Sviluppo di ceppi di specie di Leishmania con espressione costitutiva di eGFP

Sommario

Qui, descriviamo la metodologia utilizzata per generare ceppi di L. panamensis e L . donovani che esprimono il gene per eGFP come transgene integrato stabile utilizzando il sistema pLEXSY. I parassiti trasfettati sono stati clonati limitando la diluizione e i cloni con la più alta intensità di fluorescenza in entrambe le specie sono stati selezionati per un ulteriore utilizzo nei saggi di screening farmacologico.

Abstract

I parassiti protozoari del genere Leishmania causano la leishmaniosi , una malattia con manifestazioni cliniche variabili che colpisce milioni di persone in tutto il mondo. L'infezione da L. donovani può provocare una malattia viscerale fatale. A Panama, Colombia e Costa Rica, L. panamensis è responsabile della maggior parte dei casi segnalati di leishmaniosi cutanea e mucocutanea. Studiare un gran numero di farmaci candidati con le metodologie disponibili fino ad oggi è abbastanza difficile, dato che sono molto laboriosi per valutare l'attività dei composti contro le forme intracellulari del parassita o per eseguire saggi in vivo . In questo lavoro, descriviamo la generazione di ceppi di L. panamensis e L. donovani con espressione costitutiva del gene che codifica per una proteina fluorescente verde potenziata (eGFP) integrata nel locus che codifica per l'rRNA 18S (ssu). Il gene che codifica per l'eGFP è stato ottenuto da un vettore commerciale e amplificato dalla reazione a catena della polimerasi (PCR) per arricchirlo e aggiungere siti di restrizione per gli enzimi BglII e KpnI. L'amplicone eGFP è stato isolato mediante purificazione su gel di agarosio, digerito con gli enzimi BglII e KpnI, e legato nel vettore di espressione di Leishmania pLEXSY-sat2.1 precedentemente digerito con lo stesso set di enzimi. Il vettore di espressione con il gene clonato è stato propagato in E. coli, purificato, e la presenza dell'inserto è stata verificata mediante colony PCR. Il plasmide purificato è stato linearizzato e utilizzato per trasfettare i parassiti di L. donovani e L . panamensis. L'integrazione del gene è stata verificata mediante PCR. L'espressione del gene eGFP è stata valutata mediante citometria a flusso. I parassiti fluorescenti sono stati clonati limitando la diluizione e i cloni con la più alta intensità di fluorescenza sono stati selezionati utilizzando la citometria a flusso.

Introduzione

I parassiti protozoari del genere Leishmania causano la leishmaniosi, una malattia con una vasta gamma di manifestazioni cliniche. Questa malattia è prevalente in 98 paesi e la sua incidenza annuale è stimata tra 0,9 e 1,6 milioni di casi¹. Le specie di Leishmania che sono patogene per l'uomo sono divise in due sottogeneri, vale a dire L. (Leishmania) e L. (Viannia). Infezione con alcune specie appartenenti alla L. (Leishmania) sottogenere, come L. donovani e L. infantum, può provocare leishmaniosi viscerale (VL), che è fatale se non trattata². Specie appartenenti alla L. (Viannia) sono associati alla maggior parte dei casi di leishmaniosi cutanea (CL) e leishmaniosi mucocutanea (MCL) in America centrale e meridionale, in particolare a Panama, Colombia e Costa Rica, con L. panamensis che è il principale agente eziologico di queste presentazioni cliniche ^3,4.

La chemioterapia anti-leishmania esistente che include farmaci come antimoniali pentavalenti, miltefosina e amfotericina B è altamente tossica e costosa. Inoltre, l'aumento della resistenza ai farmaci negli ultimi decenni è stato aggiunto ai fattori che interferiscono con il trattamento efficace dei pazienti in tutto il mondo⁵. Differenze sostanziali sono state dimostrate tra le specie del genere Leishmania in relazione alla suscettibilità ai farmaci, in particolare tra le specie del Nuovo e del Vecchio Mondo ^6,7. Per questi motivi, è necessario indirizzare gli sforzi verso l'identificazione e lo sviluppo di nuovi farmaci anti-leishmania, prestando particolare attenzione agli approcci specie-specifici. Studiare grandi librerie di farmaci candidati con metodologie tradizionali è abbastanza difficile, dato che queste metodologie sono molto laboriose per valutare l'attività di composti contro amastigoti intracellulari o per eseguire esperimenti in vivo ⁸; Pertanto, è stato necessario sviluppare nuove tecniche che riducano questi svantaggi, compresa l'implementazione di geni reporter e lo sviluppo di saggi di screening fenotipico ad alto contenuto⁹.

L'uso di geni reporter ha dimostrato il potenziale per aumentare l'efficienza del processo di screening dei farmaci in quanto facilita lo sviluppo di saggi ad alto rendimento e in vivo. I parassiti ricombinanti della Leishmania che esprimono diversi geni reporter sono stati generati da vari gruppi di ricerca. I geni reporter, come la β-galattosidasi, la β-lattamasi e la luciferasi, sono stati introdotti in diverse specie di Leishmania utilizzando vettori episomiali, mostrando un'utilità limitata per lo screening dei farmaci nelle forme extra- e intracellulari del parassita 10,11,12,13,14,15. Questi approcci hanno il limite di richiedere una forte pressione selettiva in coltura per evitare l'eliminazione del costrutto episomiale, nonché l'uso di reagenti aggiuntivi per rivelare l'attività del gene reporter. Al contrario, la proteina fluorescente verde (GFP) e la sua variante, la proteina fluorescente verde potenziata (eGFP), sono state utilizzate nella generazione di un gran numero di ceppi transgenici di Leishmania per saggi di screening farmacologico in vitro grazie alla loro flessibilità e sensibilità, nonché alla possibilità di automatizzare il processo di screening utilizzando citometria a flusso o fluorometria^{15, 16,17,18,19}. Nonostante i risultati promettenti, le colture di questi ceppi transgenici erano altamente eterogenee nei loro livelli di fluorescenza, poiché il numero di copie del gene GFP non era lo stesso in tutti i parassiti. Inoltre, il mantenimento della fluorescenza richiedeva una pressione selettiva costante sui parassiti in coltura, poiché il gene GFP è stato introdotto in un costrutto episomiale.

Per le ragioni esposte in precedenza, molti sforzi si sono concentrati sullo sviluppo di nuove metodologie per la produzione di ceppi ricombinanti stabili. Questi sforzi si sono basati principalmente sull'integrazione dei geni reporter nei loci ribosomiali, sfruttando i più alti tassi di trascrizione dei geni ribosomiali²⁰. I ceppi di L. infantum e L. amazonensis sono stati generati dopo aver integrato i geni che codificano per β-galattocidasi 21, IFP 1.4, iRFP 22 e tdTomato²³, e sono stati valutati per la loro utilità nei saggi di screening dei farmaci. Vari gruppi hanno sviluppato ceppi di L. donovani che esprimono la GFP costitutivamente integrando il suo gene codificante nel locus dell'RNA ribosomiale 18S (locus ssu) attraverso la ricombinazione omologa^24,25; hanno mostrato un'espressione stabile e omogenea di GFP nella popolazione trasfettata, inclusi amastigoti intracellulari 24,25, e sono stati implementati con successo nei saggi di screening dei farmaci^24,25,26. Bolhassani et ^al.27 hanno sviluppato ceppi di L. major e L. infantum che esprimono GFP come transgene integrato. Hanno usato il vettore di integrazione pLEXSY, originariamente progettato per l'espressione transgenica di proteine in un sistema che utilizza L. tarentolae come ospite²⁸. Il vettore pLEXSY-GFP ha dimostrato di essere molto efficiente per la generazione di diversi ceppi di Leishmania che esprimono costitutivamente GFP 24,25,27,29,30. In questi parassiti, la fluorescenza è omogenea e mantenuta nelle forme intracellulari, potendo essere rilevata nelle lesioni del cuscinetto dei topi infetti²⁷.

In questo lavoro, descriviamo la metodologia utilizzata per generare ceppi di L. panamensis e L . donovani che esprimono il gene che codifica per eGFP come transgene integrato utilizzando il sistema pLEXSY. I ceppi generati attraverso questo processo sono utilizzati nel nostro laboratorio per eseguire saggi di screening farmacologico che valutano la potenziale attività anti-leishmania di molecole di origine naturale e sintetica.

Protocollo

Per mantenere i campioni sterili, tutte le fasi che coinvolgono la coltura parassitaria devono essere eseguite all'interno di una cappa di livello di biosicurezza 2 (BSL-2) o secondo le normative locali in materia di salute e sicurezza. Un riepilogo grafico di questo protocollo è disponibile nella Figura 1.

Figura 1: Schema riassuntivo del protocollo per la generazione di parassiti L. panamensis e L. donovani che esprimono eGFP utilizzando la famiglia di vettori pLEXSY-2.1. Tutte e sei le sezioni principali descritte nell'articolo sono rappresentate qui. 1) Amplificazione e inserzione del gene eGFP nel vettore pLEXSY-2.1: il gene bersaglio viene amplificato, aggiungendo i siti di riconoscimento per gli enzimi KpnI e BglII, e sia l'amplicone eGFP che il plasmide pLEXSY vengono digeriti sequenzialmente con entrambi gli enzimi per la successiva legatura con T4 ligasi. 2) Linearizzazione del plasmide di espressione pLEXSY: il costrutto pLEXSY + eGFP viene digerito con SwaI per la linearizzazione e purificazione della cassetta di espressione 7-8 kbp. 3) Trasfezione e 4) selezione policlonale: i promastigoti di Leishmania vengono trasfettati con la cassetta di espressione mediante elettroporazione e rimessi in coltura per la selezione antibiotica di parassiti ricombinanti. La fluorescenza parassitaria è confermata attraverso la citometria a flusso. 5) Conferma dell'integrazione genomica e 6) clonaggio mediante diluizione limitante: l'integrazione della cassetta di espressione pLEXSY-eGFP è confermata dalla PCR diagnostica, utilizzando un primer in avanti ibridante alla cassetta di espressione e un primer inverso ibridante ad una sequenza cromosomica assente nella cassetta di espressione. Le colture trasfettate potrebbero essere arricchite per i parassiti fluorescenti mediante clonazione limitando la diluizione e i cloni con le più alte intensità fluorescenti medie possono essere selezionati per ulteriori applicazioni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

1. Amplificazione e inserzione del gene eGFP nel vettore pLEXSY-2.1

1. Amplificazione del gene eGFP
   NOTA: Poiché questo protocollo utilizza la famiglia di vettori pLEXSY-2.1 (vedi Tabella dei Materiali) per l'espressione costitutiva di proteine bersaglio in seguito all'integrazione della cassetta di espressione nel locus cromosomico 18S rRNA (ssu) delle specie di Leishmania , il primo passo è introdurre nel gene eGFP le sequenze contenenti i siti di restrizione che ne consentono l'inserimento nei vettori pLEXSY-2.1. In questo caso, poiché l'eGFP deve essere espresso solo citosolicamente, i siti di restrizione per gli enzimi BglII e KpnI sono stati aggiunti rispettivamente nelle estremità 5' e 3' del gene eGFP. La clonazione con KpnI porta alla fusione della proteina bersaglio in un tag poliistidina C-terminale di sei residui, seguito da un codone di stop codificato nel plasmide pLEXSY-2.1 per un'ulteriore purificazione della proteina di interesse. Per questo motivo, la sequenza di primer inversa non contiene un codone di stop.
   1. A seconda della sorgente plasmidica per eGFP, analizzare la sequenza target utilizzando uno strumento di analisi delle restrizioni come NEBcutter (http://tools.neb.com/NEBcutter/index.php3)³¹ per assicurarsi che non contenga siti interni per gli enzimi di restrizione utilizzati per il clonaggio (BglII e KpnI) o per SwaI, che è l'enzima utilizzato per la linearizzazione del vettore prima della trasfezione.
   2. Progettare primer forward e reverse per l'amplificazione eGFP contenenti le sequenze di restrizione BglII e KpnI. Ad esempio, la fonte eGFP per questo protocollo era il plasmide pEGFP-N1-1X³², e le sequenze di primer erano quelle riportate da Bolhassani et ^al.27:
      Forward primer (EGFP1): 5'-ATGATATCAAGATCTATGGTGAGCAAGGGC-3' (BglII restriction site in grassetto).
      Reverse primer (EGFP2): 5'-GCTCTAGATTAGGTACCCTTGTACAGCTCGTC-3' (KpnI restriction site in grassetto).
   3. Amplificare il gene bersaglio utilizzando una polimerasi ad alta fedeltà per garantire la conservazione della sequenza codificante. Ad esempio, per i primer EGFP1 e EGFP2, eseguire il protocollo di ciclo PCR come riportato da Bolhassani et ^al.27. Eseguire una denaturazione iniziale di 2 min a 94 °C, seguita da 30 cicli di 30 s a 94 °C, 30 s a 57 °C e 1 min a 72 °C. Eseguire una fase di estensione finale di 10 minuti a 72 °C. Aggiungere i primer ad una concentrazione finale di 0,2 μM.
   4. Purificare il frammento utilizzando un kit di purificazione del prodotto PCR convenzionale o una precipitazione standard di acetato di sodio ed etanolo, come descritto altrove³³.
2. Inserimento dell'eGFP nel vettore di espressione pLEXSY-2.1
   1. Tagliare le estremità del prodotto eGFP-PCR utilizzando BglII e KpnI, seguendo le istruzioni del produttore.
      1. In primo luogo, impostare la reazione per l'enzima che richiede la più bassa concentrazione di sale (in questo caso, KpnI), secondo le istruzioni del produttore, e incubare a 37 ° C per 1 ora.
      2. Quindi, aggiungere 100 mM NaCl e 10 unità di BglII e incubare per 15 minuti. Purificare la reazione, come descritto al punto 1.1.4.
   2. Digerire il vettore di espressione di pLEXSY con BglII e KpnI, seguendo il protocollo di digestione sequenziale descritto al punto 1.2.1.
   3. Ligare il vettore pLEXSY e il gene eGFP con T4 ligasi utilizzando un rapporto molare di 1:3 (vector:insert). Aggiungere brevemente 100 ng di pLEXSY digerito e 28 ng di prodotto eGFP digerito a una reazione da 20 μL contenente tampone ligasi ad una concentrazione finale di 1x e 3 unità di T4 DNA ligasi. Incubare per una notte a 4 °C.
   4. Trasformare cellule di E. coli competenti, come XL-10, DH5α o DH10B, con il prodotto di legatura ottenuto nella fase 1.2.3 utilizzando protocolli di trasformazione standard³³. Placcare le cellule trasformate in agar Luira-Bertani (LB)-ampicillina e incubare per 24 ore a 30 °C per selezionare cloni ricombinanti (i plasmidi pLEXSY sono più stabili in E. coli a 30 °C che a 37 °C).
   5. Screening per la presenza dell'inserto nei plasmidi mediante PCR di colonia.
      1. Prelevare singole colonie, risospendere in 20 μL di acqua priva di nucleasi, riscaldare a 95 °C per 15 minuti e prelevare 1 μL di lisato come modello di DNA per la PCR di colonia. Utilizzare il primer forward per l'amplificazione eGFP, descritto al punto 1.1.2 (in questo esempio, EGFP1), e il primer A264 (5'-CATCTATAGAGAAGTACACGTAAAAG-3') come primer inverso²⁹.
      2. Il primer A264 è progettato per ricottura 80 bp dopo il codone di stop dell'inserto nei vettori di espressione pLEXSY-2.1. Ad esempio, per la coppia di primer EGFP1 + A264, utilizzare un protocollo di ciclo PCR consistente in una denaturazione iniziale di 2 min a 94 °C, seguita da 30 cicli di 30 s a 94 °C, 30 s a 50 °C e 1 min a 72 °C. Eseguire una fase di estensione finale di 10 minuti a 72 °C. I primer vengono aggiunti ad una concentrazione finale di 0,2 μM.
         NOTA: il prodotto previsto utilizzando questo set di primer è lungo 859 bp. I siti di ricottura per i primer EGFP1 e A264 sono illustrati nella Figura 2.
   6. Preparare il DNA plasmidico purificato da un clone positivo per la successiva trasfezione utilizzando un kit di isolamento plasmidico commerciale o una precipitazione alcalina standard³³. Utilizzare 50 ml di coltura notturna a 30 °C per isolare almeno 10 μg di plasmide/clone positivo.

2. Linearizzazione del plasmide di espressione pLEXSY

1. Utilizzare almeno 10 μg del plasmide purificato pLEXSY-eGFP per la digestione con SwaI (sito di riconoscimento: 5'-ATTTAAAT-3'). Digerire per 3-4 ore a 25 °C e inattivare a 65 °C per 20 min.
2. Eseguire il prodotto digestivo in elettroforesi su gel di agarosio per separare i frammenti risultanti. Questa digestione genererà due frammenti, un frammento di 2,9 kbp che rappresenta gli elementi necessari per la replicazione e la selezione in E. coli e un frammento di 7-8 kbp che rappresenta la cassetta di espressione linearizzata.
3. Purificare la cassetta di espressione utilizzando un kit commerciale per l'estrazione del gel di agarosio.

3. Trasfezione di L. panamensis e L. donovani mediante elettroporazione

NOTA: La cultura della Leishmania viene eseguita come descritto altrove³⁴. In questo esempio, L. panamensis e L. donovani promastigotes sono stati coltivati nel mezzo di insetti di Schneider, integrati con il 20% (v/v) di siero fetale bovino (FBS) e 50 μg/mL di gentamicina, e incubati a 26 °C.

1. Coltiva le colture di parassiti fino a quando non ci sono abbastanza promastigoti in fase logaritmica o in fase stazionaria precoce per utilizzare circa 4 x 10⁷ parassiti per trasfezione. La densità cellulare massima per pallone di coltura prima di raggiungere la fase stazionaria può variare a seconda delle specie di Leishmania e di quanto bene i ceppi sono adattati alle condizioni di laboratorio. Se necessario, raggruppa il contenuto di più borracce di coltura.
2. Centrifugare la coltura parassitaria a 2.000 x g per 3 minuti a temperatura ambiente (RT).
3. Risospendere il pellet in tampone di elettroporazione a 4 °C (21 mM HEPES, 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 0,7 mM Na₂HPO₄ e 6 mM glucosio; pH 7,5)²⁷ per ottenere una concentrazione di 1 x 10⁸ parassiti/mL. Mettere in ghiaccio per 10 min.
   NOTA: Il tampone per elettroporazione deve essere sterilizzato filtrando prima dell'uso.
4. In parallelo, tubi pre-chill con 2-10 μg di pLEXSY-eGFP linearizzato costrutto in un volume massimo di 50 μL di acqua o tampone tris 10 mM (pH 8,0) e cuvette di elettroporazione di d = 2 mm.
5. Aggiungere 350 μL di parassiti pre-raffreddati al tubo con il plasmide linearizzato e trasferire l'intero 400 μL alla cuvetta di elettroporazione su ghiaccio. In parallelo, elettroporare le cellule del parassita senza DNA plasmidico come controllo negativo.
6. Elettroporate utilizzando uno di questi due protocolli:
   Decadimento esponenziale: 450 V, 450 μF, un impulso.
   Costante di tempo: 450 V, T = 3,5 ms, un impulso.
   NOTA: Questi protocolli sono stati eseguiti utilizzando un pulser genetico commerciale (Table of Materials) con moduli PC e CE.
7. Rimettere la cuvetta sul ghiaccio per 10 minuti e trasferire i parassiti elettroporati a 5 ml del terreno di coltura appropriato. Questo esempio ha utilizzato il mezzo di insetti di Schneider integrato con FBS al 20% (v / v). Incubare a 26 °C per 20 h.

4. Selezione policlonale in coltura

1. Circa 20 ore dopo l'elettroporazione, osservare le colture al microscopio. Almeno la metà della popolazione di parassiti dovrebbe mostrare morfologia e motilità visivamente buone (promastigotiti simili a gocce con flagello oscillante che si muove attraverso i mezzi e/o forma aggregati parassitari attivi). Aggiungere l'antibiotico selettivo appropriato a seconda del plasmide pLEXSY utilizzato. In questo esempio viene utilizzato pLEXSY-sat2.1, che contiene streptotricina acetiltransferasi come marcatore di selezione. Pertanto, utilizzare la nourseotricina come antibiotico selettivo ad una concentrazione di 0,1 mg / ml.
2. Seguire le colture al microscopio fino a quando non si vede una chiara differenza tra i parassiti elettroporati con e senza DNA plasmide.
3. Verificare la fluorescenza del parassita attraverso la citometria a flusso.
   1. Centrifugare 1 mL di coltura in fase stazionaria a 2.000 x g per 3 minuti a RT. Lavare due volte in PBS e risospendere il pellet finale in 1 mL di PBS.
      NOTA: La fluorescenza dell'eGFP può essere rilevata nel canale FL1 della maggior parte dei citometri commerciali. Le impostazioni di guadagno per la dispersione diretta e laterale e il canale FL1 possono variare tra i citometri. Per questo esempio, è stato utilizzato un citometro spaziale CyFlow (Sysmex).
   2. Eseguire i campioni, raccogliendo 20.000 eventi a una velocità di 0,5 μL/s, e impostare i valori di guadagno per i canali di dispersione diretta (FSC), dispersione laterale (SSC) e fluorescenza 1 (FL-1) rispettivamente come 225,0, 200,0 e 520,0. Eseguire un campione di controllo con parassiti non fluorescenti per determinare la popolazione di parassiti in un dot-plot FSC rispetto a SSC.
   3. Creare un gate (G1) contenente la popolazione di parassiti e filtrare il canale FL-1 attraverso quel gate per determinare l'autofluorescenza dei promastigoti e impostare un range gate (G2) per il canale FL-1.
   4. Eseguire i parassiti trasfettati per verificare se c'è fluorescenza. Registrare la percentuale di parassiti in G1 che sono fluorescenti e la media dell'intensità di fluorescenza in G2.

5. Conferma dell'integrazione genomica

NOTA: L'integrazione della cassetta di espressione pLEXSY-eGFP può essere confermata mediante PCR diagnostico, utilizzando un primer diretto che ibrida la cassetta di espressione (varia a seconda del vettore pLEXSY-2.1 utilizzato) e il primer inverso F3002 (5'-CTGCAGGTTCACCTACAGCTAC-3') che si ibrida in una sequenza cromosomica ssu-fiancheggiante assente nella cassetta di espressione. In questo esempio, il primer anteriore F2999 (5'-CCTAGTATGAAGATTTCGGTGATC-3') viene utilizzato come ibridazione nella cassetta di espressione pLEXSY-sat2.1. Una rappresentazione schematica della cassetta di espressione integrata e dei siti di ricottura del primer per la PCR diagnostica è illustrata nella Figura 2.

1. Purificare il DNA genomico da 2-5 ml di una coltura parassitaria in fase stazionaria mediante estrazione convenzionale di fenolo/cloroformio³⁵ o con un kit commerciale.
2. Eseguire la PCR diagnostica per pLEXSY-sat2.1 utilizzando un protocollo ciclico consistente in una denaturazione iniziale di 2 min a 94 °C, seguita da 30 cicli di 30 s a 94 °C, 30 s a 53 °C e 1 min a 72 °C. Eseguire una fase di estensione finale di 10 minuti a 72 °C. I primer vengono aggiunti ad una concentrazione finale di 0,2 μM.

Figura 2: Rappresentazione schematica della cassetta di espressione integrata. Le caselle etichettate come Chr-S (grigio) rappresentano le sequenze cromosomiche adiacenti del locus 18S rRNA (ssu) in cui è integrata la cassetta di espressione. La cassetta di espressione integrata consiste di sequenze di 5' e 3' (blu) per la ricombinazione omologa nel locus ssu , un promotore ribosomiale aggiuntivo della Leishmania (rosso) per una maggiore produzione di proteine, il gene eGFP (verde), un gene marcatore di selezione (giallo) e tre regioni non tradotte (grigio chiaro), vale a dire utr1, 2 e 3, che forniscono i segnali di splicing per l'elaborazione post-trascrizionale dell'mRNA per l'espressione ottimizzata di eGFP e il marcatore di selezione nei parassiti della Leishmania . I siti di ricottura per primer avanti e indietro utilizzati per la verifica della presenza dell'inserto mediante colony PCR (fase 1.2.5) sono contrassegnati dalle frecce nere etichettate rispettivamente come cpcr-fwd (primer EGFP1) e cpcr-rev (primer A264), che delimitano un prodotto da 859 bp. I siti di ricottura per primer avanti e indietro utilizzati per la verifica dell'integrazione genomica mediante PCR diagnostica (fase 5) sono contrassegnati dalle frecce nere etichettate rispettivamente come sat-fwd (primer F2999) e ssu-rev (primer F3002), che delimitano un prodotto da 2.271 bp. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

6. Clonazione mediante limitazione della diluizione (facoltativo)

1. Dopo la conferma della fluorescenza attraverso citometria a flusso, preparare una diluizione dei parassiti ricombinanti ad una concentrazione di cinque promastigoti/mL³⁶.
2. Aggiungere 100 μL di questa diluizione in ciascun pozzetto di una piastra da 96 pozzetti. In questo modo, le piastre vengono seminate ad una densità media di 0,5 promastigotes/pozzetto, il che assicura che alcuni pozzetti ricevano un singolo parassita riducendo al minimo la probabilità di avere più di un parassita per pozzetto³⁶.
3. Lasciare il piatto indisturbato per almeno 12 ore. Seguire la piastra al microscopio con un ingrandimento minimo di 100x fino a quando non vengono rilevati pozzetti con crescita parassitaria.
4. Quando un pozzetto è pieno di parassiti, utilizzare il contenuto per inoculare una coltura da 5 ml. Questo richiede 1-2 settimane.
5. Quando le colture con sementi clonate raggiungono la fase stazionaria, verificare la fluorescenza mediante citometria a flusso, come descritto nella fase 4.3. Selezionare i cloni da utilizzare per ulteriori test in vitro e in vivo in base alla percentuale di parassiti fluorescenti e all'intensità media di fluorescenza misurata nel canale FL-1. Puntare a cloni con il 98%-99% di parassiti fluorescenti e selezionare quelli con la più alta intensità media di fluorescenza.

Risultati

Dopo aver costruito il costrutto pLEXSY-eGFP e trasformato cellule di E. coli competenti, le colonie contenenti il costrutto con l'inserto eGFP genereranno un prodotto di circa 859 bp dopo aver eseguito la PCR di colonia descritta nella sezione 1.2 (Figura 3A). La digestione totale del plasmide purificato da colonie positive utilizzando SwaI dovrebbe dare due frammenti caratteristici in elettroforesi su gel, un frammento di 2,9 kbp che è la porzione del vettore PLEXSY conte...

Discussione

I vantaggi e gli svantaggi di vari geni reporter sono stati studiati in diversi protozoi parassiti. Tra questi, GFP ed eGFP sono intrinsecamente fluorescenti e consentono una facile quantificazione e imaging. L'attività fluorescente di queste proteine può essere rilevata con una manipolazione minima utilizzando microscopia a fluorescenza, fluorimetria o citometria a flusso. Pochi studi sono stati condotti per generare L che esprime GFP. (Viannia), nonostante la dimostrata robustezza della GFP e dei loro...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
96 pozzetti	Micropiastre Corning	CLS3340	Fondo piatto trasparente, polistirene nero, sterile, coperchio
Agarosio	Sigma-Aldrich	A4718
Sale sodico di ampicillina	Sigma-Aldrich	A8351	BioXtra, adatto per colture cellulari
BglII enzima di restrizione	New England BioLabs	R0144S	2.000 unità. 10.000 unità/mL
Fiasche per colture cellulari	Corning	CLS430168	Superficie 25 cm2, collo inclinato, tappo (tappo di tenuta)
Sistema di imaging ChemiDoc	Bio-Rad	17001401
CyFlow Space	Sysmex	Non disponibile
D-(+)-Glucosio	Sigma-Aldrich	G7021	polvere, BioReagente, adatto per colture cellulari, adatto per colture cellulari di insetti, adatto per colture cellulari vegetali, ≥ 99,5%
Siero fetale bovino	Sigma-Aldrich	F7524
Gel Buffer di caricamento	Sigma-Aldrich	G2526	La velocità di migrazione varia con la composizione del gel. Diluire da 1:3 a 1:6 con il campione prima di caricarlo.
Sistema di elettroporazione Gene Pulser Xcell	Bio-Rad	1652660	Il sistema è composto da un'unità principale, due moduli accessori, l'estensore di capacità (modulo CE) e il controller di impulsi (modulo PC) e una camera per cuvette ShockPod.
Cuvette per elettroporazione Gene Pulser/MicroPulser	Bio-Rad	1652086	confezione da 50, 0,2 cm... cuvetta sterile per elettroporazione gap, da utilizzare con i sistemi Gene Pulser e MicroPulser, per cellule di mammifero e altre cellule eucariotiche
Soluzione di gentamicina	Sigma-Aldrich	G1397	50 mg/mL in acqua deionizzata, liquido, 0,1 μ m filtrato, BioReagent, adatto per colture cellulari
GoTaq Long PCR Master Mix	Promega	M4021
Soluzione HEPES	Sigma-Aldrich	H0887	1 M, pH 7,0-7,6, filtrato sterile, BioReagent, adatto per colture cellulari
Microscopio invertito	Olympus	IXplore Standard
KpnI-HF enzima di restrizione	New England BioLabs	R3142S	4.000 unità. 20.000 unità/mL
LB Brodo con agar	Sigma-Aldrich	L3147	Terreno di crescita microbica in polvere ricco di sostanze nutritive altamente referenziato con Agar, adatto per E.coli  cultura.
LB Brodo	Sigma-Aldrich	L2542	Terreno di crescita microbica liquido
Mini-Sub Cell GT Sistema di elettroforesi orizzontale	Bio-Rad	1640300	Mini sistema di elettroforesi orizzontale, include pettini a 8 e 15 pozzetti, vassoio trasparente ai raggi UV da 7 cm x 10 cm
pEGFP-N1-1x	Addgene	172281	mRNA esprimo eGFP fuso con 1 ripetizione tandem di una sequenza di 50 basi
kit di espressione pLEXSYcon2.1	Jena Bioscience	EGE-1310sat	Contiene il vettore di espressione costitutivo integrativo pLEXSY-sat2.1. Selezione antibiotica di transfettanti con nourseotricina (NTC, clonNAT). Contiene tutti i primer per la PCR diagnostica e il sequenziamento.
Cloruro di potassio	Millipore	529552	grado di biologia molecolare - CAS 7447-40-7 - Calbiochem
PureYield Plasmidi Miniprep System	Promega	A1222	fino a 15 μ g di plasmide pronto per la trasfezione da colture da 3 mL.
Schneider′ s Insetto Medium	Sigma-Aldrich	S0146	Medium utilizzato nel nostro laboratorio per la coltura della Leishmania.
SOC Medium	Sigma-Aldrich	S1797
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich	S3014	per biologia molecolare, DNasi, RNasi e proteasi, nessuno rilevato, ≥ 99% (titolazione)
Sodio fosfato bibasico	Sigma-Aldrich	RDD038	BioReagent, adatto per colture cellulari, adatto per colture cellulari di insetti, ≥ 99,0%, a flusso libero, enzima di restrizione Redi-Dri
SwaI	New England BioLabs	R0604S	2.000 unità. 10.000 unità/mL
Filtri per siringa	Membrana in cellulosa rigenerata Corning	CLS431212	, diam. 4  mm, dimensione dei pori 0,2  μ m
T100 Termociclatore	Bio-Rad	1861096	Sistema termociclatore, include termociclatore a 96 pozzetti, cavo di alimentazione, anello di supporto del tubo
T4 DNA Ligasi	Promega	M1801	Unisce due filamenti di DNA con estremità coesive o smussate
Tampone Tris-Borato-EDTA	Sigma-Aldrich	T4415	BioReagent, adatto per elettroforesi, 10 volte concentrato
Wizard Genomic DNA Kit di purificazione	Promega	A1120
Wizard SV Gel e PCR Clean-Up System	Promega	A9285
XL10-Gold Cellule ultracompetenti	Agilent	200317	XL10-Gold Kanr Ultracompetent Cells, 10 x 0,1 mL. Presenta il gene di resistenza alla kanamicina sull'episoma F', per una clonazione estremamente impegnativa in vettori resistenti al cloramfenicolo. Efficienza: > 5 x 10 9 trasformanti/µ g pUC18 DNA.