Questo rapporto fornisce una nuova procedura di preparazione del campione per la visualizzazione delle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila . Questo metodo è più efficace nel prevenire l'arricciamento dei campioni rispetto al metodo tradizionale ed è particolarmente utile per l'analisi ultrastrutturale della giunzione neuromuscolare della Drosophila .
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Articolo metodologico
Ottimizzazione del processo di preparazione dei campioni per la microscopia elettronica a trasmissione delle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila
In questo articolo
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Sommario
Abstract
La giunzione neuromuscolare della Drosophila (NMJ) è emersa come un prezioso sistema modello nel campo delle neuroscienze. L'applicazione della microscopia confocale presso l'NMJ di Drosophila consente ai ricercatori di acquisire informazioni sinaptiche, comprendendo sia dati quantitativi sull'abbondanza delle sinapsi che approfondimenti dettagliati sulla loro morfologia. Tuttavia, la distribuzione diffusa e il raggio visivo limitato del TEM presentano sfide per l'analisi ultrastrutturale. Questo studio introduce un metodo di preparazione dei campioni innovativo ed efficiente che supera l'approccio convenzionale. La procedura inizia posizionando una rete metallica alla base di una bottiglia a fondo piatto o di una provetta, seguita dal posizionamento di campioni di larve fisse sulla rete. Una rete aggiuntiva viene posizionata sopra i campioni, assicurandosi che siano posizionati tra le due maglie. I campioni fissati vengono accuratamente disidratati e infiltrati prima di procedere con la procedura di inclusione. Quindi l'inclusione dei campioni in resina epossidica viene eseguita in modo piatto, il che consente la preparazione dei muscoli per il posizionamento e il sezionamento. Beneficiando di questi passaggi, tutti i muscoli delle larve di Drosophila possono essere visualizzati al microscopio ottico, facilitando così il successivo posizionamento e sezionamento. La resina in eccesso viene rimossa dopo aver localizzato il 6° e il 7° muscolo dei segmenti del corpo A2 e A3. Viene eseguita una sezionamento seriale ultrasottile del 6° o 7° muscolo.
Introduzione
La microscopia elettronica è uno dei metodi più ideali per studiare l'ultrastruttura dei materiali biologici in grado di dimostrare visivamente e accuratamente la struttura interna delle celluleal livello 1 della nanoscala. Tuttavia, a causa della complessità del processo di preparazione del campione e del costo elevato, la microscopia elettronica non è così popolare come la microscopia ottica. I recenti progressi nelle tecniche di microscopia elettronica hanno portato a miglioramenti significativi nella qualità dell'immagine, in coincidenza con una notevole riduzione del carico di lavoro associato. Di conseguenza, la microscopia elettronica ha assunto un ruolo importante nel progresso delle conoscenze scientifiche in diversi campi2.
La Drosophila è un eccellente modello animale per eseguire manipolazioni genetiche per controllare con precisione l'espressione spaziale e temporale dei geni bersaglio3. Inoltre, la Drosophila ha i vantaggi di un breve periodo di crescita e di un facile allevamento rispetto ai modelli di mammiferi; pertanto, la Drosophila è ampiamente utilizzata nella ricerca morfologica 4,5.
Nelle larve di Drosophila, i bottoni della giunzione neuromuscolare (NMJ) sono ampiamente distribuiti nei muscoli 6,7 e l'immunocolorazione della NMJ può facilmente fornire informazioni sulla quantità e la morfologia delle sinapsi 8,9 . I bottoni NMJ situati nel 6°/7° muscolo dei segmenti A2 e A3 sono adatti per la ricerca quantitativa e morfologica utilizzando la microscopia ottica. Ciò è dovuto alle loro dimensioni e abbondanza10,11. Pertanto, le NMJ delle larve di Drosophila sono considerate un modello utile per la ricerca neuroscientifica12.
Tuttavia, è difficile osservare l'ultrastruttura a bottone NMJ da parte del TEM. Poiché la finestra di scansione della microscopia elettronica a trasmissione è ristretta, è difficile posizionare i bottoni NMJ13, ampiamente distribuiti. L'altro motivo è che la parete corporea della Drosophila è suscettibile all'arricciamento durante la fase di disidratazione alcolica del protocollo di preparazione del campione7.
Gli studi tradizionali hanno solitamente scelto i bottoni tra il 6° e il 7° muscolo dei segmenti A2 e A3 come materiali campione a causa della loro abbondanza e delle dimensioni14,15. I muscoli 6° e 7° dei segmenti A2 e A3 sono più grandi degli altri muscoli e contengono più bottoni. Tuttavia, quando i campioni venivano preparati per la microscopia elettronica, i campioni fissati tendevano a diventare sottili e inclini ad arricciarsi, portando così a un posizionamento improprio del 6° e 7° muscolo dei segmenti A2 e A3.
Riportiamo con la presente una nuova procedura di processamento che risulta più efficace nel prevenire l'arricciamento dei campioni rispetto al metodo tradizionale di preparazione dei campioni 7,16, consentendo ai campioni di rimanere piatti durante la successiva disidratazione, facilitando così un migliore posizionamento delle giunzioni neuromuscolari larvali di Drosophila.
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Protocollo
NOTA: Il metodo di preparazione del campione al microscopio elettronico a trasmissione utilizzato in questo articolo è stato riportato in precedenza16. È importante notare che la selezione dei reagenti e l'aggiustamento del dosaggio sono necessari a seconda del campione. Ci sono molti reagenti chimici tossici utilizzati nel processo di preparazione del campione, quindi l'operatore deve adottare determinate misure protettive, come indossare indumenti e guanti protettivi e operare in una cappa aspirante.
1. Procedura di dissezione, fissazione e posizionamento
- Dissezione
- Sezionare le larve erranti del tardo 3° stadio nella soluzione di Jan e ottenere l'intera parete corporea in base alle procedure standard17. Preparare la soluzione di Jan come segue: 128 mM di NaCl, 2 mM di KCl, 4 mM di MgCl2, 35 mM di saccarosio, 5 mM di HEPES, pH 7,4
NOTA: La parete corporea delle larve di Drosophila si riferisce al rivestimento esterno o al tegumento dello stadio larvale del moscerino della frutta Drosophila. Ciò include la cuticola, le cellule epidermiche e i tessuti sottostanti che formano l'esoscheletro larvale. La parete corporea fornisce supporto strutturale e protezione e funge da barriera tra il corpo larvale e l'ambiente esterno17.
- Sezionare le larve erranti del tardo 3° stadio nella soluzione di Jan e ottenere l'intera parete corporea in base alle procedure standard17. Preparare la soluzione di Jan come segue: 128 mM di NaCl, 2 mM di KCl, 4 mM di MgCl2, 35 mM di saccarosio, 5 mM di HEPES, pH 7,4
- Fissazione
- Fissare la parete del corpo larvale nella camera di dissezione a 4 °C durante la notte con il fissativo. Per preparare il fissativo, mescolare il 2% di glutaraldeide e il 2% di formaldeide in tampone cacodilato di sodio 0,1 M (pH 7,4)
- Sciacquare i campioni più volte con tampone di cacodilato di sodio.
- Preparare l'1% di OsO4 in tampone di cacodilato. Fissare i campioni in OsO4 all'1% per 2 ore, seguiti da diversi risciacqui in acqua distillata.
NOTA: La doppia fissazione con aldeidi e OsO4 fornisce una migliore protezione dell'ultrastruttura cellulare. Inoltre, OsO4 può colorare il tessuto del campione, consentendo che il contrasto tra la luce e il campione sia più evidente18. - Colorare i campioni di giunzione neuromuscolare di Drosophila con acetato di uranile saturo al 2% per 2 ore, seguiti da diversi risciacqui con acqua deionizzata (Figura 1A).
- Posizionamento del campione
- Tagliare due pezzi rotondi di rete metallica di dimensioni simili (dimensione dei pori 270 μm) con le forbici.
- Posizionare preventivamente una rete metallica (270 μm) alla base di una bottiglia a fondo piatto.
- Posizionare i campioni di larva fissati sulla rete e quindi posizionare un'altra rete su di essi in modo che i campioni siano posizionati tra le due reti.
2. Disidratazione
NOTA In questo articolo è stato utilizzato il metodo di disidratazione a gradiente di etanolo.
- Disidratare i campioni in un gradiente di concentrazione crescente di etanolo in sequenza (50%, 70%, 85%, 95% una volta ciascuno, 100% due volte), ciascuno per 20 minuti a 4 °C.
- Sciacquare i campioni due volte con ossido di propilene a temperatura ambiente per 5 minuti ogni volta (Figura 1C).
3. Infiltrazione
NOTA: L'infiltrazione è una delle fasi necessarie per la preparazione del campione TEM. L'infiltrazione consente la sostituzione graduale del mezzo di disidratazione con il mezzo di inclusione nel campione per consentire il riempimento dell'interstizio della cella con il mezzo di inclusione19.
- Porre i campioni nella soluzione miscelata di ossido di propilene e resina epossidica in un rapporto di 1:1 e 1:2 per 1 ora ciascuno, seguita da resina epossidica pura per 2 ore a temperatura ambiente.
4. Incorporamento
- Preparare una pellicola di polietilene e tagliarla in un quadrato grande (circa 5 × 5 cm) e un piccolo supporto rettangolare cavo (circa 2 × 2 cm). Incolla il quadrato piccolo con il quadrato grande.
- Preposizionare una quantità sufficiente di resina epossidica al centro del grande quadrato.
- Posizionare i campioni nella resina epossidica preposizionata con il lato muscolare rivolto verso l'alto. Usa uno stereoscopio.
- Aggiungere diverse gocce di resina ai campioni e poi coprirli con una pellicola di PE (un po' più grande del distanziatore) (Figura 1D-E).
- Polimerizzare i campioni a 37 °C, 42 °C e 60 °C rispettivamente per 24 ore (Figura 1F).
5. Procedura di sezionamento
- Rimuovere le parti in eccesso della parete del corpo larvale con una lama affilata e mantenere un trapezio, compreso il segmento A2/A3 .
NOTA: La linea superiore deve essere vicina al 13° muscolo e la linea di base deve essere lontana dal campione rispetto alla resina epossidica. L'altezza tra la linea superiore e la linea di base è di circa 5-8 mm. - Rimuovere il trapezio dal resto del campione e farlo aderire alla capsula riempita di resina con la colla A/B.
- Confermare la posizione del 6° e 7° muscolo dei segmenti A2 e A3 al microscopio ottico (Figura 1G) e mantenere il piano tangente parallelo al 6° muscolo.
- Tagliare un quinto del campione lungo i due lati del segmento A3 .
NOTA: Rimuovere la maggior parte del 6° muscolo e mantenere 1/3 della larghezza del 7° muscolo. - Utilizzando un microtomo ultrasottile, preparare una sezione ultrasottile del campione iniziando dal 6° muscolo.
NOTA: Ogni fetta ha uno spessore di circa 90 nm. - Attacca il maggior numero possibile di fette a ciascuna rete di rame.
- Eseguire la microscopia elettronica a trasmissione come descritto in precedenza16.
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Risultati
La parete corporea della larva di Drosophila è composta da 30 fibre muscolari identificabili disposte in uno schema regolare e si presenta come una fetta sottile dopo la dissezione e la fissazione21 (Figura 1A). Il campione rimane piatto durante il processo di disidratazione a causa della presenza delle reti metalliche (Figura 1B, C). Il muscolo larvale del corpo è sepolto in una sottile piastra di resina epossid...
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Discussione
I campioni di larve di Drosophila tendono ad arricciarsi durante la disidratazione, poiché i campioni sono sottili, rendendo difficile localizzare con precisione la giunzione neuromuscolare, aumentando così la difficoltà e il carico di lavoro per la preparazione del campione. Il miglioramento tradizionale consiste nell'accorciare il campione7, ma i campioni erano ancora arricciati in misura diversa.
Nel nostro metodo, ci sono due passaggi critici: in primo luog...
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato supportato dalla Natural Science Foundation of China Grant 32070811 e dal Southeast University (China) Analysis Test Fund 11240090971. Ringraziamo il Laboratorio di Microscopia Elettronica e il Centro di Analisi Morfologica, Scuola di Medicina, Università del Sud-Est, Nanchino, Cina.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 1,2-Epossipropano | SHANGHAI LING FENG CHEMICAL REAGENT CO., LTD | JYJ 037-2015 | Agente penetrante |
| Drosophila Stocks | Bloomington | none | I ceppi di Drosophila di controllo wild-type utilizzati in questa ricerca erano tutti W1118 e sono stati allevati secondo metodi di coltura standard |
| Provette in vetro a fondo piatto | Haimen Chenxing Experimental equipment Company... | nessuna | Provette in vetro a fondo piatto (bottiglia) con tappo in spugna (o tappo per bottiglia) |
| K4M reticolante | Agar Scientific | Cat# 1924B | Le resine di inclusione si basano su una formula di acrilato e metacrilato altamente reticolato. |
| Resina K4M (monomero B) | Agar Scientific | Lot # 631557 | Resina Monomero |
| Film di polivinile | Haimen Chenxing Experimental Equipment Company | nessuno | Il film di polietilene trasparente è il migliore, spessore di circa 0,2 mm |
| SPI Chem DDSA | SPI SpI | #02827-AF | Dodecenil Anidride Succinica |
| SPI-Chem DMP-30 Epossidico | SPI | 02823-DA | Acceleratore |
| SPI-Chem NMA | SPI SpI | #02828-AF | Indurente per resina epossidica |
| SPI-PON 812 Epossidica | SPI | SPI#0259-AB | Monomero |
| di resinaMaglia d'acciaio | Yuhuiyuan Gardening Store(online) | none | Rete di rame o acciaio inossidabile |
| Microscopia elettronica a trasmissione | Hitachi H-7650 | 11416692 | Tutte le griglie (su cui sono stati raccolti i campioni) sono state colorate con citrato di piombo e osservate al microscopio elettronico a trasmissione. |
| Microtomo ultrasottile Microtomo ultrasottile | Leica UC7 | 595915 | Tutte le operazioni di sezionamento vengono eseguite su un microtomo ultrasottile Leica UC7 utilizzando un coltello diamantato |
Riferimenti
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Ristampe e permessi
Errata corrige
Formal Correction: Erratum: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae
Posted by JoVE Editors on 10/18/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Optimizing Sample Preparation Process for Transmission Electron Microscopy of Neuromuscular Junctions in Drosophila Larvae. The Authors section was updated from:
Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei1
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming
to:
Gan Guangming1,2
Sheng Qingyuan3
Ou Yutong1
Chen Mei3
Zhang Chenchen1
1The School of Medicine, Southeast University,
2The Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University,
3The School of Life Science and Technology, Southeast University
Corresponding Authors: Gan Guangming, Sheng Qingyuan
