Method Article

Esplorare le funzioni del tessuto adiposo

DOI:

10.3791/64957

⸱

March 3rd, 2023

 , 
1Team Cellular and Molecular Pathophysiology of Obesity and Diabetes, C3M, Université Côte d'Azur, Inserm

In This Article

Abstract

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ARTICOLI DISCUSSI:

Cho, D. S., Doles, J. D. Preparazione di cellule progenitrici adipose da tessuti adiposi epididimali di topo. Giornale degli esperimenti visualizzati. (162), DOI: 10.3791/61694 (2020).

Peics, J. et al. Isolamento di sottopopolazioni di cellule stromali adipogeniche e fibro-infiammatorie da depositi adiposi intra-addominali murini. Giornale degli esperimenti visualizzati. (162), DOI: 10.3791/61610 (2020).

Estrada-Gutierrez, G. et al. Isolamento di adipociti vitali e frazione vascolare stromale da tessuto adiposo viscerale umano adatto per l'analisi dell'RNA e la fenotipizzazione dei macrofagi. Giornale degli esperimenti visualizzati. (164), DOI: 10.3791/61884 (2020).

Gilleron, J. et al. Esplorazione della struttura del tessuto adiposo mediante eliminazione di metilsalicilato e imaging 3D. Giornale degli esperimenti visualizzati. (162), DOI: 10.3791/61640 (2020).

Czepielewski, R. S. et al. Analisi linfatica e della rete sanguigna durante l'obesità. Giornale degli esperimenti visualizzati. (165), DOI: 10.3791/61814 (2020).

Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. Un modello di coltura cellulare di adipociti per studiare l'impatto della modulazione di proteine e micro-RNA sulla funzione degli adipociti. Giornale degli esperimenti visualizzati. (171), DOI: 10.3791/61925 (2021).

Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolamento, proliferazione e differenziazione di cellule staminali derivate dal macco rhesus. Giornale degli esperimenti visualizzati. (171), DOI: 10.3791/61732 (2021).

Batista Jr., M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Coltura tridimensionale di adipociti come modello per studiare il rimodellamento del tessuto adiposo bianco indotto dalla cachessia. Giornale degli esperimenti visualizzati. (167), DOI: 10.3791/61853 (2021).

Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolamento e caratterizzazione di vescicole extracellulari derivate da adipociti umani mediante filtrazione e ultracentrifugazione. Giornale degli esperimenti visualizzati. (170), DOI: 10.3791/61979 (2021).

Discussion

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Caratterizzata da un aumento della massa del tessuto adiposo (AT) e dal rimodellamento pro-infiammatorio delle cellule immunitarie AT, l'obesità è diventata un importante problema di salute pubblica in tutto il mondo poiché aumenta drasticamente il rischio di sviluppare malattie cardiovascolari, diabete di tipo 2 e malattie del fegato. Pertanto, esplorare la struttura e la funzione dell'AT è diventata un'importante sfida clinica. In questa raccolta di metodi, presentiamo diversi metodi all'avanguardia sviluppati per studiare la struttura e la funzione dell'AT in condizioni fisiologiche e patologiche.

L'AT è un tessuto eterogeneo composto da diverse popolazioni cellulari tra cui adipociti maturi, cellule progenitrici adipose (APC), progenitori fibro-infiammatori (FIP), cellule endoteliali e cellule immunitarie. Pertanto, al fine di caratterizzare questo tessuto, è possibile eseguire la fenotipizzazione di singole cellule. Nei loro articoli, Cho et al. e Peics et al. forniscono protocolli per isolare e caratterizzare le APC bianche residenti nell'AT di topo mediante smistamento cellulare attivato da fluorescenza (FACS)1,2. Questo passaggio è fondamentale non solo per contare il numero di APC residenti, che è un fattore importante nel determinare la capacità di espansione dell'AT, ma anche per esplorare ulteriormente la funzione di queste cellule a livello di singola cellula. Peics et al. forniscono anche un metodo per isolare i FIP2 bianchi residenti nell'AT di topo, cellule non adipogeniche produttrici di collagene che possono contribuire allo sviluppo di un fenotipo pro-infiammatorio noto per svolgere un ruolo nella disfunzione AT. Allo stesso modo, Estrada-Gutierrez et al. descrivono un protocollo per isolare simultaneamente adipociti maturi vitali e cellule della frazione vascolare stromale da biopsie AT viscerali umane3. Nel complesso, questi protocolli sono il gold standard per generare una sospensione di una singola cellula da AT umano e di topo, che è il primo passo critico per contare ulteriormente e fenotipizzare funzionalmente le diverse sottopopolazioni di cellule AT.

La relazione tra la struttura e la funzione è molto rilevante nell'AT. Un segno distintivo della disfunzione dell'AT durante l'obesità è legato all'aumento delle dimensioni degli adipociti e ad un profondo rimodellamento dell'AT. Questo rimodellamento ha un impatto non solo sugli adipociti e sulle popolazioni di cellule immunitarie, ma anche sulla rete linfatica e sui vasi sanguigni. Per apprezzare queste alterazioni nell'intero AT, Gilleron et al. sviluppanoun protocollo di compensazione AT 4 molto semplice, economico e veloce. Questo semplice protocollo visualizza tridimensionalmente la morfologia dell'AT di topo intero e di grandi biopsie AT umane. Ciò include le reti neuronali e vascolari, gli adipociti e la distribuzione delle cellule immunitarie innate e adattative, che sono tutti parametri importanti da studiare nell'obesità e nelle patologie associate. Per caratterizzare l'impatto dell'obesità sui vasi linfatici e sanguigni AT, Czepielewski et al. forniscono un metodo in vivo per colorare contemporaneamente l'arborizzazione linfatica e i vasi sanguigni iniettando lectine coniugate con fluorocromo5. Questo protocollo fornisce un modo per analizzare la morfologia in vivo di entrambe le reti, compresa la loro densità, volume e ramificazione. È interessante notare che la combinazione di questa strategia di etichettatura con una procedura di compensazione dell'AT4 consente una mappatura ad alta risoluzione dell'intero AT del topo in tre dimensioni (3D)5. Complessivamente, questi approcci possono caratterizzare la struttura dell'AT in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche, acquisendo informazioni sulla correlazione tra struttura e funzione dell'AT.

A causa della sua elevata eterogeneità e dell'enorme capacità di rimodellamento, analizzare la funzione degli adipociti all'interno dell'AT in vivo non è semplice, e quindi sono stati sviluppati diversi sistemi di coltura. Il vantaggio principale di tutti questi sistemi di coltura cellulare è l'alto livello di controllo sulla popolazione cellulare e sul microambiente. Jager et al. sviluppano un semplice protocollo per manipolare l'espressione dell'RNA negli adipociti maturi differenziati 3T3-L16. Sebbene questo sistema di coltura sia lontano dalle condizioni fisiologiche ideali, gli adipociti 3T3-L1 rimangono funzionali per quanto riguarda la segnalazione dell'insulina, l'assorbimento del glucosio, la lipogenesi e la lipolisi. Pertanto, questo protocollo fornisce un potente strumento per manipolare l'espressione di proteine e RNA non codificanti e studiare il loro ruolo sulle funzioni degli adipociti. Per avvicinarsi alle condizioni fisiologiche ideali, Poret et al. descrivono un metodo per generare adipociti maturi funzionali utilizzando cellule staminali di derivazione adiposa (ADSC) ottenute dal macaco rhesus AT7. Questo protocollo spiega come isolare le ADSC primarie e come indurne la proliferazione e la differenziazione. Gli autori suggeriscono inoltre che questa procedura potrebbe essere adattata ad altre specie. Sebbene questo sistema di coltura sia più vicino alle condizioni fisiologiche ideali rispetto alla linea cellulare 3T3-L1, gli adipociti maturi derivati dalle ADSC primarie vengono coltivati in 2D, che è diverso da in vivo. Per far fronte a questo problema, Batista Jr. et al. forniscono un protocollo efficiente per un sistema di coltura tissutale a stampa tridimensionale8. In questo lavoro, gli autori generano adiposferoidi da cellule della frazione vascolare stromale di topo e differenziano i precursori degli adipociti direttamente all'interno di questo sistema di coltura 3D. Questo approccio è irrevocabilmente più vicino alle condizioni fisiologiche ideali rispetto al metodo di coltura 2D, ma la mancanza di vasi che potrebbero portare nutrienti agli adipociti al centro degli sferoidi dovrebbe essere presa in considerazione. La modulazione dell'espressione di proteine e RNA non codificanti, come descritto6, all'interno di questi sistemi di coltura può portare a ulteriori informazioni sul ruolo funzionale di questi bersagli in adipociti fisiologicamente più rilevanti. Tuttavia, un sistema così complesso deve ancora essere stabilito. L'interesse maggiore di questi sistemi di coltura ex vivo/in vitro è l'alto livello di controllo sul microambiente, che include anche i fattori secreti dalle cellule. A questo proposito, il protocollo di Akbar et al. isola e caratterizza le vescicole extracellulari (EV) secrete dagli adipociti umani9. Recentemente, le vescicole extracellulari sono risultate importanti regolatori metabolici; questo metodo è obbligatorio per analizzare l'impatto metabolico di queste vescicole extracellulari derivate dagli adipociti in diverse situazioni metaboliche.

Nella presente raccolta di metodi, forniamo una panoramica dei protocolli all'avanguardia che coprono diversi aspetti dell'analisi AT, inclusi i sistemi di coltura ex vivo e in vitro , l'esplorazione 3D di interi tessuti e l'analisi di singole cellule. Sebbene nessun sistema di coltura sia perfetto, è importante scegliere il sistema di coltura che si adatti alla questione biologica. Pertanto, questa raccolta di metodi fornisce un'ampia gamma di procedure per isolare, differenziare e manipolare gli adipociti in vitro. La combinazione di tutti i diversi metodi qui descritti porterà a comprendere la morfologia e la funzione dell'AT.

Disclosures

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Gli autori non hanno nulla da rivelare

Acknowledgements

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Gli autori sono grati a Jean-François Tanti e Mireille Cormont per il loro supporto scientifico e i loro contributi. Questo lavoro è stato sostenuto dall'INSERM, dall'Université Côte d'Azur, e da sovvenzioni dell'Agenzia Nazionale Francese per la Ricerca (ANR) attraverso l'Investments for the Future Labex SIGNALIFE (ANR-11-LABX-0028-01), il programma UCA JEDI (ANR-15-IDEX-01) e il Young Investigator Program a J.G. (ANR18-CE14-0035-01-GILLERON) e a J.J. (ANR-20-CE14-0010-01).

References

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  1. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. Journal of Visualized Experiments. (162), e61694(2020).">Cho, D. S., Doles, J. D. Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues. Journal of Visualized Experiments. (162), e61694(2020).
  2. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (162), e61610(2020).">Peics, J., et al. Isolation of adipogenic and fibro-inflammatory stromal cell subpopulations from murine intra-abdominal adipose depots. Journal of Visualized Experiments. (162), e61610(2020).
  3. Isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for RNA analysis and macrophage phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (164), e61884(2020).">Estrada-Gutierrez, G., et al. Isolation of viable adipocytes and stromal vascular fraction from human visceral adipose tissue suitable for RNA analysis and macrophage phenotyping. Journal of Visualized Experiments. (164), e61884(2020).
  4. Exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3D imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).">Gilleron, J., et al. Exploring adipose tissue structure by methylsalicylate clearing and 3D imaging. Journal of Visualized Experiments. (162), e61640(2020).
  5. Lymphatic and blood network analysis during obesity. Journal of Visualized Experiments. (165), e61814(2020).">Czepielewski, R. S., et al. Lymphatic and blood network analysis during obesity. Journal of Visualized Experiments. (165), e61814(2020).
  6. An adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-RNA modulation on adipocyte function. Journal of Visualized Experiments. (171), e61925(2021).">Jager, J., Gaudfrin, M., Gilleron, J., Cormont, M., Tanti, J. F. An adipocyte cell culture model to study the impact of protein and micro-RNA modulation on adipocyte function. Journal of Visualized Experiments. (171), e61925(2021).
  7. Isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61732(2021).">Poret, J. M., Molina, P. E., Simon, L. Isolation, proliferation and differentiation of rhesus macaque adipose-derived stem cells. Journal of Visualized Experiments. (171), e61732(2021).
  8. Three-dimensional adipocyte culture as a model to study cachexia-induced white adipose tissue remodeling. Journal of Visualized Experiments. (167), e61853(2021).">Batista, M. L., Meshulam, T., Desevin, K., Rabhi, N., Farmer, S. R. Three-dimensional adipocyte culture as a model to study cachexia-induced white adipose tissue remodeling. Journal of Visualized Experiments. (167), e61853(2021).
  9. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).">Akbar, N., Pinnick, K. E., Paget, D., Choudhury, R. P. Isolation and characterization of human adipocyte-derived extracellular vesicles using filtration and ultracentrifugation. Journal of Visualized Experiments. (170), e61979(2021).

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