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Tutti gli organismi pluricellulari sulla terra, compresi gli animali e le piante, si sono evoluti dagli eucarioti unicellulari ~1,7 miliardi di anni fa1. Distinte dai procarioti primitivi, le cellule eucariotiche hanno un nucleo legato alla membrana e molti organelli racchiusi nella membrana all'interno del loro citoplasma, inclusi i mitocondri, l'apparato di Golgi, il reticolo endoplasmatico (ER), i lisosomi e le vescicole. Questi organelli formano compartimenti in cui sono localizzate funzioni biologiche specializzate e attività metaboliche altamente efficienti. A causa della risoluzione limitata della microscopia ottica, la maggior parte degli organelli intracellulari contiene strutture funzionali che rientrano nel limite di diffrazione della luce, rendendo la loro visualizzazione difficile2. Innovative tecniche di marcatura microscopica e biologica stanno iniziando a consentire la visualizzazione ad alta risoluzione di architetture ultrafini e la dinamica in vivo degli organelli. Questa raccolta riunisce metodi recenti che hanno etichettato e visualizzato con successo diversi organelli intracellulari in diverse specie e, quindi, hanno migliorato la nostra comprensione della regolazione spazio-temporale della biologia degli organelli.
Negli ultimi decenni, lo sviluppo di sensori fluorescenti e l'etichettatura delle proteine nelle cellule viventi hanno notevolmente facilitato la nostra comprensione delle dinamiche delle reti intracellulari, della trasduzione del segnale e delle interazioni cellula-cellula. Utilizzando metodi sintetici inorganici avanzati, sono stati inventati nanocristalli semiconduttori fluorescenti di dimensioni nanometriche, noti anche come punti quantici o QD, come nuova classe di reporter ottici. Normalmente, le particelle QD hanno una dimensione compresa tra 2 e 10 nm e hanno un'elevata fotosensibilità, stabilità e bassa citotossicità per le cellule. Le particelle QD sono emerse come alternative ai coloranti organici e alle proteine fluorescenti per l'imaging di processi intracellulari ad alta risoluzione. Nel protocollo di Aishwarya et al., gli autori descrivono l'immunomarcatura mediata da QD seguita dall'imaging con microscopia elettronica a trasmissione (TEM)3. Eseguendo la marcatura e l'imaging QD mirati agli anticorpi sotto TEM a super-risoluzione, gli autori hanno visualizzato con successo la localizzazione di Sigmar1 su più organelli cellulari in cellule cardiache di topo adulto e ne hanno evidenziato l'arricchimento sui lisosomi e sulle membrane mitocondriali. Oltre a sottolineare l'alta risoluzione e l'alta sensibilità della QD-TEM, gli autori menzionano anche diversi inconvenienti dei metodi. Ad esempio, il tetrossido di osmio utilizzato nell'immunomarcatura mediata da QD distrugge irreversibilmente le proprietà del campione e l'ottimizzazione delle fasi di fissazione e smascheramento dell'antigene è un elemento chiave ma impegnativo per garantire immagini di alta qualità.
Oltre alla QD, molti altri coloranti diversi sono stati applicati con successo per marcare gli organelli nelle cellule vive. Questi metodi hanno facilitato l'imaging dal vivo del processo di trasformazione o traslocazione degli organelli cellulari in vivo. A volte, vengono utilizzati più coloranti specifici per gli organelli per visualizzare contemporaneamente diversi tipi di organelli. Nel protocollo di Liu, Li et al.4, gli autori forniscono un protocollo dettagliato per la colorazione in tempo reale e l'imaging sia dei mitocondri che dei lisosomi in cellule di fibroblasti embrionali di topo (MEF) utilizzando due diversi coloranti: MitoTracker Green e LysoTracker Red4. In questo studio, entrambi i coloranti hanno mostrato un'elevata sensibilità alla fluorescenza e stabilità specifica per i mitocondri e i lisosomi, rispettivamente. Inoltre, gli autori hanno osservato e registrato con successo il processo cellulare critico in vivo della mitofagia indotto dal cianuro di carbonile-4 (trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP) nelle cellule MEF utilizzando il protocollo. Nella discussione, gli autori affermano che il protocollo può essere applicato con diverse linee cellulari o cellule di tessuti ottimizzando la concentrazione del colorante e il tempo di colorazione.
Facendo uso di costrutti reporter composti da proteine specifiche dell'organello fuse a tag fluorescenti, è possibile osservare in vivo la dinamica degli organelli e i modelli di espressione senza immunomarcatura. Nel protocollo di Liu, Zhu et al.5, gli autori forniscono un protocollo dettagliato per l'imaging della maggior parte dei tipi di organelli subcellulari nel lievito vivente in gemmazione, Saccharomyces cerevisiae5. Per i principianti che lavorano con il lievito in erba, questo protocollo è utile per imparare a identificare la localizzazione subcellulare delle proteine e tracciare gli organelli di interesse utilizzando l'imaging time-lapse. Una limitazione del protocollo è che la maggior parte dei costrutti utilizzati nel protocollo non possono essere utilizzati per etichettare organelli in altre specie. Per diversi tipi di cellule eucariotiche, i modelli specifici degli organelli di proteine fluorescenti dovrebbero ancora essere convalidati mediante immunocolorazione anticorpale.
È stato sviluppato per la prima volta un test di captazione degli anticorpi per la marcatura in tempo reale della segnalazione endosomiale Notch/Delta nei precursori degli organi sensoriali di Drosophila notum6. A causa della natura sensibile al dosaggio della segnalazione Notch/Delta, l'espressione di un costrutto reporter all'interno delle cellule non è adatta per visualizzare la segnalazione Notch/Delta in vivo, poiché una copia extra del gene fuso con il reporter interromperebbe la normale segnalazione e, a sua volta, il destino cellulare. Nel protocollo di Zhao e Guo7, gli autori applicano il saggio di captazione degli anticorpi per l'imaging del traffico endosomiale Notch/Delta nei progenitori della glia radiale del cervello di zebrafish7 in via di sviluppo. Nel protocollo, dopo la microiniezione dell'anticorpo coniugato anti-DeltaD-Atto647N precisamente nel ventricolo retroencefalico embrionale da 24 hpf (ore dopo la fecondazione), l'intero processo di traffico endosomiale viene registrato utilizzando l'anticorpo anti-DeltaD-Atto647N internalizzato durante la mitosi dei progenitori della glia radiale. Nello studio, è stato riscontrato che il test di captazione degli anticorpi non interferiva con la segnalazione Notch/Delta. Questo protocollo può essere utilizzato per visualizzare la segnalazione di altri ligando-recettori di membrana, dato che è disponibile un anticorpo contro il dominio extracellulare della proteina di interesse.
I recenti sviluppi della microscopia ad espansione (ExM), che prevede l'espansione fisica del campione all'interno di un idrogel rigonfiabile, hanno consentito l'utilizzo di microscopi confocali convenzionali per l'imaging a super-risoluzione. Sin dalla sua invenzione, ExM è stato testato con molti tipi diversi di campioni biologici8. Una delle principali sfide dell'ExM è la perdita del segnale fluorescente durante le fasi di polimerizzazione e digestione. L'ExM di ritenzione delle etichette, sviluppato di recente, ha risolto il problema con gli ancoraggi trifunzionali9. Nel protocollo di Park et al.10, gli autori descrivono come eseguire l'ExM di ritenzione dell'etichetta (LR-ExM) con un set di ancore trifunzionali10. Il protocollo migliora l'imaging al microscopio ad espansione non solo prevenendo la perdita di segnale, ma anche promuovendo un'etichettatura ad alta efficienza con tag SNAP o CLIP. Nel loro studio, gli autori hanno dimostrato con successo LR-ExM multicolore per una varietà di strutture subcellulari e hanno raggiunto una risoluzione molecolare singola combinando LR-ExM con la microscopia a ricostruzione ottica stocastica a super-risoluzione (STORM).
Con il rapido sviluppo della microscopia a super-risoluzione e l'avvento di nuove tecniche di marcatura fluorescente, possiamo anticipare ulteriori miglioramenti nei metodi e nei protocolli per la visualizzazione degli organelli intracellulari a una risoluzione senza precedenti. Questi sforzi sono pronti a portare nuove scoperte nella comprensione delle dinamiche e delle funzioni degli organelli intracellulari.