Standardizzazione del trasferimento tra laboratori tra citometri a flusso per il rilevamento di linfociti in bambini vaccinati contro l'encefalite giapponese

La standardizzazione della citometria a flusso è utile per la comparabilità dei risultati ottenuti da diversi citometri tra diversi laboratori e centri di studio e favorisce il riconoscimento reciproco dei risultati per migliorare l'efficienza del lavoro. Un numero crescente di scenari richiede una standardizzazione. Durante il processo di sviluppo del farmaco, la standardizzazione della citometria a flusso è importante, poiché un test sviluppato e convalidato supporterà l'intero processo di sviluppo del farmaco dall'analisi preclinica a quella clinica. I metodi citometrici a flusso sono spesso trasferiti tra l'industria farmaceutica e i laboratori che collaborano¹. Inoltre, è essenziale ottenere dati comparabili da studi clinici multicentrici. Ad esempio, è stato sviluppato un flusso di lavoro di standardizzazione nel progetto di ricerca clinica multicentrica sulle malattie autoimmuni sistemiche per ottenere dati comparabili dalla citometria a flusso multicentrica².

La standardizzazione dei metodi di citometria a flusso è impegnativa. Le sfide incontrate nei laboratori sono attribuite alla mancanza di materiali standardizzati, problemi di compatibilità software, incongruenze nella configurazione degli strumenti e l'uso di diverse configurazioni tra diversi citometri a flusso e strategie di gating divergenti tra i centri ^3,4. Pertanto, è importante condurre un'analisi del divario tra i laboratori. L'accesso ai campioni, i sistemi di qualità, le qualifiche del personale e la configurazione degli strumenti devono essere rivisti per garantire che i requisiti siano soddisfatti.

Attualmente, i bambini vaccinati con il vaccino contro l'encefalite giapponese (JE) hanno un'incidenza significativamente ridotta di JE⁵. Il monitoraggio delle cellule immunitarie del sangue periferico può aiutare a comprendere i cambiamenti nell'immunità adattativa cellulo-mediata dopo la vaccinazione e la correlazione tra i cambiamenti nei sottogruppi di linfociti del sangue periferico e gli effetti della vaccinazione. A causa della limitata stabilità dei campioni di sangue intero, le valutazioni dell'efficacia del vaccino vengono spesso eseguite in più centri. Per questa analisi, abbiamo definito le cellule T CD8+ o CD4+ naïve come CD27+ CD45RA+, le cellule T della memoria centrale (T_CM) come CD27+ CD45RA^, le cellule T della memoria effettrice (T_EM) come CD27-CD45RA^- e le cellule T della memoria effettrice terminalmente differenziata (T_EMRA) come CD27-CD45RA⁺. Le cellule B CD19⁺ possono essere separate in popolazioni che esprimono CD27 rispetto a IgD ^6,7, le cellule B naïve esprimono le cellule B di memoria CD27n (mBC) possono essere identificate in base all'espressione di IgD⁶ e le cellule T regolatorie (Treg) possono essere identificate come CD4⁺CD25⁺⁺CD127^{basso 8}. Per stabilire un esperimento standardizzato di citometria a flusso per ottenere la coerenza e la comparabilità dei risultati sperimentali in più centri, è stato stabilito un metodo di standardizzazione rapido e fattibile per facilitare il trasferimento di protocolli attraverso diversi citometri a flusso per la rilevazione di linfociti nel sangue intero di bambini vaccinati con JE. Sei bambini sani (2 anni) sono stati reclutati dall'ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University. Dopo aver ricevuto una vaccinazione primaria e boost con un vaccino JE SA14-14-2 vivo attenuato meno di 6 mesi prima, sono stati raccolti campioni di sangue periferico dai volontari. Dati altamente comparabili sono stati ottenuti da diversi strumenti seguendo procedure standardizzate, il che è utile per le valutazioni multicentriche.

Lo studio è stato approvato dal Comitato etico dell'ospedale pediatrico di Pechino, Capital Medical University (numero di approvazione: 2020-k-85). Il consenso informato dei soggetti umani è stato rinunciato poiché in questo studio sono stati utilizzati solo campioni residui dopo test clinici. Due laboratori sono coinvolti in questo studio. Il laboratorio di trasferimento è dove il metodo standardizzato è stato sviluppato utilizzando un citometro a flusso. Il citometro in questo laboratorio è di seguito denominato citometro A. Il laboratorio del metodo di prova è il laboratorio che riceve i metodi che utilizzano un altro citometro a flusso e il citometro in questo laboratorio è di seguito denominato citometro B.

1. Raccolta di campioni di sangue periferico e preparazione delle cellule

1. Raccogliere campioni di sangue periferico (2 ml) da bambini vaccinati con JE e bambini non vaccinati in provette EDTA-K 2-anticoagulate mediante venipuntura standard.
2. Mescolare l'intero campione di sangue capovolgendo i tubi 10x. Aggiungere 100 μL di sangue intero in un tubo di 12 mm x 75 mm. Rendi ogni campione in duplicato.
3. Aggiungere 10 μL di tampone brillante (tampone BV) a un tubo da 12 x 75 mm. Aggiungere 5 μL di ciascun anticorpo (CD45, CD3, CD4, CD8, CD127, CD27, CD19, IgD; fattore di diluizione: 1:20) e 20 μL di anticorpo (CD25, CD45RA; fattore di diluizione: 1:5) al tampone BV. Vortice delicatamente.
   NOTA: I volumi e le informazioni dei reagenti anticorpali sono riportati nella Tabella 1.
4. Aggiungere il cocktail di anticorpi nel tubo con l'intero campione di sangue. Vortice delicatamente e incubare a temperatura ambiente per 15 minuti al buio.
5. Diluire la soluzione di lisatura 10x 1:10 con acqua distillata per preparare la soluzione 1x lisante. Lisare i campioni di sangue aggiungendo 2 ml di 1x soluzione di lisatura. Vortice delicatamente e incubare per 10 minuti al buio a temperatura ambiente.
6. Centrifugare a 300 × g per 5 minuti e decantare il surnatante.
7. Risospendere il pellet in 2 ml di 1x PBS, centrifugare a 300 × g per 5 minuti e decantare il surnatante.
8. Risospendere il pellet in 0,5 ml di 1x PBS e mescolare accuratamente. Conservare a 2 °C - 8 °C. Inviare i campioni ai due laboratori per l'analisi citometrica a flusso.
   NOTA: il campione di controllo negativo e il controllo a singola colorazione della cella devono essere elaborati contemporaneamente.

2. Preparazione delle perle di compensazione e del controllo monocolore

1. Etichetta V500-anti-CD45 monocolore, APC-H7-anti-CD3 mono-macchiato, FITC-anti-CD4 mono-macchiato, R718-anti-CD8 mono-macchiato, BV605-anti-CD27 mono-macchiato, APC-anti-CD45RA mono-macchiato, PE-anti-CD25 mono-macchiato, BV421-anti-CD127 mono-macchiato, BB700-anti-CD19 mono-colorato e PE-CY7-anti-IgD mono-macchiato.
2. Aggiungere 100 μL di 1x tampone salino tampone fosfato (DPBS) di Dulbecco contenente siero bovino fetale (FBS) all'1% in una provetta di polistirene a fondo tondo da 5 ml.
3. Aggiungere 50 μL delle sfere negative e 50 μL delle sfere anti-topo Ig, κ a ciascun tubo e vortice.
4. Aggiungere 2 μL di ciascun anticorpo marcato (CD45, CD3, CD4, CD8, CD25, CD127, CD45RA, CD27, CD19, IgD) in un tubo a colorazione singola. Vortice delicatamente la miscela e incubare per 15 minuti al buio a temperatura ambiente (da 20 °C a 25 °C).
5. Risospendere le perle in 2 ml di 1x PBS, centrifugare a 300 × g per 5 minuti e decantare il surnatante.
6. Risospendere le perle in 0,5 ml di 1x PBS e mescolare accuratamente. Conservare a 2 °C - 8 °C.

3. Utilizzo di nomi di configurazione identici sui diversi citometri in due laboratori

1. Creare una nuova configurazione nel software del citometro A. Fare clic sul pulsante Citometro e scegliere Visualizza configurazioni per visualizzare la finestra di configurazione.
2. Nell'elenco di configurazione fare clic con il pulsante destro del mouse sulla cartella delle configurazioni di base, scegliere Nuova cartella e rinominarla.
3. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla configurazione di base e scegliere copia.
4. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulla nuova cartella e incollare la configurazione di base per creare una nuova configurazione. Rinominare la nuova configurazione "Standardized Method Transfer".
5. Trascinare il nome del parametro, ad esempio FITC, dall'elenco Parametri al rilevatore appropriato (530/30).
6. Modificare parametri aggiuntivi (PE, BB700, PE-CY7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 e BV605) nella nuova configurazione.
7. Seguire questo metodo per creare una nuova configurazione su un diverso modello di citometro a flusso utilizzando lo stesso nome "Standardized Method Transfer". Assicurarsi che la configurazione includa gli stessi parametri per ciascun rilevatore.
   NOTA: per identificare correttamente il modello di esperimento sui due diversi modelli di citometro a flusso, assicurarsi che il nome sia coerente.
8. Nelle configurazioni del citometro, utilizzare le perle CST (Cytometer Setup and Tracking) per definire la linea di base del citometro e tenere traccia delle prestazioni del citometro. Fare clic sul pulsante Citometro e scegliere CST per visualizzare l'area di lavoro di configurazione e tracciamento del citometro.
9. Aggiungere tre gocce (150 μL) di perline di configurazione a 0,5 mL di 1x PBS in una provetta di polistirene a fondo tondo da 5 ml. Posizionare il tubo delle perline sul citometro.
10. Nella finestra Controllo installazione scegliere Definisci baseline e fare clic su Esegui.

4. Standardizzazione dell'esperimento utilizzando il citometro A nel laboratorio di trasferimento

1. Eseguire un controllo delle prestazioni utilizzando la configurazione del citometro e le perline di tracciamento per verificare che il citometro funzioni correttamente.
2. Nella finestra del browser software, fare clic con il pulsante destro del mouse sulle impostazioni del citometro e scegliere Impostazioni applicazione per creare un foglio di lavoro.
3. Utilizzando un campione non colorato, regolare le tensioni del tubo fotomoltiplicatore (PMT) di FSC, SSC e tutti i parametri di fluorescenza. FSC: 260; SSC: 460; CODICE COMUNITARIO: 490; PE: 575; BB700: 620; PE-CY7: 640; APC: 600; R718: 620; APC-H7: 620; BV421: 466; V500: 420; e BV605: 505.
4. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulle impostazioni del citometro dell'esperimento e scegliere le impostazioni dell'applicazione per salvarlo.
5. Fai clic sul pulsante dell'esperimento e scegli il menu di impostazione della compensazione . Quindi, scegli Crea controlli retribuzione per aggiungere automaticamente controlli di retribuzione .
6. Registrare i dati per tutte le perle di controllo della retribuzione.
7. Fai clic sull'esperimento e scegli l'impostazione della compensazione. Quindi, calcola automaticamente il compenso.
8. Registrare i dati per i controlli a singola colorazione a cella.
9. Utilizzare CD45RA APC per modificare il valore di compensazione di R718 in 15% APC. Utilizzare CD19 BB700 per modificare il valore di compensazione di APC-H7 al 14% BB700. Utilizzare CD8 R718 per modificare il valore di compensazione di APC-H7 al 60% R718.
10. Registrare i dati per le perline CST.
11. Creare un foglio di lavoro globale del modello di valore di destinazione per le perline luminose CST.
12. Utilizzando un plottaggio FSC/SSC, disegnate il cancello poligonale per le perline luminose CST. Ottenere grafici istografici di 10 canali di fluorescenza per le sfere luminose CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 e BV605. Creare porte di intervallo nei grafici dell'istogramma. Creare la visualizzazione delle statistiche visualizzando la mediana delle porte dell'intervallo.
13. Eseguire i campioni sul citometro a flusso; raccogliere un totale di 25.000 linfociti.
14. Creare un foglio di lavoro globale del modello di analisi per i campioni.
15. Utilizzare la seguente strategia di gating di esempio:
    1. Utilizzando un dot plot CD45/side scatter-area (SSC-A), disegnare il gate poligonale per identificare la popolazione di linfociti intatta escludendo i detriti.
    2. Utilizzando un dot plot CD3/CD19, disegnare un gate rettangolare per selezionare le cellule T CD3+ e le cellule B CD19⁺.
    3. Utilizzando un dot plot CD4/CD8, disegnare un quad gate per selezionare le cellule T CD4+ o CD8⁺ (cellule con un'alta fluorescenza per questi marcatori, rispettivamente).
    4. Utilizzando un dot plot CD45RA/CD27, disegnare un quad gate per suddividere le cellule T CD8+ o CD4+ in cellule naïve (CD27⁺CD45RA+), T_CM (CD27+ CD45RA-), T_EM (CD27-CD45RA-) e T_EMRA (CD27-CD45RA+).
    5. Utilizzando un dot plot CD25/CD127, disegnare un quad gate per suddividere le cellule T CD4⁺ in celle Treg (CD4⁺CD25⁺⁺CD127^low).
    6. Utilizzando un dot plot CD27/IgD, disegnare un quad gate per suddividere le cellule B CD19+ in cellule B naïve (CD27-IgD⁺) e cellule B di memoria (CD27⁺IgD^-).
16. Salvare il modello sperimentale sul citometro A.
17. Utilizzare il CD-ROM per esportare il modello sperimentale.

5. Trasferimento del modello sperimentale al citometro B nel laboratorio del metodo di prova

NOTA: il modello sperimentale include le impostazioni dello strumento, il modello di analisi e il modello di valore target dell'intensità di fluorescenza mediana (MFI).

1. Eseguire un controllo delle prestazioni utilizzando perline CST per verificare che il citometro funzioni correttamente.
2. Importare il modello sperimentale e creare un esperimento per il citometro B utilizzando il modello.
3. Utilizzare lo stesso lotto di perle CST per regolare le tensioni dei parametri fluorescenti per ciascun canale di fluorescenza in modo che corrispondano allo strumento MFI precedente.
   NOTA: I valori delle IFM variano tra il ±5% (le IFM delle sfere luminose prima e dopo il trasferimento sono mostrate nella Tabella 2).
4. Regolare la tensione per FSC utilizzando il campione non macchiato, se necessario.
5. Fare clic con il pulsante destro del mouse sulle impostazioni del citometro sperimentale e scegliere le impostazioni dell'applicazione per salvare le impostazioni dell'applicazione .
6. Utilizzare CD45RA APC per modificare il valore di compensazione di R718 in 15% APC. Utilizzare CD19 BB700 per modificare il valore di compensazione di APC-H7 al 24% BB700. Utilizzare CD8 R718 per modificare il valore di compensazione di APC-H7 al 60% R718.
7. Eseguire i campioni sul citometro a flusso; raccogliere un totale di 25.000 linfociti.

6. Coerenza tra i risultati sperimentali ottenuti sui due citometri

1. Valutare le differenze nei sottogruppi di linfociti tra gli strumenti utilizzando ANOVA unidirezionale (p < 0,05).

Nella Figura 1 viene illustrato un foglio di lavoro globale del modello di valore di destinazione per le perline luminose CST. Utilizzando un plottaggio FSC/SSC, viene disegnato un cancello poligonale per selezionare le perline luminose CST. Sono stati ottenuti grafici istografici di 10 canali di fluorescenza per le sfere luminose CST: FITC, PE, BB700, PE-Cy7, APC, R718, APC-H7, BV421, V500 e BV605. Il valore di destinazione per ciascun parametro viene visualizzato mostrando la mediana all'interno delle porte dell'istogramma nella tabella 2. Le schermate dei modelli e delle impostazioni dei parametri nel software del citometro A e del citometro B sono mostrate nella Figura supplementare S1.

La figura 2 mostra i grafici a punti di un campione tra i due strumenti dopo la standardizzazione dello strumento. I dati dimostrano la coerenza tra i diversi strumenti utilizzando un modello di analisi automatica. I risultati di sei campioni sono stati confrontati tra due diversi modelli di strumenti nella Tabella 3. Nei due laboratori non sono state misurate differenze significative nelle percentuali di 15 sottogruppi linfoidi. Questi risultati mostrano che dati altamente comparabili sono stati ottenuti seguendo il metodo standardizzato. Le percentuali di 15 sottogruppi linfoidi di diversi strumenti sono mostrate nella Tabella supplementare S1.

Figura 1: Modello di foglio di lavoro globale per le perline luminose CST. Le perline luminose CST sono recintate nella trama FSC contro SSC. I grafici dell'istogramma di 10 canali di fluorescenza sono presentati per le perle luminose CST. Le porte di intervallo sono create per includere la popolazione di perline luminose di perle CST per ciascun rilevatore di fluorescenza. Abbreviazioni: FSC-A = area di diffusione diretta; SSC-A = area di dispersione laterale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Confronto dei grafici a punti di un campione tra i due strumenti. (A) CD45/SSC-A dot plot è usato per i linfociti gate. (B) Il dot plot CD3/CD19 viene utilizzato per eliminare le cellule T CD3+ e le cellule B CD19+. (C) Il dot plot CD4/CD8 viene utilizzato per identificare le cellule T CD3+ CD8+ e CD3+ CD4+. (D) Il dot plot CD25/CD127 viene utilizzato per il gate delle celle Treg (CD4+CD25++CD127low). (E) Il dot plot CD45RA/CD27 per le cellule T CD4+ viene utilizzato per eliminare naïve (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-) e TEMRA (CD27-CD45RA+). (F) Il dot plot CD45RA/CD27 per le cellule T CD8+ viene utilizzato per eliminare naïve (CD27+CD45RA+), TCM (CD27+ CD45RA-), TEM (CD27- CD45RA-) e TEMRA (CD27-CD45RA+). (G) Il dot plot CD27/IgD viene utilizzato per eliminare le cellule B naïve (CD27- IgD+) e le cellule B di memoria (CD27+ IgD-). La strategia di gating è di Zhang et al.7. Abbreviazioni: SSC-A = area di dispersione laterale; TCM = cellule T di memoria centrale; TEM = cellule T della memoria effettrice; TEMRA = cellule T di memoria effettrice differenziale terminale. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Volumi degli anticorpi e informazioni sui fluorofori coniugati per analisi citometriche a flusso. Abbreviazioni: BV = viola brillante; BB = blu brillante; FITC = isotiocianato di fluoresceina; PE = ficoeritrina; APC = alloficocianina.

Tabella 2: IFM di perline luminose prima e dopo il trasferimento. Abbreviazioni: MFI = intensità media di fluorescenza; BV = viola brillante; BB = blu brillante; FITC = isotiocianato di fluoresceina; PE = ficoeritrina; APC = alloficocianina.

Tabella 3: Valutazione delle differenze nei sottogruppi di linfociti tra gli strumenti. p > 0,05 non indica alcuna differenza significativa. Abbreviazioni: TCM = cellule T di memoria centrale; TEM = cellule T della memoria effettrice; TEMRA = cellule T di memoria effettrici terminalmente differenziate.

Tabella supplementare S1: Percentuali di sottogruppi di linfociti in sei campioni di strumenti diversi. Clicca qui per scaricare questo file.

Figura supplementare S1: Le schermate dei modelli e delle impostazioni dei parametri nel software del citometro A e del citometro B. (A) Il file XML dei modelli. (B) Gli screenshot dei modelli. (C) Le impostazioni dei parametri nel citometro A. (D) Le impostazioni dei parametri nel citometro B. Fare clic qui per scaricare questo file.

Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.