Standardizzazione del trasferimento tra laboratori tra citometri a flusso per il rilevamento di linfociti in bambini vaccinati contro l'encefalite giapponese

Sommario

In questo studio, è stato sviluppato un metodo per facilitare il trasferimento di impostazioni sperimentali e modelli di analisi tra due citometri a flusso in due laboratori per la rilevazione di linfociti in bambini vaccinati contro l'encefalite giapponese. Il metodo di standardizzazione per gli esperimenti di citometro a flusso consentirà di condurre efficacemente i progetti di ricerca in più centri.

Abstract

Un numero crescente di laboratori ha bisogno di raccogliere dati da più citometri a flusso, in particolare per i progetti di ricerca eseguiti in più centri. Le sfide legate all'utilizzo di due citometri a flusso in laboratori diversi includono la mancanza di materiali standardizzati, problemi di compatibilità software, incongruenze nella configurazione degli strumenti e l'uso di configurazioni diverse per diversi citometri a flusso. Per stabilire un esperimento standardizzato di citometria a flusso per ottenere la coerenza e la comparabilità dei risultati sperimentali tra più centri, è stato stabilito un metodo di standardizzazione rapido e fattibile per trasferire i parametri tra diversi citometri a flusso.

I metodi sviluppati in questo studio hanno permesso il trasferimento di impostazioni sperimentali e modelli di analisi tra due citometri a flusso in diversi laboratori per la rilevazione di linfociti in bambini vaccinati con encefalite giapponese (JE). Un'intensità di fluorescenza costante è stata ottenuta tra i due citometri utilizzando sfere standard di fluorescenza per stabilire le impostazioni del citometro. Risultati comparabili sono stati ottenuti in due laboratori con diversi tipi di strumenti. Utilizzando questo metodo, possiamo standardizzare l'analisi per valutare la funzione immunitaria dei bambini vaccinati con JE in diversi laboratori con strumenti diversi, diminuire le differenze nei dati e nei risultati tra i citometri a flusso in più centri e fornire un approccio fattibile per l'accreditamento reciproco dei risultati di laboratorio. Il metodo di standardizzazione degli esperimenti di citometro a flusso garantirà l'efficace esecuzione dei progetti di ricerca in più centri.

Introduzione

La standardizzazione della citometria a flusso è utile per la comparabilità dei risultati ottenuti da diversi citometri tra diversi laboratori e centri di studio e favorisce il riconoscimento reciproco dei risultati per migliorare l'efficienza del lavoro. Un numero crescente di scenari richiede una standardizzazione. Durante il processo di sviluppo del farmaco, la standardizzazione della citometria a flusso è importante, poiché un test sviluppato e convalidato supporterà l'intero processo di sviluppo del farmaco dall'analisi preclinica a quella clinica. I metodi citometrici a flusso sono spesso trasferiti tra l'industria farmaceutica e i laboratori che collaborano

Protocollo

Lo studio è stato approvato dal Comitato etico dell'ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University (numero di approvazione: 2020-k-85). Il consenso informato dei soggetti umani è stato rinunciato poiché in questo studio sono stati utilizzati solo campioni residui dopo test clinici. Due laboratori sono coinvolti in questo studio. Il laboratorio di trasferimento è dove il metodo standardizzato è stato sviluppato utilizzando un citometro a flusso. Il citometro in questo laboratorio è di seguito denominato citometro A. Il laboratorio del metodo di prova è il laboratorio che riceve i metodi che utilizzano un altro citometro a f....

Risultati

Nella Figura 1 viene illustrato un foglio di lavoro globale del modello di valore di destinazione per le perline luminose CST. Utilizzando un plottaggio FSC/SSC, viene disegnato un cancello poligonale per selezionare le perline luminose CST. Sono stati ottenuti grafici istografici di 10 canali di fluorescenza per le sfere luminose CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 e BV605. Il valore di destinazione per ciascun parametro viene visualizzato mostrando la mediana all'i.......

Discussione

L'immunofenotipizzazione dei sottogruppi di linfociti del sangue periferico può aiutare a comprendere i cambiamenti nell'immunità adattativa cellulo-mediata dopo la vaccinazione nei bambini. Nelle applicazioni cliniche si verificano situazioni impreviste, come la mancata rilevazione tempestiva dei campioni o la sostituzione di un citometro a flusso; Pertanto, sono necessari metodi standardizzati rapidi che facilitino i trasferimenti tra citometri a flusso in diversi laboratori 9,10,11.<.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
BD CompBeads Set di particelle di compensazione del controllo anti-topo, κ/controllo negativo	BD	552843	compensazione
BD FACSCanto	BD	FACSCantometria	a flusso A nel laboratorio di trasferimento
BD FACSDiva CS& T Research Beads	BD	655051	definire la linea di base del citometro a flusso e monitorare le prestazioni del citometro
BD Horizon BV421 Mouse Anti-Human CD127	BD	562436	Anticorpo fluorescente...
BD Horizon BV605 Topo Anti-Umano CD27	BD	562656	Anticorpo fluorescente
BD Horizon V500 Topo Anti-Umano CD45	BD	560777	Anticorpo fluorescente
BD LSRFortessa	BD	LSRFortessa	flow Cytometry B nel laboratorio del metodo di prova
BD OptiBuild BB700 Mouse Anti-Human CD19	BD	745907	Anticorpo fluorescente
BD OptiBuild R718 Topo Anti-Umano CD8	BD	751953	Anticorpo fluorescente
BD Pharmingen APC Topo Anti-Umano CD45RA	BD	550855	Anticorpo fluorescente
BD Pharmingen APC-H7 Topo Anti-Umano CD3	BD	560176	Anticorpo fluorescente
BD Pharmingen FITC Topo Anti-Umano CD4	BD	566320	Anticorpo fluorescente
BD Pharmingen PE Topo Anti-Umano CD25	BD	555432	Anticorpo fluorescente
BD Pharmingen PE-Cy7 Topo Anti-Human IgD	BD	561314	Anticorpo fluorescente
Brilliant Staining Buffer Plus	BD	566385	Centrifuga tampone di colorazione
	Eppendorf	5810	Cell centrifugation
Tube	BD Falcon	BD-35209715	15 mL provetta per centrifuga
CS& Perline T IVD	BD	662414	perline standard per configurare le impostazioni del citometro in diversi citometri a flusso
Soluzione di lisi 10x Concentrato	BD	349202	la lisi dei globuli rossi
Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)	Gibco	10010-023	PBS
Provetta a fondo tondo	BD	Falcon 352235	provetta da 5 mL