Ottimizzazione del processo di preparazione dei campioni per la microscopia elettronica a trasmissione delle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila

Summary

Questo rapporto fornisce una nuova procedura di preparazione del campione per la visualizzazione delle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila . Questo metodo è più efficace nel prevenire l'arricciamento dei campioni rispetto al metodo tradizionale ed è particolarmente utile per l'analisi ultrastrutturale della giunzione neuromuscolare della Drosophila .

Abstract

La giunzione neuromuscolare della Drosophila (NMJ) è emersa come un prezioso sistema modello nel campo delle neuroscienze. L'applicazione della microscopia confocale presso l'NMJ di Drosophila consente ai ricercatori di acquisire informazioni sinaptiche, comprendendo sia dati quantitativi sull'abbondanza delle sinapsi che approfondimenti dettagliati sulla loro morfologia. Tuttavia, la distribuzione diffusa e il raggio visivo limitato del TEM presentano sfide per l'analisi ultrastrutturale. Questo studio introduce un metodo di preparazione dei campioni innovativo ed efficiente che supera l'approccio convenzionale. La procedura inizia posizionando una rete metallica alla base di una bottiglia a fondo piatto o di una provetta, seguita dal posizionamento di campioni di larve fisse sulla rete. Una rete aggiuntiva viene posizionata sopra i campioni, assicurandosi che siano posizionati tra le due maglie. I campioni fissati vengono accuratamente disidratati e infiltrati prima di procedere con la procedura di inclusione. Quindi l'inclusione dei campioni in resina epossidica viene eseguita in modo piatto, il che consente la preparazione dei muscoli per il posizionamento e il sezionamento. Beneficiando di questi passaggi, tutti i muscoli delle larve di Drosophila possono essere visualizzati al microscopio ottico, facilitando così il successivo posizionamento e sezionamento. La resina in eccesso viene rimossa dopo aver localizzato il 6^{° e il} 7^{° muscolo dei} segmenti del corpo A₂ e A₃. Viene eseguita una sezionamento seriale ultrasottile del 6^{° o 7° muscolo.}

Introduction

La microscopia elettronica è uno dei metodi più ideali per studiare l'ultrastruttura dei materiali biologici in grado di dimostrare visivamente e accuratamente la struttura interna delle cellule^{al livello 1} della nanoscala. Tuttavia, a causa della complessità del processo di preparazione del campione e del costo elevato, la microscopia elettronica non è così popolare come la microscopia ottica. I recenti progressi nelle tecniche di microscopia elettronica hanno portato a miglioramenti significativi nella qualità dell'immagine, in coincidenza con una notevole riduzione del carico di lavoro associato. Di conseguenza, la microscopia elettronica ha....

Protocol

NOTA: Il metodo di preparazione del campione al microscopio elettronico a trasmissione utilizzato in questo articolo è stato riportato in precedenza¹⁶. È importante notare che la selezione dei reagenti e l'aggiustamento del dosaggio sono necessari a seconda del campione. Ci sono molti reagenti chimici tossici utilizzati nel processo di preparazione del campione, quindi l'operatore deve adottare determinate misure protettive, come indossare indumenti e guanti protettivi e operare in una cappa aspirante.

1. Procedura di dissezione, fissazione e posizionamento

1. Dissezione
   1. Sezionare le la....

Results

La parete corporea della larva di Drosophila è composta da 30 fibre muscolari identificabili disposte in uno schema regolare e si presenta come una fetta sottile dopo la dissezione e la fissazione²¹ (Figura 1A). Il campione rimane piatto durante il processo di disidratazione a causa della presenza delle reti metalliche (Figura 1B, C). Il muscolo larvale del corpo è sepolto in una sottile piastra di resina epossid.......

Discussion

I campioni di larve di Drosophila tendono ad arricciarsi durante la disidratazione, poiché i campioni sono sottili, rendendo difficile localizzare con precisione la giunzione neuromuscolare, aumentando così la difficoltà e il carico di lavoro per la preparazione del campione. Il miglioramento tradizionale consiste nell'accorciare il campione⁷, ma i campioni erano ancora arricciati in misura diversa.

Nel nostro metodo, ci sono due passaggi critici: in primo luog.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,2-Epossipropano	SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD	JYJ 037-2015	Agente penetrante
Drosophila Stocks	Bloomington	none	I ceppi di Drosophila di controllo wild-type utilizzati in questa ricerca erano tutti W1118 e sono stati allevati secondo metodi di coltura standard
Provette in vetro a fondo piatto	Haimen Chenxing Experimental equipment Company...	nessuna	Provette in vetro a fondo piatto (bottiglia) con tappo in spugna (o tappo per bottiglia)
K4M reticolante	Agar Scientific	Cat# 1924B	Le resine di inclusione si basano su una formula di acrilato e metacrilato altamente reticolato.
Resina K4M (monomero B)	Agar Scientific	Lot # 631557	Resina Monomero
Film di polivinile	Haimen Chenxing Experimental Equipment Company	nessuno	Il film di polietilene trasparente è il migliore, spessore di circa 0,2 mm
SPI Chem DDSA	SPI SpI	#02827-AF	Dodecenil Anidride Succinica
SPI-Chem DMP-30 Epossidico	SPI	02823-DA	Acceleratore
SPI-Chem NMA	SPI SpI	#02828-AF	Indurente per resina epossidica
SPI-PON 812 Epossidica	SPI	SPI#0259-AB	Monomero
di resinaMaglia d'acciaio	Yuhuiyuan Gardening Store(online)	none	Rete di rame o acciaio inossidabile
Microscopia elettronica a trasmissione	Hitachi H-7650	11416692	Tutte le griglie (su cui sono stati raccolti i campioni) sono state colorate con citrato di piombo e osservate al microscopio elettronico a trasmissione.
Microtomo ultrasottile Microtomo ultrasottile	Leica UC7	595915	Tutte le operazioni di sezionamento vengono eseguite su un microtomo ultrasottile Leica UC7 utilizzando un coltello diamantato