Un protocollo per valutare e quantificare le patologie dell'epitelio pigmentato retinico in modelli murini di degenerazione maculare legata all'età

Summary

I modelli murini possono essere strumenti utili per studiare la biologia dell'epitelio pigmentato retinico (RPE). È stato stabilito che i topi possono sviluppare una serie di patologie RPE. Qui, descriviamo un protocollo di fenotipizzazione per chiarire e quantificare le patologie RPE nei topi utilizzando luce, elettrone di trasmissione e microscopia confocale.

Abstract

La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è una malattia debilitante della retina nelle popolazioni che invecchiano. È opinione diffusa che la disfunzione dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) sia un evento patobiologico chiave nell'AMD. Per comprendere i meccanismi che portano alla disfunzione RPE, i modelli murini possono essere utilizzati dai ricercatori. È stato stabilito da studi precedenti che i topi possono sviluppare patologie RPE, alcune delle quali sono osservate negli occhi di individui con diagnosi di AMD. Qui, descriviamo un protocollo di fenotipizzazione per valutare le patologie RPE nei topi. Questo protocollo include la preparazione e la valutazione delle sezioni trasversali retiniche mediante microscopia ottica e microscopia elettronica a trasmissione, nonché quella dei supporti piani RPE mediante microscopia confocale. Descriviamo in dettaglio i tipi comuni di patologie RPE murine osservate da queste tecniche e i modi per quantificarle attraverso metodi imparziali per i test statistici. Come prova del concetto, utilizziamo questo protocollo di fenotipizzazione RPE per quantificare le patologie RPE osservate nei topi che sovraesprimono la proteina transmembrana 135 (Tmem135) e nei topi C57BL/6J wild-type invecchiati. L'obiettivo principale di questo protocollo è quello di presentare metodi standard di fenotipizzazione RPE con valutazioni quantitative imparziali per gli scienziati che utilizzano modelli murini di AMD.

Introduction

La degenerazione maculare legata all'età (AMD) è una malattia accecante comune che colpisce le popolazioni di età superiore ai 55^{anni 1}. Molti ricercatori ritengono che la disfunzione all'interno dell'epitelio pigmentato retinico (RPE) sia un evento patobiologico precoce e cruciale nell'AMD². L'RPE è un monostrato di cellule polarizzate che ha il compito di mantenere l'omeostasi dei fotorecettori vicini e dei vasi sanguigni coroideali³. Esistono vari modelli per studiare i meccanismi associati alla malattia all'interno dell'RPE, compresi i modelli di coltura cellulare

Protocol

Tutte le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee presso l'Università del Wisconsin-Madison e sono in aderenza con la dichiarazione dell'Associazione per la ricerca in visione e oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva.

1. Valutazione dell'RPE del mouse mediante microscopia ottica

1. Fare un tampone fissativo che abbia una concentrazione finale del 2% di paraformaldeide e del 2% di glutaraldeide a temperatura ambiente (RT) in una bottiglia di vetro.
   NOTA: questo protocollo richiede, al massimo, 14 mL di buffer ....

Results

Il completamento del protocollo di fenotipizzazione RPE descritto in questo articolo fornisce un'analisi quantitativa delle anomalie strutturali di RPE comunemente osservate nei modelli murini di AMD. Per confermare l'efficacia di questo protocollo, lo abbiamo usato in topi noti per mostrare patologie RPE, inclusi topi transgenici che sovraesprimono WT Tmem135 guidato dal promotore della beta-actina di pollo (Tmem135 TG) 30 e topi C57BL / 6J invecchiati ^31,32

Discussion

In questo articolo, abbiamo introdotto un protocollo di fenotipizzazione per valutare le patologie RPE strutturali dei modelli murini. Abbiamo descritto i passaggi necessari per l'elaborazione degli occhi per varie tecniche di imaging tra cui luce, elettrone di trasmissione e microscopia confocale, nonché la quantificazione delle patologie tipiche osservate tramite questi metodi di imaging. Abbiamo dimostrato l'efficacia del nostro protocollo di fenotipizzazione RPE esaminando Tmem135 TG e topi WT di 24.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,1 M Cacodylato tampone pH7.2	PolyScientiifc R& D Company	S1619
100 capacità Slide Box			Due sono necessari per questo protocollo (uno per H& Vetrini colorati E e uno per montature piatte RPE.)
100% etanolo	MDS Warehouse	2292-CASE	Può essere utilizzato per produrre soluzioni di etanolo diluito in questo protocollo.
Rubinetto a 1 via, 2 luer femmina Lock	Qosina	11069
1x soluzione tampone fosfato (PBS)			In questo protocollo è possibile utilizzare 1x PBS prefabbricato.
Microprovette da 2,0 mL	Genesee Scientific	24-283-LR
Stampo sostitutivo della capsula di inclusione a 24 cavità	Microscopia elettronica Scienze	70165
Tubi in PVC da 24 pollici con estremità Luer	Fisher Scientific	NC1376778
400 Mesh Gilder Thin Bar Square Mesh Griglie	Microscopia elettronica Sciences	T400-CU
95% etanolo	MDS Warehouse	2293-CASE
Sottocuscinetti assorbenti con barriera impermeabile all'umidità (23 pollici per 24 pollici)	VWR	56616-031
regolabile 237 ml  Flacone spray	VWR	23609-182
Alexa Fluor488 Asino coniugato anti-coniglio IgG	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Foglio
BD Precision glide 19 Gauge Ago per siringa	Sigma-Aldrich
Pinze per felci; Curvo; Sottili dentellature trasversali; 4" di lunghezza, 1 mm di larghezza della punta Strumento	chirurgico Roboz	RS-5211	Conosciuto come pinza curva in questo protocollo.
Spazzola in pelo di cammello	Microscopia elettronica Scienze	65575-02
eutanasia
carbonica Flussometro
carbonica Serbatoio di anidride carbonica Castaloy
Prong Extension Clamps	Fisher Scientific	05-769-7Q
Supporto base a forma di L in ghisa	Fisher Scientific	11-474-207
		Cell Prolifer	Disponibile per il download: https://cellprofiler.org/releases
Smalto trasparente per microscopia	elettronica Sciences	72180
Colorfrost Vetrini per microscopio Lavanda	VWR	10118-956
Computer
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-5MG
questo protocollo è stata utilizzata l'acqua	distillata H20
Dumont pinzetta a punta sottile; Modello #55	Strumento chirurgico Roboz	RS-4984	Noto come pinza a punta fine in questo protocollo, e ne sono necessari 3 per questo protocollo (due per le dissezioni e uno per l'elaborazione al microscopio elettronico).
per griglia per microscopia elettronica Scienze	microscopia elettronica	71147-01
EPON 815 Scienze	microscopia elettronica	14910
Epredia Mark-It Marcatura dei tessuti Colorante giallo	Fisher Scientific	22050460	Si prega di seguire il protocollo del produttore quando si utilizza questo colorante per la marcatura dei tessuti.
Epredia Supporti di montaggio	Fisher Scientific	22-110-610	Utilizzare per il montaggio H& E diapositive.
Fiber-Lite Mi-150 Illuminator Series, 150 w Sorgente luminosa alogena	Dolan-Jenner Industries	Mi-150	Sorgente luminosa per microscopio da dissezione.
		Fiji ImageJ	Disponibile per il download: https://imagej.net/downloads
Flexaframe Castaloy Hook Connector	Thermo Scientific	14-666-18Q
Cappa
Glutaraldeide 2,5% in tampone fosfato, pH 7,4, 32%	Microscopia elettronica Scienze	16537-05
JEM-1400 Microscopio elettronico a trasmissione (JEOL) con agitatore
			Due sono necessari per questi esperimenti. Uno dovrebbe essere a temperatura ambiente mentre l'altro dovrebbe essere in una cella frigorifera di 4 gradi Celsius.
Etichette per etichette laser criogeniche	Scienze della microscopia elettronica	77564-05
Microscopia elettronica	citrato di piombo	Scienze 17800
Leica EM UC7Ultramicrotome
Leica Reichert Ultracut S Microtome
LifterSlips	Thermo Fisher Scientific	22X22I24788001LS	Utilizzare questi vetrini coprioggetti per i supporti piatti RPE in quanto hanno bordi rialzati e si adattano allo spessore dell'RPE.
Ematossilina di Mayer	VWR	100504-406
Forbici a molla per microdissezione McPherson-Vannas	Strumento chirurgico Roboz	RS-5600	Noto come forbici per micro-dissezione nel protocollo.
Metanolo	Fisher Scientific	Mouse A412-4
di			mouse AMD e i relativi controlli possono funzionare per questo protocollo.
Forbici per micro dissezione; Versione Standard; Curvo; punte acuminate; Lunghezza lama 24 mm; 4,5" di lunghezza totale Strumento	chirurgico Roboz	RS-5913	Conosciuto come forbici curve in questo protocollo.
Rack per microprovette
Nikon A1RS
	Scienze della microscopia elettronica	19150
Paraformaldeide, 32%	Scienze della microscopia elettronica	15714-S
Piastra
	VWR	21909-380
Puntali per
Pipette
Anticorpo policlonale anti-ZO-1	Thermo Fisher Scientific	402200
Microscopia elettronica all'ossido di propilene	Scienze	20412
Lama di rasoio	VWR	10040-386
Vassoio poco profondo per perfusioni di topi
Shandon eosina e alcolico	VWR	89370-828
Sharpie Ultra Fine Tip Nero Pennarello Permanente	Graffette	642736
Slide Rack per Colorazione Grainger		49WF31
Copertura Quadrata Vetrini	Fisher Scientific	12-541B
Piatto di colorazione con coperchio	Grainger	49WF30	Need 15 per H & E procedura di colorazione.
Siringa Luer-Slip monouso Target da 50 mL interamente in plastica	Thermo Scientific	S7510-50	Utilizzare solo il corpo della siringa.
Timer	Fisher	1464917
Microscopia elettronica all'acetato di uranile	Scienze	22400
Forno a
Vectashield Montaggio Medio	Vettoriale Laboratori	H-1000	Utilizzare per il montaggio di montature piatte RPE.
Xylene	Fisher Scientific
Microscopio			Questo microscopio ha la capacità di generare immagini unite 20x. Se un microscopio ottico non ha questa capacità, scatta immagini dell'intera retina che si sovrappongono leggermente l'una all'altra. Usa Adobe Photoshop per unire queste immagini. Si prega di fare riferimento ai manuali del programma Adobe Photoshop per lo stitching delle immagini.
Zeiss Stemi 2000 Microscopio da dissezione	Microscopia elettronica Scienze	65575-02