Non applicabile
Articolo metodologico
14 luglio 2023
Non applicabile
Coprendo ~ 40% del corpo umano, il muscolo scheletrico è un organo importante, che supporta funzioni critiche dal movimento alla respirazione e al metabolismo. È importante sottolineare che ha una capacità unica di autoripararsi dopo un infortunio e con questa capacità rigenerativa garantisce il completo recupero funzionale e strutturale da gravi danni in meno di un mese. Diversi tipi di cellule sono stati implicati in questa notevole capacità di riparazione, con le cellule staminali muscolari che hanno un ruolo centrale.
I ricercatori muscolari di tutto il mondo hanno sviluppato diversi test per analizzare il muscolo scheletrico a livello funzionale, molecolare e cellulare. Ogni tecnica ha i suoi punti di forza, con i test in vivo su modelli animali che rappresentano l'opzione con la maggiore rilevanza per l'uomo e la complessità degli organismi viventi. Le controparti in vitro ed ex vivo stanno guadagnando terreno poiché i gruppi di ricerca di tutto il mondo si sforzano di ridurre al minimo la ricerca sugli animali in vista del principio di sostituzione-riduzione-perfezionamento (3R) riconosciuto a livello internazionale. Questa raccolta di metodi mirava a fornire modelli in vivo ed ex vivo per studi molecolari, cellulari e muscolari funzionali in tutte le specie.
Montandon et al.1 descrivono tecniche per caratterizzare rapidamente i fenotipi di rigenerazione muscolare nei genotipi di controllo e mutanti del pesce zebra. In primo luogo, gli embrioni vengono genotipizzati utilizzando materiale che viene scosso da animali anestetizzati. Si tratta di una prospettiva entusiasmante, in quanto la maggior parte dei protocolli che coinvolgono la genotipizzazione di embrioni geneticamente modificati richiedono un sacrificio simultaneo dell'embrione. Successivamente, la rigenerazione viene indotta pugnalando una regione specifica della muscolatura della larva di zebrafish. Grazie alle proprietà ottiche del sarcomero, l'integrità del muscolo lesionato può essere valutata utilizzando l'imaging post-infortunio. Questo protocollo è di grande interesse per gli scienziati che studiano la rigenerazione muscolare in quanto è un metodo rapido e potenzialmente ad alto rendimento per studiare diversi mutanti per difetti rigenerativi.
Hüttner et al.2 e Pegoli et al.3 presentano un metodo che consente studi cellulari e molecolari delle cellule staminali muscolari, la popolazione cellulare al centro della rigenerazione muscolare. Il metodo è molto interessante per i ricercatori che si concentrano sugli studi di attivazione precoce e sulle interazioni cellula-nicchia. Il metodo delle colture a singola miofibra consente di coltivare e studiare le cellule staminali muscolari fino a 96 ore mentre sono ancora associate alle fibre muscolari, ricevendo segnali da questa nicchia endogena prossima. La tecnica è particolarmente difficile da stabilire a causa dei numerosi passaggi delicati che Hüttner et al.2 spiegano attentamente (ad esempio, la dissezione muscolare delicata e la dissociazione). Facendo un ulteriore passo avanti, gli autori descrivono in dettaglio il targeting dei siRNA per le analisi funzionali dei fattori che possono influenzare il comportamento delle cellule staminali e sottolineano l'importanza di confrontare le cellule trasfettate con siRNA con quelle trasfettate di controllo dallo stesso topo e muscolo. Parallelamente, Pegoli et al.3 descrivono come questo metodo possa essere adattato per studiare le cellule staminali muscolari nel contesto della distrofia muscolare di Emery-Dreifuss e della prima vita postnatale, concentrandosi sulle sfide legate alla fragilità muscolare in questo contesto. Per aumentare l'efficienza del protocollo, guidano i lettori con immagini di fibre con buona e cattiva sopravvivenza ed evidenziano la necessità di "convalidare empiricamente" il tempo di digestione.
Zaidan et al.4 descrivono un sistema di coltura ex vivo del muscolo scheletrico che favorisce la produzione di cellule di riserva quiescenti, pur mantenendo un certo numero di altri tipi di cellule, entrambi con sfide in sistemi di coltura alternativi. Pertanto, questo metodo può essere utile per i ricercatori orientati a studi di quiescenza o interazioni tra cellule staminali di nicchia, anche in condizioni che modificano i percorsi molecolari utilizzando farmaci, siRNA o vettori. Il protocollo prevede una rapida dissezione dei muscoli degli arti posteriori, seguita da digestione enzimatica e filtrazione. Successivamente, le cellule vengono poste in coltura, con la comparsa di cellule di riserva entro una settimana. Il protocollo consente l'amplificazione su larga scala di queste cellule di riserva, con la possibilità di imaging di cellule vive utilizzando topi geneticamente marcati, come Pax7nGFP.
Park et al.5 dimostrano come nitrati e nitriti possano essere misurati nel muscolo scheletrico, uno dei principali organi di stoccaggio dei nitrati. Il metodo descritto è di particolare interesse per i ricercatori che studiano la fisiologia dell'esercizio e i disturbi neuromuscolari o metabolici correlati al ciclo dell'ossido nitrico. Anche se c'è un significativo sviluppo tecnologico per facilitare le misurazioni di nitrati e nitriti, ci sono diversi parametri che possono influenzare il risultato finale e vengono accuratamente descritti e confrontati dagli autori (ad esempio, metodo di omogeneizzazione, dimensione della biopsia, tipo di muscolo).
Hessel et al.6 descrivono in dettaglio una procedura per prelevare biopsie dal muscolo tibiale anteriore di pazienti umani al fine di ottenere fibre di lunghezza sufficiente per esperimenti meccanici. Gli autori sottolineano che dovrebbero essere esclusi i pazienti con danni recenti al muscolo. Una volta ottenuto il consenso informato dei pazienti idonei, l'ecografia viene utilizzata per valutare il sito migliore nel muscolo per la raccolta della biopsia. Dopo aver discusso il percorso di iniezione ideale, il team esegue la biopsia utilizzando un ago specializzato. Infine, vengono descritti in dettaglio la cura del paziente post-operatoria e i metodi di lavorazione dei tessuti. Questo metodo è di particolare interesse per i medici-scienziati, che desiderano standardizzare la raccolta di tessuti dai pazienti per studi meccanici delle fibre muscolari.
In questa Raccolta di Metodi, gli studi meccanici sono presentati da Brightwell et al.7 e Corona et al.8. Questi articoli discutono i metodi per misurare la forza in modelli animali piccoli e grandi. La malattia o la lesione neuromuscolare influisce negativamente sulla forza muscolare; Pertanto, l'esercizio fisico, la nutrizione e gli interventi terapeutici mirano a ripristinarlo. Brightwell et al.7 descrivono in dettaglio un metodo per valutare la funzione del muscolo quadricipite nei topi in modo analogo ai metodi utilizzati nei pazienti umani. In primo luogo, forniscono i passaggi per preparare l'attrezzatura e il software necessari per l'esperimento. Successivamente, il topo viene anestetizzato e messo in posizione per la valutazione della funzione estensoriale. Gli elettrodi vengono posizionati nella parte distale del quadricipite per l'induzione della contrazione, viene valutata una corrente ottimale e vengono registrate e analizzate le misurazioni della coppia tetanica isometrica di picco. Utilizzando un modello animale più grande, Corona et al.8 valutano la coppia isometrica nel muscolo dorsiflessore degli arti posteriori di maiale, mostrando le impostazioni dettagliate dell'attrezzatura e il protocollo di misurazione della forza. Da notare che mostrano fronti d'onda di alta e bassa qualità per garantire un'acquisizione ottimale dei risultati. Riconoscono i punti di forza di questa tecnica non invasiva che consente analisi longitudinali dello stesso animale, ma discutono anche a lungo i passaggi critici (ad esempio, stimolazione nervosa, allineamento meccanico) e i limiti del metodo.
Ci sono ancora molte domande in sospeso nel campo della ricerca sul muscolo scheletrico: quali geni sono cruciali per la rigenerazione muscolare, come le cellule satelliti mantengono il potenziale rigenerativo nel corso della vita di così tanti organismi diversi e come la funzione muscolare è influenzata in diverse condizioni di malattia. Questa collezione presenta una serie di tecniche moderne per studiare la funzione e la riparazione muscolare a livello molecolare e meccanico, utilizzando un'ampia gamma di sistemi modello. Fornendo protocolli dettagliati, gli autori di questi articoli hanno già contribuito ad aumentare la coerenza e la trasparenza per la ricerca di base e applicata sul muscolo scheletrico.
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Nessun finanziamento esterno ha sostenuto questo lavoro.
Richiedi il permesso di riutilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE
Richiedi permesso