B). La vacuolizzazione RPE può essere suddivisa in due categorie separate: microvacuolizzazione (Figura 1C) e macrovacuolizzazione (Figura 1D). La microvacuolizzazione RPE è riassunta dalla presenza di vacuoli nell'RPE che non influiscono sulla sua altezza complessiva, mentre la macrovacuolizzazione è indicata dalla presenza di vacuoli che sporgono nei segmenti esterni dei fotorecettori. La migrazione RPE si distingue per l'aggregato focale di pigmento sopra il monostrato RPE in una sezione trasversale retinica (Figura 1E). Va notato che le cellule RPE migratorie negli occhi dei donatori di AMD mostrano immunoreattività ai marcatori delle cellule immunitarie, come il cluster di differenziazione 68 (CD68)9, e potrebbero rappresentare cellule immunitarie che inghiottono detriti RPE o RPE in fase di transdifferenziazione 9. Un'altra tecnica di imaging chiamata microscopia elettronica a trasmissione può consentire ai ricercatori di visualizzare l'ultrastruttura dell'RPE e la sua membrana basale (Figura 2A). Questa tecnica può identificare il deposito sub-RPE predominante nei topi, noto come deposito laminare basale (BLamD) (Figura 2B)10. Infine, la microscopia confocale può rivelare la struttura delle cellule RPE attraverso l'imaging di supporti piatti RPE (Figura 3A). Questo metodo può scoprire la dismorfia RPE, la deviazione dell'RPE dalla sua classica forma a nido d'ape (Figura 3B). Può anche rilevare la multinucleazione RPE, la presenza di tre o più nuclei all'interno di una cellula RPE (Figura 3C). Per una sintesi dei tipi di patologie RPE presenti negli attuali modelli murini AMD, rimandiamo i ricercatori a queste recensioni dalla letteratura 6,7.

I ricercatori che studiano l'AMD dovrebbero essere consapevoli dei vantaggi e degli svantaggi dell'uso dei topi per studiare le patologie RPE prima del protocollo di fenotipizzazione. I topi sono vantaggiosi a causa della loro durata di vita relativamente breve e del rapporto costo-efficacia, nonché della loro manipolabilità genetica e farmacologica. I topi mostrano anche cambiamenti degenerativi RPE, tra cui migrazione RPE, dismorfia e multinucleazione, che si osservano negli occhi dei donatori di AMD 11,12,13,14,15,16,17; ciò suggerisce che meccanismi simili possono essere alla base dello sviluppo di queste patologie RPE nei topi e negli esseri umani. Tuttavia, ci sono differenze chiave che limitano la traducibilità degli studi sui topi all'AMD umana. In primo luogo, i topi non hanno una macula, una regione anatomicamente distinta della retina umana necessaria per l'acuità visiva che è preferenzialmente influenzata nell'AMD. In secondo luogo, alcune patologie RPE nei topi, come l'assottigliamento e la vacuolizzazione dell'RPE, non sono tipicamente osservate negli occhi dei donatori di AMD18. In terzo luogo, i topi non sviluppano drusen, un segno distintivo della patologia AMD19. Le drusen sono depositi contenenti lipidi e proteine con pochissime proteine di membrana basale che si formano tra la lamina basale RPE e lo strato collagenoso interno della membrana di Bruch (BrM)19. Drusen differisce da BLamD, il comune deposito sub-RPE nei topi, sia nella loro composizione che nella posizione anatomica. Le BLamD sono anomalie arricchite dalla matrice extracellulare dipendenti dall'età e dallo stress che si formano tra la lamina basale RPE di BrM e le pieghe basali dell'RPE20. È interessante notare che i BLamD hanno una composizione proteica e un aspetto simili sia nei topi che negli esseri umani 6,10,21. Lavori recenti suggeriscono che i BLamD possono agire nella patobiologia dell'AMD influenzando la progressione dell'AMD fino alle sue fasi successive18,22; pertanto, questi depositi possono rappresentare RPE malato nella retina del topo. La conoscenza di questi benefici e limitazioni è fondamentale per i ricercatori interessati a tradurre i risultati degli studi sui topi in AMD.

In questo protocollo, discutiamo i metodi per preparare gli occhi alla luce, alla trasmissione elettronica e alla microscopia confocale per visualizzare le patologie RPE. Descriviamo anche come quantificare le patologie RPE in modo imparziale per i test statistici. Come prova del concetto, utilizziamo il protocollo di fenotipizzazione RPE per studiare le patologie strutturali RPE osservate nei topi sovraesprimenti della proteina transmembrana 135- (Tmem135) e nei topi C57BL / 6J wild-type (WT) invecchiati. In sintesi, ci proponiamo di descrivere la metodologia di fenotipizzazione per caratterizzare l'RPE nei modelli murini AMD, poiché attualmente non sono disponibili protocolli standard. I ricercatori interessati a esaminare e quantificare le patologie dei fotorecettori o della coroide, che sono anche interessati nei modelli murini AMD, potrebbero non trovare questo protocollo utile per i loro studi.

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Protocol

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Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Università del Wisconsin-Madison e sono in aderenza con la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.

1. Valutazione dell'RPE del mouse mediante microscopia ottica

  1. Fare un tampone fissativo che abbia una concentrazione finale del 2% di paraformaldeide e del 2% di glutaraldeide a temperatura ambiente (RT) in una bottiglia di vetro.
    NOTA: questo protocollo richiede, al massimo, 14 mL di buffer fissativo per mouse.
    ATTENZIONE: Paraformaldeide e glutaraldeide sono sostanze pericolose. Si prega di seguire le procedure operative standard quando si lavora con queste sostanze.
  2. Preparare un sistema di perfusione per gravità su un sottoscocca assorbente per la perfusione cardiaca in una cappa aspirante (figura supplementare 1A).
    1. Introdurre 40 mL del tampone fissativo nel cilindro della siringa del sistema di perfusione (figura supplementare 1B).
    2. Ruotare la valvola fino a quando non è parallela alla tubazione per consentire al tampone di fluire attraverso la linea di tubi (figura supplementare 1C). Lavare la linea con buffer fino a quando tutte le bolle d'aria vengono rimosse dalla linea.
    3. Ruotare la valvola fino a renderla perpendicolare alla tubazione per impedire al buffer di fluire nella linea dei tubi (Figura supplementare 1D).
      NOTA: Il sistema di perfusione è ora pronto per l'uso.
  3. Eutanasia del topo mettendolo in una camera di anidride carbonica (CO 2) e consentire alla CO2 di fluire nella camera ad una velocità del 30% del volume della camera al minuto. Una volta che il topo smette di respirare, lasciare che la CO2 fluisca nella camera per almeno 1 minuto. Verificare che il mouse sia morto prima di andare al passaggio successivo.
    NOTA: L'eutanasia attraverso l'iniezione di agenti farmacologici può essere utilizzata in questo protocollo come alternativa all'inalazione di CO2 .
  4. Eseguire la perfusione cardiaca sul topo eutanasia.
    1. Trasferire il mouse su un vassoio poco profondo vicino al sistema di perfusione con l'addome rivolto verso l'alto. Spruzzare l'addome con etanolo al 70% (EtOH).
    2. Fare quattro incisioni per esporre la cavità addominale (Figura supplementare 2A).
      1. Crea un taglio inferiore di 5 cm usando forbici curve e pinze attraverso la pelle e la parete addominale sul lato sinistro più lontano del mouse che si trova direttamente sotto la gabbia toracica.
      2. Procedere a fare un taglio mediale di 3 cm attraverso la pelle e la parete addominale del topo che inizia nella parte superiore del taglio inferiore.
      3. Fai un altro taglio inferiore di 5 cm alla fine del taglio mediale attraverso la pelle e la parete addominale sul lato destro del mouse direttamente sotto la gabbia toracica.
      4. Fare un'altra incisione mediale di 3 cm per rimuovere il lembo della pelle addominale con una pinza curva.
    3. Tagliare il diaframma e lo sterno per esporre il cuore (Figura supplementare 2B).
      NOTA: Fare attenzione a evitare di scalfire il cuore, le arterie e le vene. Nicking questi porterà a una perfusione cardiaca inefficiente.
    4. Inserire l'ago del misuratore nel ventricolo sinistro del cuore. Ruotare la valvola fino a quando non è parallela alla linea del tubo. Tagliare l'atrio destro con forbici curve per consentire al sangue e al fissativo di uscire dal cuore (Figura supplementare 2C).
    5. Lasciare penetrare 10 ml di tampone fissativo nel topo per almeno 1-2 minuti, o fino a quando il fegato diventa di colore pallido e nessun sangue fuoriesce dall'atrio destro. Una volta completata la perfusione, ruotare la valvola fino a renderla perpendicolare alla linea del tubo per arrestare il flusso del tampone.
  5. Enucleare gli occhi dal topo dopo perfusione cardiaca.
    1. Rimuovere il mouse dal vassoio poco profondo e posizionare il mouse sul sottoscocca assorbente in una cappa aspirante. Orientare la testa del topo in modo che l'occhio sinistro sia rivolto verso lo sperimentatore e l'occhio destro sia fuori dalla vista. Annotare il lato superiore dell'occhio con un colorante per la marcatura dei tessuti.
    2. Spingere delicatamente verso il basso con il pollice e l'indice attorno all'orbita oculare per provocare la sporgenza dell'occhio dall'orbita oculare (Figura supplementare 3A).
    3. Prendi le forbici curve e tienile con la lama con un angolo di 30° dall'orbita oculare. Procedere al taglio intorno all'occhio con le forbici curve con un angolo di 30° (Figura supplementare 3B).
      NOTA: Va bene tagliare il tessuto in eccesso dall'orbita oculare per preservare l'integrità del bulbo oculare.
    4. Rimuovere il bulbo oculare dalla testa con una pinza curva e posizionarlo su un sottoscocca assorbente. Tagliare la cornea con una lama di bisturi numero 11 e posizionare l'occhio con una pinza curva in un microtubo da 2 ml con 2 ml di tampone fissativo. Etichettare il microtubo da 2 mL con l'identificazione del mouse e "sinistra" per indicare l'occhio sinistro.
      NOTA: Il nick nella cornea consente al fissativo di penetrare facilmente nell'occhio per preservarlo meglio.
    5. Ripetere i passaggi 1.5.1-1.5.4 per l'occhio destro.
  6. Lasciare che gli occhi incubino in tampone fissativo durante la notte su uno shaker in una stanza a 4 ° Celsius (C), ad una velocità di 75 rotazioni al minuto (rpm).
  7. Sostituire il tampone fissativo con 2 mL di 1x tampone fosfato salino (PBS). Incubare gli occhi in 1x PBS per 10 minuti su uno shaker a RT e 75 rpm. Ripetere questo passaggio due volte.
  8. Pulire e sezionare gli occhi per generare segmenti posteriori.
    NOTA: Il segmento posteriore è il bulbo oculare del topo con la retina neurale, RPE, coroide e sclera senza cornea, iride e lente.
    1. Posizionare l'occhio in una capsula di Petri riempita con 1x PBS al microscopio da dissezione (Figura supplementare 4A).
    2. Sollevare delicatamente il grasso e il muscolo lontano dal bulbo oculare con una pinza a punta fine. Tagliare con cura il grasso e il muscolo con forbici micro-dissecanti in direzione parallela al bulbo oculare fino a quando il bulbo oculare ha un colore bluastro-nero uniforme (Figura supplementare 4B).
      NOTA: Non tagliare in direzione perpendicolare, poiché ciò danneggia il bulbo oculare. Inoltre, se il colorante per la marcatura dei tessuti si stacca durante la lavorazione, annotare immediatamente il lato superiore del bulbo oculare.
    3. Posizionare una pinza a punta fine nel sito di puntura corneale. Tagliare attorno al perimetro della cornea, iniziando dal sito di puntura, con forbici micro-dissecanti, per rimuovere la cornea e l'iride dal bulbo oculare (Figura supplementare 4C).
    4. Prendere una pinza a punta fine e rimuovere delicatamente la lente dal bulbo oculare per ottenere il segmento posteriore (Figura supplementare 4D).
    5. Inserire nuovamente il segmento posteriore in un microtubo da 2 mL con 2 mL di 1x PBS. Conservare il segmento posteriore in frigorifero a 4 °C.
      NOTA: I segmenti posteriori possono rimanere in 1x PBS a 4 °C per molte settimane prima di un'ulteriore elaborazione.
  9. Ripetere i passaggi 1.3-1.8 per preparare gli occhi da altri topi nello studio.
  10. Elaborare e incorporare uno dei segmenti posteriori di ciascun topo in paraffina per il sezionamento. Assicurati che il lato superiore del segmento posteriore sia in alto.
    NOTA: Gli autori si affidano al laboratorio TRIP (Translational Research Initiatives in Pathology) dell'Università del Wisconsin-Madison (UW) per eseguire questi compiti. Qui sono pubblicati protocolli che utilizzano un metodo simile di elaborazione e incorporamento della paraffina23,24.
  11. Tagliare e sezionare ogni blocco di paraffina per ottenere una sezione retinica spessa 5 μm che includa la testa del nervo ottico, nonché quattro sezioni retiniche aggiuntive spesse 5 μm che distano 250 μm l'una dall'altra. Etichettare le diapositive con l'identificazione del mouse e il numero di serie della sezione (ad esempio, 1, 2, 3, 4 o 5). Archiviare le diapositive in una casella diapositiva.
    NOTA: Gli autori si affidano al laboratorio UW TRIP per i loro servizi nel sezionamento della paraffina. Qui sono pubblicati protocolli che utilizzano un metodo di sezionamento della paraffina simile25,26.
  12. Colorare i vetrini contenenti sezioni retiniche con ematossilina ed eosina (H&E). Un protocollo di colorazione H&E può essere trovato nella Figura supplementare 5.
    NOTA: Tutte le fasi della procedura di colorazione H&E devono essere completate in una cappa aspirante.
  13. Raccogli immagini cucite di sezioni retiniche colorate con H & E con una barra della scala utilizzando un microscopio ottico con ingrandimento 20x.
  14. Quantificare lo spessore RPE nelle immagini retiniche contenenti la testa del nervo ottico per ciascun campione.
    1. Scarica e apri il programma Fiji ImageJ. Trascinare tutte le immagini della retina cucite contenenti la testa del nervo ottico nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ. Verifica che la scala dell'immagine sia calibrata in μm e non in pixel.
      NOTA: la scala dell'immagine si trova nell'angolo superiore sinistro della finestra contenente un'immagine retinica nel programma Fiji ImageJ. Se la scala è impostata in pixel, fare riferimento al manuale di istruzioni del programma Fiji ImageJ per convertire i pixel in μm.
    2. Segnare ogni intervallo di 300 μm in ogni immagine dal bordo della testa del nervo ottico alla fine della retina (ora serrata). Fare clic sull'icona Dritto nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ. Fare clic e trascinare una linea dal bordo della testa del nervo ottico verso l'ora serrata che è lunga 300 μm. Fare clic sullo strumento Pennello nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ e fare clic sulla fine della linea di 300 μm per contrassegnarla.
    3. Misurare lo spessore RPE ad ogni intervallo contrassegnato. Fare clic sull'icona Dritto nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ. Fare clic e trascinare una linea dall'alto verso il basso dell'RPE (Figura 6 supplementare). Fare clic su Analizza > misura nella barra dei menu Fiji ImageJ per ottenere lo spessore RPE.
    4. Trasferire le misure di spessore RPE in un foglio di calcolo ed etichettare la colonna contenente le misurazioni con l'identificazione del mouse. Etichetta una colonna aggiuntiva con "Intervallo marcato" e inserisci la distanza dai valori del nervo ottico (ad esempio, 300, 600, 900, ecc.)
      NOTA: Il primo intervallo misurato corrisponde a 300 μm di distanza dal nervo ottico, il secondo intervallo misurato corrisponde a 600 μm di distanza e così via.
  15. Quantificare i tassi di incidenza della patologia RPE in base alle immagini retiniche per ciascun campione.
    1. Aprire il programma Fiji ImageJ.
    2. Aprire l'applicazione Cell Counter all'interno del programma Fiji ImageJ. Fare clic su Plugins > Analyze > Cell Counter nella barra dei menu Fiji ImageJ. Trascinare un'immagine retinica nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ e fare clic su Inizializza nella finestra Cell Counter .
    3. Contare il numero di patologie RPE per sezione retinica utilizzando l'applicazione Cell Counter . Fare clic su Tipo 1 sotto Contatori e quindi fare clic su tutti gli eventi di microvacuolizzazione nell'immagine. Fare clic su Tipo 2 sotto Contatori e quindi fare clic su tutti gli eventi di macrovacuolizzazione nell'immagine. Fare clic su Tipo 3 sotto Contatori e quindi fare clic su tutti i singoli eventi di migrazione nell'immagine.
    4. Trasferire i numeri delle patologie RPE in un foglio di calcolo. Etichettare le righe con microvacuolizzazione, macrovacuolizzazione o migrazione e la colonna con l'identificazione del mouse.
    5. Ripetere i passaggi 1.15.2-1.15.4 per altre immagini del campione. Calcolare la media del numero di patologie RPE per campione e dividere per cinque per calcolare il tasso di incidenza di ciascuna patologia RPE per il campione nel foglio di calcolo.
  16. Eseguire analisi statistiche sugli spessori RPE ad ogni intervallo e sui tassi di incidenza della patologia RPE per determinare se ci sono differenze significative tra i gruppi nello studio.

2. Valutazione dell'RPE del topo mediante microscopia elettronica a trasmissione

  1. Tagliare gli altri segmenti posteriori ceduti dopo i passaggi 1,5-1,9 a metà attraverso il segno superiore in due sezioni con una lama di rasoio. Riannotare il lato superiore dei segmenti posteriori sezionati con colorante per marcatura tissutale. Separare i segmenti posteriori sezionati in nuovi microtubi da 2 mL contenenti 2 mL di 1x PBS e identificazione del mouse.
    NOTA: Il segmento posteriore del topo è troppo grande per essere elaborato in un unico pezzo e deve essere tagliato a metà per l'elaborazione al microscopio elettronico a trasmissione.
  2. Risciacquare i tessuti con 2 ml di tampone cacodilato da 0,1 M, pH 7,2. Incubare per 10 minuti a RT sul banco. Ripetere questo passaggio altre due volte.
  3. Sostituire il tampone cacodilato da 0,1 M con 2 ml di tetrossido di osmio al 2% (OsO4) diluito in tampone cacodidilato da 0,1 M. Incubare per 1,5 ore a RT nella cappa aspirante.
    ATTENZIONE: OsO4 è una sostanza velenosa. Si prega di seguire le procedure operative standard quando si lavora con OsO4.
  4. Risciacquare i fazzoletti con 2 ml di tampone cacodilato da 0,1 M per 10 minuti a RT nella cappa aspirante. Ripetere questo passaggio una volta.
  5. Disidratare i tessuti con diluizioni graduate di EtOH comprese tra il 50% e il 100% a RT nella cappa aspirante. Un protocollo per la procedura di disidratazione può essere trovato nella figura supplementare 7.
  6. Rimuovere il 100% di EtOH dai tessuti e aggiungere 2 ml di ossido di propilene ai tessuti. Incubare a RT nella cappa aspirante per 15 min. Rimuovere l'ossido di propilene dai tessuti e aggiungere 2 ml di ossido di propilene fresco ai tessuti. Incubare a RT nella cappa aspirante per 15 min.
    ATTENZIONE: L'ossido di propilene è una sostanza tossica. Si prega di seguire le procedure operative standard quando si lavora con ossido di propilene.
  7. Rimuovere l'ossido di propilene dai tessuti e aggiungere 2 ml di una miscela 1:1 di ossido di propilene e resina ai tessuti. Lasciare per una notte sotto l'aspirapolvere nella cappa aspirante di RT.
    ATTENZIONE: La resina è una sostanza pericolosa per l'uomo. Si prega di seguire le procedure operative standard del laboratorio quando si lavora con la resina.
  8. Sostituire la miscela 1:1 di ossido di propilene e resina dai tessuti con 2 ml di resina pura. Lasciare per una notte sotto l'aspirapolvere nella cappa aspirante di RT .
  9. Incorporare i tessuti in resina. Metti un'etichetta con l'identificazione del mouse a matita e una goccia di resina nello stampo . Posizionare il tessuto sulla goccia di resina. Riempire lo stampo con resina e metterlo sotto vuoto per 1 h a RT nella cappa aspirante.
  10. Riposizionare le etichette e i campioni con una pinza a punta fine, con il lato posteriore della sezione oculare posteriore sulla parte superiore. Lasciare lo stampo per una notte a 65 °C in forno nella cappa aspirante.
  11. Togliere gli stampi dal forno. Lasciare raffreddare gli stampi fino a RT sul piano di lavoro. Rimuovere i blocchi dagli stampi.
    NOTA: i blocchi sono ora pronti per il taglio.
  12. Modella i blocchi di resina con una lama di rasoio per formare un trapezio. Tagliare i blocchi di resina usando un microtomo fino a quando la testa del nervo ottico è visibile. Procedere all'uso di un coltello diamantato per tagliare sezioni semisottili dai blocchi di resina con uno spessore di 0,5 μm.
    NOTA: Ecco un protocollo pubblicato sulla sezione dei microtomi27. Se lo si desidera, è possibile raccogliere e colorare sezioni semisottili spesse 0,5 μm dai blocchi di resina per valutare l'integrità del campione.
  13. Tagliare una sezione ultrasottile spessa 70 nm da ciascun blocco tagliato usando un ultramicrotomo. Raccogliere una sezione ultrasottile spessa 70 nm su una griglia di rame a barra sottile a 400 maglie. Posizionare la griglia in una scatola di archiviazione della griglia ed etichettare lo slot con l'identificazione del mouse.
    NOTA: Ecco un protocollo pubblicato sulla sezione degli ultramicrotomi28.
  14. Colorare le griglie con acetato di uranile al 2% per 5 minuti e poi con una soluzione di citrato di piombo al 3,5% per 5 minuti a RT nella cappa aspirante.
    ATTENZIONE: L'acetato di uranile e il citrato di piombo sono sostanze pericolose. Si prega di seguire le procedure operative standard quando si lavora con queste sostanze.
  15. Ottieni immagini per ogni campione utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione con un ingrandimento di 15.000x, dove le linee della griglia di rame intersecano RPE e BrM.
    NOTA: ci dovrebbero essere almeno da 20 a 35 immagini per sezione e da 40 a 70 immagini per campione.
  16. Quantificare le altezze di BLamD nelle immagini per i campioni nello studio.
    1. Aprire il programma Fiji ImageJ. Trascinare tutte le immagini dalla sezione di esempio nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ. Verifica che le immagini siano calibrate in μm e non in pixel.
    2. Misura l'altezza di BLamD nelle immagini. Fare clic sull'icona Diritto nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ. Fare clic e trascinare una linea dalla lamina elastica di BrM alla parte superiore del deposito più alto nell'immagine (Figura supplementare 8). Fare clic su Analizza > misura nella barra dei menu Fiji ImageJ per ottenere l'altezza BLamD nell'immagine.
      NOTA: Se non ci sono BLamD nell'immagine, tracciare una linea dalla lamina elastica di BrM alla lamina basale dell'RPE.
    3. Trasferisci le altezze BLamD su un foglio di calcolo ed etichetta con identificazione del mouse.
  17. Calcola le frequenze cumulative delle altezze BLamD per genotipo e le medie delle altezze BLamD per mouse nel foglio di calcolo. Eseguire analisi statistiche sulle medie delle altezze BLamD per determinare se ci sono differenze significative tra i gruppi nello studio.

3. Valutazione dell'RPE del topo mediante microscopia confocale

  1. Raccogli gli occhi dai topi. Eutanasia dei topi secondo la procedura descritta al punto 1.3. Enucleare gli occhi usando il punto 1.5. Posizionare gli occhi usando una pinza curva in un microtubo da 2 ml con 2 ml di 1x PBS e identificazione del mouse.
    NOTA: Non adattare al buio i topi, poiché l'interdigitalizzazione dei fotorecettori e dei processi apicali RPE consente una migliore visualizzazione dell'RPE attraverso la microscopia confocale.
  2. Pulire e sezionare immediatamente gli occhi del topo per generare oculari posteriori del topo.
    NOTA: La coppa oculare posteriore è diversa dal segmento posteriore perché non contiene la retina neurale.
    1. Trasferire l'occhio su una capsula di Petri contenente 1x PBS al microscopio da dissezione (Figura supplementare 9A).
    2. Rimuovere il grasso e il muscolo dal bulbo oculare, come descritto al punto 1.8.2 (Figura supplementare 9B).
    3. Nick la cornea del bulbo oculare con una lama di bisturi numero 11. Rimuovere la cornea e l'iride, come descritto al punto 1.8.3 (Figura supplementare 9C).
    4. Estrarre l'obiettivo con una pinza a punta fine. Prendi due pinze a punta fine e separa delicatamente la retina neurale dal segmento posteriore.
    5. Tagliare con cura la retina neurale alla testa del nervo ottico per la rimozione dalla coppa oculare posteriore (Figura supplementare 9D).
    6. Posizionare la coppa oculare posteriore in un nuovo microtubo da 2 mL contenente 500 μL di 1x PBS con identificazione del mouse.
  3. Fissare le conchiglie oculari posteriori con metanolo (MeOH) (Figura supplementare 10).
    NOTA: il passaggio 3.3 richiede circa 2 ore e 40 minuti per essere completato.
    1. Aggiungere 500 μL di MeOH ai tessuti. Incubare su uno shaker a 75 giri / min per 5 minuti a RT.
    2. Rimuovere i 500 μL di soluzione dai tessuti e aggiungere 500 μL di MeOH. Incubare per 5 minuti su uno shaker a 75 giri / min per 5 minuti su RT. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
    3. Rimuovere l'intera soluzione dai tessuti e aggiungere 500 μL di MeOH. Incubare su uno shaker a 75 rpm per almeno 2 h a RT.
      NOTA: In alternativa al punto 3.3.3, la coppa oculare posteriore può essere incubata durante la notte in MeOH su uno shaker a 75 giri/min in una stanza a 4 °C.
    4. Aggiungere 500 μL di 1x PBS ai tessuti. Incubare su uno shaker a 75 giri / min per 5 minuti a RT.
    5. Rimuovere i 500 μL di soluzione dai tessuti e aggiungere 500 μL di 1x PBS. Incubare su uno shaker a 75 giri / min per 5 minuti a RT. Ripetere questo passaggio ancora una volta.
    6. Rimuovere l'intera soluzione dai tessuti e sostituirla con 500 μL di 1x PBS.
      NOTA: I tessuti sono completamente fissati dal MeOH e possono essere conservati in frigorifero a 4 °C per almeno 1 mese.
  4. Eseguire la colorazione con immunofluorescenza delle conchiglie oculari posteriori per visualizzare giunzioni e nuclei stretti dell'RPE (Figura supplementare 11).
    1. Rimuovere i 500 μL di 1x PBS dai campioni e aggiungere 100 μL di siero d'asina normale diluito al 10% in 1x soluzione di PBS. Incubare su uno shaker a 75 giri / min per 30 minuti a RT.
    2. Rimuovere la soluzione diluita di siero d'asino normale al 10% dai campioni e aggiungere 100 μL di una diluizione 1:50 di un anticorpo policlonale anti-Zonula Occludens-1 (ZO-1) di coniglio in 1x PBS. Trasferire i campioni in una stanza a 4 °C e incubare per una notte su uno shaker a 75 giri/min.
    3. Rimuovere la diluizione anticorpale dai campioni e aggiungere 2 ml di 1x PBS. Incubare su uno shaker a 75 rpm per 10 minuti a RT. Ripetere questo passaggio altre due volte.
    4. Rimuovere 1x PBS dai campioni. Aggiungere 100 μL di una diluizione 1:250 di un anticorpo IgG anti-coniglio d'asino con un tag coniugato con fluorofori 488 e una diluizione 1:250 di 4',6-diamidina-2'-fenilindolo dicloridrato (DAPI) in 1x PBS ai campioni. Coprire i campioni con un foglio di alluminio e incubare su uno shaker a 75 giri / min per 2 ore a RT.
      NOTA: I campioni devono essere completamente coperti con un foglio di alluminio per evitare il fotosbiancamento.
    5. Rimuovere l'anticorpo e le diluizioni DAPI dai campioni. Aggiungere 2 ml di 1x PBS ai campioni, ricoprire con un foglio di alluminio e incubare su uno shaker a 75 rpm per 10 minuti a RT. Ripetere questo passaggio altre tre volte.
      NOTA: Le giunzioni strette e i nuclei dell'RPE sono ora completamente etichettati e colorati, rispettivamente.
  5. Montare le conchiglie oculari posteriori su vetrini da microscopio.
    1. Etichettare un vetrino da microscopio con l'identificazione del mouse. Trasferire la coppa oculare posteriore su un vetrino da microscopio sotto un microscopio da dissezione con il lato coroideale rivolto verso il basso. Aggiungere una goccia di 1x PBS all'oculare posteriore per evitare che si secchi (Figura supplementare 12).
    2. Tagliare la coppa oculare posteriore usando una lama di bisturi numero 11 in quattro punti che produrranno quattro quadranti corrispondenti alle direzioni cardinali (cioè nord, est, sud e ovest). Dab eccesso 1x PBS con tessuto dal perimetro della coppa oculare posteriore. Appiattire delicatamente la concia oculare posteriore con una spazzola per capelli di cammello e una pinza a punta fine (Figura supplementare 12).
      NOTA: il prodotto risultante è ora noto come montaggio piatto RPE.
    3. Aggiungere una goccia di supporto di montaggio al supporto piatto RPE e posizionare una copertina sopra di esso. Applicare lo smalto trasparente per sigillare il coprivetrino e lasciarlo asciugare per almeno 30 minuti a RT in un cassetto chiuso. Collocare i vetrini in una scatola portavetrini e conservare la scatola in frigorifero a 4 °C.
      NOTA: fare attenzione a evitare l'introduzione di bolle sul supporto piatto RPE. I supporti piatti RPE possono essere ripresi entro un periodo di tempo di 2 settimane.
  6. Ottenere un'immagine di ciascuno dei quattro quadranti che circondano il nervo ottico della montatura piatta RPE su un microscopio confocale con ingrandimento 20x per ciascun campione. Un esempio di immagine a montaggio piatto RPE può essere trovato nella Figura supplementare 13A.
    NOTA: potrebbe essere necessario eseguire l'imaging z-stack dei supporti piatti RPE in cui vengono scattate e impilate più immagini per compensare le differenze dimensionali del montaggio piatto RPE.
  7. Tracciare le giunzioni strette delle celle RPE all'interno di ciascuna immagine a montaggio piatto RPE. Un esempio di immagine a montaggio piatto RPE tracciata è disponibile nella Figura supplementare 13B.
    1. Aprire il programma Fiji ImageJ. Trascinare un'immagine con montaggio piatto RPE nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ. Verifica che l'immagine sia calibrata in micrometri e non in pixel.
    2. Fare doppio clic sull'icona dello strumento Pennello sovrapposto nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ per impostare la larghezza del pennello su 3, la trasparenza su 0 e il colore su rosso. Fate clic sul pulsante Chiudi nella finestra dello strumento pennello sovrapposto .
    3. Fare clic sull'icona dello strumento Pennello sovrapposizione . Fare clic e trascinare sulle giunzioni strette di tutte le celle RPE che si trovano completamente all'interno dell'immagine.
      NOTA: nel caso in cui venga commesso un errore di ricalco, fare doppio clic sull'icona dello strumento Pennello sovrapposto e fare clic sulla casella Annulla nella finestra dello strumento Pennello sovrapposizione per rimuovere l'errore di ricalco dall'immagine.
    4. Fare clic sull'icona Rettangolo nella barra delle applicazioni Fiji ImageJ. Fai clic sull'immagine e trascina lungo il perimetro dell'immagine. Fare clic su Modifica > Cancella sulla barra dei menu Fiji ImageJ per mantenere le linee tracciate e rimuovere eventuali colori blu e verde dall'immagine.
    5. Salvare l'immagine di traccia in una posizione appropriata con l'identificazione del mouse, la posizione del quadrante (ad esempio, nord, sud, est o ovest) e un'etichetta del suffisso CP.
      NOTA: non salvare l'immagine di traccia RPE prima di aver completato il passaggio 3.7.4.
  8. Calcolare le aree delle celle RPE per ciascun campione.
    1. Designare un percorso in cui salvare i file dall'analisi dell'area RPE creando una cartella sullo schermo del desktop del computer. Generare sottocartelle per ogni immagine di traccia RPE ed etichettare le sottocartelle con l'identificazione del mouse e la posizione del quadrante (ad esempio, nord, sud, est o ovest).
    2. Installare e aprire il programma Cell Profiler29. Scaricare il file di progetto Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj (Supplementary Coding File 1). Aprire il file Ikeda_RPE Area Calculator.cpproj facendo clic su File > Apri progetto nella barra dei menu del programma Cell Profiler.
    3. Trascinare un'immagine di traccia RPE nella casella Immagine > Trascina qui file e cartelle nella finestra del programma Cell Profiler.
    4. Immettere il percorso della cartella nel programma Cell Profiler corrispondente all'immagine di traccia RPE. Fare clic sul pulsante Impostazioni di output nell'angolo in basso a sinistra della finestra del programma Cell Profiler e immettere la posizione della cartella nelle caselle di testo Cartella di input predefinita e Cartella di output predefinita.
    5. Fare clic sul pulsante Analizza immagini nell'angolo in basso a sinistra della finestra del programma Cell Profiler. Al termine dell'analisi, sullo schermo verrà visualizzata una finestra Analisi completata . Fare clic sul pulsante OK nella finestra Analisi completata .
      NOTA: questa azione genererà un file csv e un'immagine jpeg. Il file csv conterrà le aree per le celle RPE all'interno dell'immagine di traccia. L'immagine jpeg corrisponderà all'immagine di traccia RPE, in cui ogni cella RPE sarà etichettata con un numero (Figura supplementare 13C).
    6. Trasferire le aree RPE dal file CSV a un foglio di calcolo. Etichetta il foglio di calcolo con l'identificazione del mouse.
    7. Eseguire un'indagine di controllo qualità dei dati confermando che ogni area RPE nel file CSV si collega a una cella RPE completamente tracciata in un'immagine jpeg. Rimuovere dal foglio di calcolo eventuali valori che non corrispondono a celle RPE completamente tracciate.
    8. Tornare al programma Cell Profiler. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome dell'immagine di traccia RPE nella casella Trascina qui file e cartelle e selezionare Cancella l'elenco per rimuovere l'immagine dal programma Cell Profiler.
    9. Ripetere i passaggi 3.8.3-3.8.8 per calcolare le dimensioni RPE per le restanti tre immagini di traccia RPE del campione.
  9. Quantificare le medie delle dimensioni delle celle RPE per ogni campione nel foglio di calcolo.
  10. Quantificare le densità delle celle RPE per ogni campione nel foglio di calcolo. Per calcolare la densità delle celle RPE, dividere il numero totale di celle RPE per quadrante per l'area totale di celle RPE per quadrante rilevata dal programma Cell Profiler. Determinare la media delle densità delle celle RPE dai quattro quadranti per campione.
  11. Quantificare il numero di celle RPE multinucleate per montaggio piatto RPE per ciascun campione. Utilizzare l'applicazione Cell Counter all'interno del programma Fiji ImageJ, come descritto nei passaggi 1.15.1-1.15.3, per contare il numero di celle RPE con più di tre nuclei in quattro quadranti del campione.
  12. Eseguire analisi statistiche sulle dimensioni delle cellule RPE e sulle medie di densità, nonché sul numero di cellule RPE multinucleate per determinare se ci sono differenze significative tra i gruppi nello studio.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il completamento del protocollo di fenotipizzazione RPE descritto in questo articolo fornisce un'analisi quantitativa delle anomalie strutturali di RPE comunemente osservate nei modelli murini di AMD. Per confermare l'efficacia di questo protocollo, lo abbiamo usato in topi noti per mostrare patologie RPE, inclusi topi transgenici che sovraesprimono WT Tmem135 guidato dal promotore della beta-actina di pollo (Tmem135 TG) 30 e topi C57BL / 6J invecchiati 31,32

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

In questo articolo, abbiamo introdotto un protocollo di fenotipizzazione per valutare le patologie RPE strutturali dei modelli murini. Abbiamo descritto i passaggi necessari per l'elaborazione degli occhi per varie tecniche di imaging tra cui luce, elettrone di trasmissione e microscopia confocale, nonché la quantificazione delle patologie tipiche osservate tramite questi metodi di imaging. Abbiamo dimostrato l'efficacia del nostro protocollo di fenotipizzazione RPE esaminando Tmem135 TG e topi WT di 24...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori di questo protocollo non hanno divulgazioni e conflitti di interesse.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Gli autori desiderano ringraziare Satoshi Kinoshita e il laboratorio TRIP (Translational Research Initiatives in Pathology (TRIP) dell'Università del Wisconsin (UW) per aver preparato i nostri tessuti per la microscopia ottica. Questo nucleo è supportato dal Dipartimento di Patologia e Medicina di Laboratorio della UW, dal Carbone Cancer Center dell'Università del Wisconsin (P30 CA014520) e dall'Ufficio del Direttore-NIH (S10OD023526). La microscopia confocale è stata eseguita presso il nucleo ottico di biochimica UW, che è stato istituito con il supporto del Dipartimento di Biochimica della UW. Questo lavoro è stato sostenuto anche da sovvenzioni del National Eye Institute (R01EY022086 a A. Ikeda; R01EY031748 a C. Bowes Rickman; P30EY016665 al Dipartimento di Oftalmologia e Scienze Visive della UW; P30EY005722 al Duke Eye Center; NIH T32EY027721 a M. Landowski; F32EY032766 a M. Landowski), Presidenza di Timothy William Trout (A. Ikeda), FFB Free Family AMD Award (C. Bowes Rickman); e una sovvenzione illimitata dalla Ricerca per prevenire la cecità (Duke Eye Center).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
0,1 M Cacodylato tampone pH7.2PolyScientiifc R& D CompanyS1619
100 capacità Slide BoxDue sono necessari per questo protocollo (uno per H& Vetrini colorati E e uno per montature piatte RPE.)
100% etanolo MDS Warehouse2292-CASEPuò essere utilizzato per produrre soluzioni di etanolo diluito in questo protocollo.
Rubinetto a 1 via, 2 luer femmina LockQosina11069
1x soluzione tampone fosfato (PBS)In questo protocollo è possibile utilizzare 1x PBS prefabbricato.
Microprovette da 2,0 mLGenesee Scientific 24-283-LR
Stampo sostitutivo della capsula di inclusione a 24 cavitàMicroscopia elettronica Scienze70165
Tubi in PVC da 24 pollici con estremità LuerFisher ScientificNC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh GriglieMicroscopia elettronica SciencesT400-CU
95% etanoloMDS Warehouse2293-CASE
Sottocuscinetti assorbenti con barriera impermeabile all'umidità (23 pollici per 24 pollici)VWR56616-031
regolabile 237 ml  Flacone sprayVWR23609-182
Alexa Fluor488 Asino coniugato anti-coniglio IgG Thermo Fisher ScientificA-21206
Foglio
BD Precision glide 19 Gauge Ago per siringaSigma-Aldrich 
Pinze per felci; Curvo; Sottili dentellature trasversali; 4" di lunghezza, 1 mm di larghezza della punta Strumentochirurgico RobozRS-5211Conosciuto come pinza curva in questo protocollo.
Spazzola in pelo di cammelloMicroscopia elettronica Scienze65575-02
eutanasia
carbonica Flussometro
carbonica Serbatoio di anidride carbonica Castaloy
Prong Extension ClampsFisher Scientific 05-769-7Q
Supporto base a forma di L in ghisaFisher Scientific 11-474-207
Cell ProliferDisponibile per il download: https://cellprofiler.org/releases
Smalto trasparente per microscopiaelettronica Sciences72180
Colorfrost Vetrini per microscopio LavandaVWR10118-956
Computer
DAPISigma-AldrichD9542-5MG
questo protocollo è stata utilizzata l'acquadistillata H20
Dumont pinzetta a punta sottile; Modello #55Strumento chirurgico RobozRS-4984Noto come pinza a punta fine in questo protocollo, e ne sono necessari 3 per questo protocollo (due per le dissezioni e uno per l'elaborazione al microscopio elettronico).
per griglia per microscopia elettronica Scienzemicroscopia elettronica71147-01
EPON 815 Scienzemicroscopia elettronica14910
Epredia Mark-It Marcatura dei tessuti Colorante gialloFisher Scientific 22050460Si prega di seguire il protocollo del produttore quando si utilizza questo colorante per la marcatura dei tessuti.
Epredia Supporti di montaggioFisher Scientific22-110-610Utilizzare per il montaggio H& E diapositive.
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series, 150 w Sorgente luminosa alogenaDolan-Jenner IndustriesMi-150Sorgente luminosa per microscopio da dissezione.
Fiji ImageJDisponibile per il download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook ConnectorThermo Scientific   14-666-18Q
Cappa
Glutaraldeide 2,5% in tampone fosfato, pH 7,4, 32%Microscopia elettronica Scienze16537-05
JEM-1400 Microscopio elettronico a trasmissione (JEOL) con agitatore
Due sono necessari per questi esperimenti. Uno dovrebbe essere a temperatura ambiente mentre l'altro dovrebbe essere in una cella frigorifera di 4 gradi Celsius.
Etichette per etichette laser criogenicheScienze della microscopia elettronica77564-05
Microscopia elettronicacitrato di piomboScienze 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlipsThermo Fisher Scientific22X22I24788001LSUtilizzare questi vetrini coprioggetti per i supporti piatti RPE in quanto hanno bordi rialzati e si adattano allo spessore dell'RPE.
Ematossilina di MayerVWR100504-406
Forbici a molla per microdissezione McPherson-VannasStrumento chirurgico RobozRS-5600Noto come forbici per micro-dissezione nel protocollo.
MetanoloFisher Scientific Mouse A412-4
dimouse AMD e i relativi controlli possono funzionare per questo protocollo.
Forbici per micro dissezione; Versione Standard; Curvo; punte acuminate; Lunghezza lama 24 mm; 4,5" di lunghezza totale Strumentochirurgico RobozRS-5913Conosciuto come forbici curve in questo protocollo.
Rack per microprovette
Nikon A1RS
Scienze della microscopia elettronica19150
Paraformaldeide, 32%Scienze della microscopia elettronica15714-S
Piastra
VWR21909-380
Puntali per
Pipette 
Anticorpo policlonale anti-ZO-1Thermo Fisher Scientific402200
Microscopia elettronica all'ossido di propileneScienze20412
Lama di rasoioVWR10040-386
Vassoio poco profondo per perfusioni di topi
Shandon eosina e alcolicoVWR89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Nero Pennarello PermanenteGraffette642736
Slide Rack per Colorazione Grainger49WF31
Copertura Quadrata VetriniFisher Scientific 12-541B
Piatto di colorazione con coperchioGrainger49WF30Need 15 per H & E procedura di colorazione.
Siringa Luer-Slip monouso Target da 50 mL interamente in plastica Thermo Scientific S7510-50Utilizzare solo il corpo della siringa.
TimerFisher1464917
Microscopia elettronica all'acetato di uranileScienze22400
Forno a
Vectashield Montaggio MedioVettoriale LaboratoriH-1000Utilizzare per il montaggio di montature piatte RPE.
XyleneFisher Scientific 
MicroscopioQuesto microscopio ha la capacità di generare immagini unite 20x. Se un microscopio ottico non ha questa capacità, scatta immagini dell'intera retina che si sovrappongono leggermente l'una all'altra. Usa Adobe Photoshop per unire queste immagini. Si prega di fare riferimento ai manuali del programma Adobe Photoshop per lo stitching delle immagini.
Zeiss Stemi 2000 Microscopio da dissezioneMicroscopia elettronica Scienze65575-02
di alluminioZ192546 Camera di di anidridedi anidrideProgramma In del sistema di purificazione Milli-Q.Supporto della della in resina Programma aspirante da banco da laboratorio con telecamera CCD ORIUS (1000) alQualsiasi modello Microsoft Excel Microscopio confocale Siero d'asino normale SouthernBiotech 0030-01 Numero 11 Lame per bisturi monouso sterili VWR 21909-380 Tetrossido di osmio  di Petri a matita pipettevuoto22050283 ottico Zeiss Axio Imager 2

References

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