Imaging a singola molecola della mobilità laterale e dell'attività dei canali ionici in doppi strati lipidici mediante microscopia a fluorescenza a riflessione interna totale (TIRF)

Il presente protocollo si propone di descrivere come studiare la correlazione tra mobilità di membrana e permeabilità dei canali ionici di proteine di membrana in membrane a doppio strato (DIB) supportate da polimeri ^1,2,3.

La presente tecnica integra una serie impressionante di strumenti analitici ottici e di superficie avanzati, come il tracciamento di singole particelle^4,5, la spettroscopia di correlazione di fluorescenza ^6,7 e la microscopia a forza atomica ad alta velocità 8,9,10. Questi forniscono preziose informazioni sulla composizione dinamica e sulla struttura delle membrane che influenzano le reazioni basate sulla membrana^11,12,13. Mentre il movimento e la diffusione laterale delle proteine dipendono dalla densità locale delle proteine nella membrana, le singole molecole proteiche possono anche essere intrappolate nelle zattere lipidiche¹⁴ e dalle interazioni proteina-proteina^15,16. A seconda dei domini proteici che sporgono dalla membrana nell'ambiente extracellulare o citosol, la mobilità delle proteine può variare da altamente mobile a completamente immobile. Tuttavia, a causa della complessità della membrana e delle sue strutture periferiche, è spesso difficile decifrare l'interazione tra la natura della mobilità laterale e la funzione proteica¹⁷.

Le membrane DIB hanno dimostrato di essere una piattaforma efficiente per l'analisi biofisica di singole molecole delle proteine di membrana 18,19,20,21,22. Sono formati dall'autoassemblaggio lipidico attraverso il contatto di goccioline acquose con substrati supportati da idrogel in fase lipido/oleosa. Analogamente ai doppi strati lipidici supportati (SLB) comunemente usati1,23,24,25^, i DIB consentono la regolazione locale della mobilità laterale mediante legame temporaneo o permanente delle proteine alla matrice polimerica quando funzionalizzati con ligandi adatti¹⁷. Quest'ultimo può servire come sistema modello per i processi biochimici nelle membrane cellulari con una distribuzione proteica eterogenea¹⁰.

L'approccio sperimentale qui descritto si basa sulla fluorescenza dei coloranti sensibili al Ca 2+ per misurare il flusso ionico Ca 2+ attraverso singoli canali in prossimità della membrana ^2,22 utilizzando la microscopia TIRF. Questo approccio ottico limita l'illuminazione del campione a una distanza vicina alla membrana, che, a causa delle proprietà fisiche della luce di eccitazione evanescente, porta ad una significativa riduzione del fondo di fluorescenza. Quest'ultimo è un prerequisito se è richiesta un'elevata risoluzione spaziale e temporale per la rilevazione di singole molecole. A differenza dei classici metodi elettrofisiologici^26,27, non sono necessarie tensioni di membrana per studiare il flusso ionico attraverso i singoli canali. Inoltre, il metodo non richiede l'etichettatura con coloranti fluorescenti o molecole che potrebbero interferire con il movimento laterale dei canali nella membrana.

Il metodo è particolarmente utile per studiare i canali proteici incorporati nella membrana a livello di singola molecola senza utilizzare l'elettrofisiologia classica. Utilizzando il canale conduttore di proteine mitocondriali TOM-CC di Neurospora crassa^28,29,30 e OmpF, che supporta la diffusione di piccole molecole idrofile attraverso la membrana esterna di Escherichia coli^17,31, illustriamo come le mobilità di membrana e le attività del canale delle due proteine possono essere studiate e correlate. Suggeriamo che questo approccio, sebbene ottimizzato per TOM-CC e OmpF, possa essere facilmente applicato ad altri canali proteici.

1. Produzione di proteine

NOTA: Questa sezione descrive la procedura per isolare OmpF da Escherichia coli BE BL21(DE3) omp6^31,32, che manca di LamB e OmpC, e TOM core complex da Neurospora crassa (Figura 1)^28,29. Quest'ultimo richiede mitocondri isolati da un ceppo 28 di N. crassa contenente una forma marcata con 6xHis della subunità TOM Tom22 (Figura 1A), che può essere isolata come descritto²⁸. I seguenti protocolli di solito producono 1-2 mg di N. crassa TOM-CC e 10 mg di E. coli OmpF. Se la quantità deve essere regolata, è importante che i rapporti proteine/detergenti siano mantenuti con precisione. Se non diversamente specificato, tutte le fasi devono essere eseguite a 4 °C.

1. Isolamento del complesso centrale TOM
   1. Solubilizzare i mitocondri purificati di N. crassa (2 g di proteine) ottenuti per sedimentazione differenziale da circa 1,5 kg (peso umido) di ife, secondo Bausewein et al.30, ad una concentrazione proteica di 10 mg/ml in 20 mM Tris-HCl (pH 8,5), 1% (p/v) DDM, 20% (v/v) glicerolo, 300 mM NaCl, 20 mM imidazolo e 1 mM fenilmetilsulfonil fluoruro (PMSF) per ³⁰ minuti a 4 °C.
      ATTENZIONE: PMSF è tossico. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale.
   2. Trasferire i mitocondri solubilizzati in provette ultracentrifughe e separare le membrane non solubilizzate dalle proteine solubilizzate di membrana mediante ultracentrifugazione a 130.000 x g per 40 minuti a 4 °C e filtrazione con carta da filtro di qualità standard.
   3. Equilibrare una colonna Ni-NTA preconfezionata (volume di 5 ml) con circa 5 volumi di colonna (CV) di tampone A1 (Tabella 1) utilizzando un sistema automatizzato di purificazione delle proteine. Far funzionare la colonna Ni-NTA a una portata costante di 1 mL/min durante tutte le fasi. Utilizzare una colonna di volume inferiore (1 ml) se le proteine sono state isolate da meno di 2 g di mitocondri.
   4. Caricare il campione proteico solubilizzato sulla colonna Ni-NTA ad una velocità di flusso di 1 ml/min.
   5. Lavare la colonna Ni-NTA con 5 CV di tampone A1 (Tabella 1) per rimuovere le proteine non legate.
   6. Eluire TOM-CC marcato con il 30% di tampone A2 (Tabella 1; 300 mM di imidazolo) e raccogliere il picco proteico come appare nel cromatogramma a 280 nm (Figura 1B).
   7. Per un'ulteriore purificazione di TOM-CC, equilibrare la colonna di scambio anionico preconfezionata (1 ml) con 5 CV ciascuno di tampone B1, B2 e B1 (Tabella 1) utilizzando il sistema automatizzato di purificazione delle proteine. Far funzionare la colonna di scambio anionico ad una portata costante di 1 mL/min durante tutte le fasi.
   8. Caricare la frazione di picco TOM-CC (passo 1.1.6) sulla colonna di scambio anionico (portata di 1 ml/min).
   9. Rimuovere le proteine non legate lavando la colonna con 5 CV di tampone B1 (Tabella 1) e un gradiente salino lineare dello 0%-20% del tampone B2 (Tabella 1).
   10. Eluire TOM-CC con un gradiente salino lineare del 20%-35% tampone B2 e raccogliere la frazione di picco proteica come appare nel cromatogramma a 280 nm (Figura 1C).
   11. Valutare la purezza del campione mediante SDS-PAGE (Figura 1D) e determinare la concentrazione proteica utilizzando un saggio proteico disponibile in commercio, secondo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali).
   12. Congelare i campioni proteici in azoto liquido e conservarli a -80 °C fino a un ulteriore utilizzo.
       ATTENZIONE: L'azoto liquido deve essere maneggiato in aree ben ventilate. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale.
        
2. Isolamento di OmpF
   1. Recuperare il ceppo di E. coli BE BL21(DE3) omp6, privo di LamB e OmpC³², da uno stock di glicerolo congelato in condizioni sterili e strisciare su una piastra di agar Luria-Bertani (LB) (Tabella 2). Per fare ciò, distribuire gradualmente il campione in modo uniforme su tutta la piastra.
   2. Lasciare il campione in ammollo nell'agar per 5 minuti, prima di capovolgere la piastra con il coperchio chiuso e incubare per una notte a 37 °C.
   3. Selezionare una singola colonia di E. coli , inoculare 7,5 mL di terreno LB (Tabella 2) con questa singola colonia utilizzando uno stuzzicadenti sterile, e lasciare crescere per una notte (14 ore) con agitazione (170 rpm) a 37 °C.
   4. Trasferire 2 x 1 mL di cellule di E. coli con pipette sterili in 2 x 500 mL di terreno LB (Tabella 2) e lasciare crescere per una notte (~14 h) a 37 °C agitando (~170 rpm) in uno shaker.
   5. Raccogliere le celle mediante centrifugazione a 5.000 x g per 20 minuti a 4 °C, congelare il pellet in azoto liquido e conservare a -80 °C fino a ulteriore utilizzo.
      NOTA: Il peso umido del pellet cellulare è tipicamente di 5 g per 1 L di coltura. A questo punto, il protocollo può essere messo in pausa.
   6. Scongelare e risospendere le celle (2 g) in 20 ml di tampone di lisi C1 (Tabella 2) e far passare la sospensione tre volte a 1.000 psi attraverso un sistema di interruzione delle celle ad alta pressione preraffreddato (4 °C), con un volume massimo di campionamento di 35 ml, secondo le istruzioni del produttore.
      ATTENZIONE: L'uso di una pressa francese può causare gravi lesioni. Non superare mai il limite di pressione della cella utilizzata. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale.
   7. Rimuovere le cellule ininterrotte dal lisato mediante centrifugazione a 4.000 x g per 15 minuti e raccogliere il surnatante.
   8. Raccogliere le membrane mediante ultracentrifugazione a 100.000 x g per 1 ora.
   9. Risospendere il pellet di membrana in 10 ml di tampone C2 (Tabella 2) e miscelare con un volume uguale di tampone SDS C3 (Tabella 2) utilizzando un omogeneizzatore di vetro con cuscinetti a sfera.
      ATTENZIONE: β-mercaptoetanolo nel tampone C3 è tossico. Seguire tutte le norme di sicurezza pertinenti.
   10. Incubare la sospensione a bagnomaria a 50 °C per 30 min.
   11. Centrifugare il campione a 100.000 x g a 20 °C per 1 ora.
   12. Risospendere il pellet di membrana in 10 ml di tampone SDS C4 (Tabella 2) utilizzando un omogeneizzatore di vetro con cuscinetti a sfera e incubare la sospensione a bagnomaria a 37 °C per 30 minuti.
       NOTA: Se il pellet non può essere risospeso, aggiungere altro buffer SDS C4 fino a un volume di 20 ml.
   13. Centrifugare il campione a 100.000 x g a 20 °C per 30 minuti e raccogliere il surnatante.
   14. Miscelare il surnatante con ottilpoliossietilene (ottile POE) fino ad una concentrazione finale del detergente dello 0,5% (p/v) e dializzare il campione due volte contro il tampone C5 (Tabella 2) a 4 °C per 24 ore. A tale scopo, utilizzare tubi di dialisi con un taglio di 20 kDa, secondo le istruzioni del produttore, e posizionare il campione nel tubo o nel dispositivo di dialisi.
       NOTA: Il taglio del tubo di dialisi deve essere regolato se le proteine con altre masse molecolari vengono dializzate .
   15. Valutare la purezza del campione mediante SDS-PAGE e determinare la concentrazione proteica utilizzando un saggio proteico disponibile in commercio, secondo il protocollo del produttore (Table of Materials).
       NOTA: I campioni riscaldati a 95 °C mostrano OmpF monomerico. I campioni non riscaldati mostrano OmpF nella sua forma trimerica (Figura 1F).
   16. OmpF dializzato con surgelazione congelata in aliquote in azoto liquido e conservare a -20 °C fino a ulteriore utilizzo.
       ATTENZIONE: L'azoto liquido deve essere maneggiato in aree ben ventilate. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale.

2. Registrazione ottica a canale singolo di canali ionici in membrane DIB

NOTA: Questa sezione descrive la procedura per la preparazione delle membrane DIB nelle camere microfabbricate di polimetilmetacrilato (PMMA)² per monitorare il movimento laterale delle proteine e il flusso ionico attraverso singoli canali ionici¹⁷. Le dimensioni e i disegni esatti per la produzione della camera possono essere trovati in Lepthin et ^al.2. La figura 2 fornisce una panoramica dell'assemblaggio della camera PMMA² e della formazione delle membrane DIB. Se non diversamente specificato, tutti i passaggi vengono eseguiti a temperatura ambiente (RT). La Figura 3 mostra una rappresentazione schematica di una membrana DIB e come il flusso di Ca²⁺ attraverso una proteina a canale singolo viene utilizzato per monitorare sia il movimento nella membrana che lo stato aperto-chiuso del canale.

1. Preparazione dei lipidi
   1. Rimuovere dal congelatore a -20 °C la soluzione madre lipidica contenente 1,2-difitanoil-sn-glicero-3-fosfocolina (25 mg/mL DPhPC) sciolta in cloroformio e riscaldare a RT. A tale scopo, è generalmente sufficiente riscaldare lentamente il campione a mano per alcuni minuti.
      ATTENZIONE: Il cloroformio è tossico. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale ed eseguire tutte le procedure che comportano cloroformio sotto una cappa aspirante.
   2. Trasferire 380 μL di soluzione madre di DPhPC (25 mg/mL DPhPC) in un flaconcino di vetro. Evitare pipette con guarnizioni in gomma. Invece, utilizzare siringhe di vetro da microlitri con stantuffi in acciaio inossidabile.
   3. Dopo aver maneggiato la soluzione madre lipidica, sovrapporre la soluzione madre lipidica con gas Ar o N₂ per prevenire l'ossidazione dei lipidi. Utilizzare il flusso di gas più basso possibile per evitare l'evaporazione del solvente organico in cui i lipidi sono disciolti o gli schizzi degli spray di solvente dal flaconcino. Assicurarsi che i coperchi dei flaconcini di vetro contenenti lipidi con solvente organico siano rivestiti con politetrafluoroetilene (PTFE) all'interno.
   4. Asciugare il campione lipidico (fase 2.1.2) sotto un flusso di N 2 e rimuovere il solvente organico rimanente dal campione lipidico per una notte sotto vuoto (_2,0 mbar) utilizzando una pompa per vuoto oil-free.
   5. Sciogliere il film lipidico in soluzione di esadecano/olio di silicone aggiungendo volumi uguali di esadecano e olio di silicone (500 μL ciascuno) utilizzando una siringa di vetro da microlitro fino a una concentrazione lipidica finale di 9,5 mg/ml.
      NOTA: La soluzione lipidica è stabile a RT per diverse settimane.
2. Preparazione di idrogel di agarosio
   1. Preparare circa 1 mL di soluzione di agarosio a basso punto di fusione (0,75% [p/v]) in acqua deionizzata doppia e portare a 85 °C in un blocco riscaldante per 20 minuti da utilizzare per i vetrini di rivestimento a rotazione.
      NOTA: La soluzione di agarosio può essere conservata a RT per diverse settimane e può essere riscaldata più volte.
   2. Preparare una soluzione di agarosio a basso punto di fusione al 2,5% (p/v) in 0,66 M CaCl 2 e 8,8 mM HEPES (pH_7,2 ) e portare a 85 °C in un blocco riscaldante per 20 minuti. Assicurati che l'agarosio sia ben sciolto.
      NOTA: La soluzione di agarosio può essere conservata per diverse settimane a RT e può essere riscaldata più volte, proprio come l'agarosio (fase 2.2.1) utilizzato per il rivestimento di rotazione.
3. Assemblaggio della camera in polimetilmetacrilato (PMMA) e formazione di monostrato lipidico all'interfaccia idrogel esadecano/olio di silicone
   1. Posizionare alcuni vetrini (40 mm x 24 mm x 0,13 mm) in un portavetrini in acciaio inossidabile e pulirli in un bicchiere di vetro per 10 minuti con acetone in un pulitore ad ultrasuoni. Utilizzare una quantità di acetone sufficiente per immergere i vetrini e coprire liberamente il becher con una lastra di vetro per creare un sistema chiuso e senza pressione che riduca al minimo la fuoriuscita di vapori durante il processo di pulizia.
      ATTENZIONE: L'acetone è un solvente altamente infiammabile con un basso punto di infiammabilità. Le miscele vapore/aria sono esplosive. Utilizzare il pulitore ad ultrasuoni in un'area ben ventilata. Indossare adeguati dispositivi di protezione individuale e osservare le precauzioni di sicurezza ufficiali (ad esempio, assenza di fiamme libere e scintille).
   2. Risciacquare i vetrini con acqua a doppia deionizzazione e asciugarli sotto un getto di N₂.
      NOTA: I vetrini puliti in questo modo possono essere conservati per diverse settimane.
   3. Pulire ulteriormente e idrofilizzare un coprivetrino in un detergente al plasma con ossigeno (0,5 mbar) per 5 minuti.
      NOTA: Eseguire questo passaggio immediatamente prima del rivestimento di centrifuga con soluzione di agarosio, poiché l'effetto idrofilo della pulizia al plasma svanisce nel tempo.
   4. Montare un coprislip trattato al plasma su un rivestimento a rotazione (Figura 2, fase 1).
   5. Rivestire il vetrino con una pellicola di agarosio spessa submicrometricamente aggiungendo lentamente 140 μL di agarosio a basso punto di fusione riscaldato allo 0,75% (p/v) (fase 2.2.1) a 3.000 giri/min per 30 s, utilizzando una pipetta da 200 μL (Figura 2, fase 1).
      NOTA: Lo spessore del film di agarosio può essere determinato mediante microscopia a forza atomica (AFM), come descritto¹⁷.
   6. Fissare immediatamente il coprislip rivestito di spin con lo strato sottile di idrogel di agarosio sul lato inferiore della camera PMMA². Assicurarsi che l'idrogel di agarosio punti verso l'alto (Figura 2, fase 2).
   7. Fissare i bordi del coprislip al dispositivo microlavorato in PMMA con nastro adesivo trasparente.
   8. Posizionare il dispositivo PMMA su una piastra riscaldata a 35 °C (Figura 2, fase 3).
   9. Versare con cautela 200 μL di soluzione di agarosio al 2,5% (fase 2.2.2) nell'ingresso della camera con una pipetta (Figura 2, fase 3), senza creare bolle d'aria in modo che il sottile idrogel applicato mediante rivestimento di spin possa equilibrarsi con il tampone della soluzione di agarosio al 2,5% e rimanere idratato. Assicurarsi che la soluzione di agarosio al 2,5% sia distribuita attorno all'idrogel di agarosio rivestito di spin ma non su di esso (Figura 3A), che può essere evitato premendo delicatamente la camera PMMA sulla piastra riscaldante.
   10. Coprire immediatamente i pozzetti della camera PMMA (Figura 2, fase 4) con un totale di 60 μL di soluzione lipidica/oleosa (fase 2.1.5), per avviare la formazione di monostrato lipidico all'interfaccia agarosio-olio ed evitare la disidratazione dell'agarosio rivestito di spin nei pozzetti della camera PMMA. Tenere il dispositivo su una piastra riscaldante a 35 °C per circa 2 ore.
       NOTA: I pozzetti circolari nella camera in PMMA hanno un diametro di 0,5 mm e una profondità di 1,8 mm, secondo^{il lavoro 2} precedentemente pubblicato.
4. Preparazione di goccioline acquose rivestite di lipidi in soluzione di esadecano/olio di silicone
   1. Introdurre 20 μL di soluzione lipidica di esadecano/olio di silicone (fase 2.1.5) in ciascuno dei vari pozzetti microfabbricati in una camera di incubazione delle goccioline (Figura 2, fase 4). I contenitori adatti per la soluzione lipidica di esadecano/olio di silicone sono piccoli recessi di 40 mm x 30 mm x 3,5 mm in una sottile lastra di PMMA².
   2. Preparare un ago di vetro microcapillare con un diametro di apertura della punta di 20 μm utilizzando un estrattore di micropipette verticale o orizzontale (ad esempio, utilizzato per la fabbricazione di pipette patch o elettrodi di vetro affilati). Stimare il diametro di apertura dell'ago di vetro microcapillare sotto uno stereomicroscopio binoculare a basso ingrandimento, in un intervallo di zoom compreso tra 7,5x e 35x.
      NOTA: le impostazioni per la modalità di preriscaldamento prima che il capillare di vetro venga tirato, la modalità di riscaldamento per la trazione e la forza di trazione devono essere determinate sperimentalmente in anticipo, in base alle specifiche del produttore del dispositivo di trazione e al tipo di capillare.
   3. Riempire l'ago di vetro microcapillare con 5 μL di soluzione acquosa per iniezione contenente 8,8 mM di HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl e 30 nM TOM core complex, o in alternativa 20 nM OmpF utilizzando una punta di pipetta microcapillare. Utilizzare solo acqua bidistillata precedentemente trattata con una resina chelante che lega ioni metallici polivalenti (Ca²⁺) per preparare la soluzione acquosa di iniezione.
   4. Montare l'ago di vetro microcapillare con la soluzione di iniezione acquosa su un nanoiniettore piezo-driven.
   5. Iniettare 100-200 nL di goccioline acquose (Figura 2, fase 4) contenenti 8,8 mM HEPES (pH 7,2), 7 μM Fluo-8, 400 μM EDTA, 1,32 M KCl e 30 nM TOM core complex (fase 1.1.12), o in alternativa 20 nM OmpF (fase 1.2.16) nei pozzetti nella camera di incubazione delle goccioline riempita con soluzione lipidica di esadecano/olio di silicone (vedere 2.1.5) utilizzando il nanoiniettore. Assicurati che le goccioline non si tocchino posizionandole a diversi millimetri (>10 mm) di distanza nei pozzetti. Altrimenti, se i monostrati lipidici non si sono ancora formati all'interfaccia olio/tampone, si fonderanno in goccioline più grandi.
      NOTA: Se non sono disponibili capillari di classe e nanoiniettori, le goccioline possono in alternativa essere preparate manualmente con pipette microlitritre monocanale per volumi compresi tra 0,1 μL e 0,5 μL, come descritto². In questo caso, tuttavia, i volumi delle goccioline non sono così precisi.
   6. Consentire la formazione di un monostrato lipidico all'interfaccia goccia/olio per circa 2 ore mantenendo le camere di incubazione PMMA e goccioline (Figura 2, fase 4) su una piastra riscaldata a 35 °C.
5. Preparazione e imaging di singoli canali ionici in membrane DIB
   1. Trasferire manualmente le singole goccioline acquose dai pozzetti della camera di incubazione delle goccioline sotto uno stereomicroscopio nei pozzetti della camera PMMA (Figura 2, fase 5), utilizzando una pipetta microlitro monocanale con una punta in polipropilene monouso da 10 μL. Lasciare che le goccioline affondino sui monostrati lipidici formati alle interfacce idrogel-olio per circa 5 minuti per formare un doppio strato lipidico (Figura 3) tra le goccioline e l'idrogel di agarosio.
   2. Montare la camera PMMA con membrane DIB sul supporto del campione di un microscopio a luce invertita e valutare la formazione della membrana utilizzando un obiettivo di contrasto di modulazione Hoffman 10x (Figura 2, fase 6). La formazione della membrana DIB è indicata da un anello bianco chiaro all'interfaccia tra la goccia e l'idrogel (Figura 4A). Le membrane DIB che sono state rotte non mostrano questo anello (Figura 4B).
      NOTA: In alternativa, le membrane DIB possono essere visualizzate con un ingrandimento 10x mediante contrasto di fase o microscopia a contrasto di interferenza differenziale (DIC).
   3. Se si sono formate membrane DIB, montare la camera PMMA sul supporto del campione di un microscopio TIRF (Figura 2, fase 7) dotato di una sorgente luminosa convenzionale per l'illuminazione dell'epifluorescenza, un laser da 488 nm (P_max = 100 mW) e una telecamera CCD retroilluminata con moltiplicazione di elettroni (512 x 512 pixel; >95% QE) per ottenere una dimensione dei pixel di ~0,16 μm.
   4. Focalizzare il bordo di una membrana DIB con un obiettivo di ingrandimento 10x sotto l'illuminazione a epifluorescenza con una sorgente luminosa ad alta intensità utilizzando un set di filtri GFP.
   5. Messa a fuoco fine dello stesso bordo della membrana DIB ad alto ingrandimento con un obiettivo TIRF 100x/N.A. 1.49 apochromat oil, sempre sotto illuminazione ad epifluorescenza, con la sorgente luminosa ad alta intensità utilizzando un set di filtri GFP che consente di visualizzare la debole fluorescenza di fondo del colorante fluorescente Fluo-8 nella goccia (Figura 4C).
   6. Modificare l'impostazione del filtro da GFP al set di filtri TIRF quad-band.
   7. Accendere il laser a 488 nm e impostare l'intensità del laser sull'obiettivo su un valore compreso tra 8 mW e 10 mW.
      NOTA: Poiché spesso non ci sono informazioni quantitative sull'intensità del laser sulla lente dell'obiettivo, le impostazioni di intensità del laser devono essere calibrate in anticipo in misurazioni separate sull'obiettivo, con un misuratore di potenza laser ottico dotato di un sensore a fotodiodo, secondo le specifiche del produttore.
      ATTENZIONE: Per garantire un funzionamento sicuro del laser, l'operatore deve essere consapevole dei possibili pericoli delle radiazioni laser e delle norme antinfortunistiche.
   8. Per visualizzare singoli canali ionici, regolare l'angolo TIRF e il guadagno della telecamera EMCCD (ad esempio, l'impostazione del moltiplicatore del guadagno EM: 285) in modo che i canali ionici aperti nella membrana DIB appaiano come punti fluorescenti ad alto contrasto su uno sfondo scuro (Figura 4D-G) e il rapporto segnale-sfondo, quando ispezionato visivamente, raggiunga un massimo. Assicurarsi che le macchie, corrispondenti al flusso Ca²⁺ attraverso singoli canali ionici, rimangano a fuoco e abbiano una forma rotonda, con alta intensità al centro e gradualmente decrescente verso la periferia. Le membrane senza canali mostrano solo fluorescenza di fondo (Figura 4C).
   9. Prima di registrare il movimento e l'attività aperta-chiusa dei singoli canali nel tempo, controllare che i punti fluorescenti siano a fuoco, per assicurarsi che i canali ionici si siano ricostituiti nelle membrane DIB e si muovano lateralmente nel piano della membrana. Se questo non è il caso, potrebbe indicare che una molecola fluorescente sta entrando e uscendo dal campo evanescente generato dal laser vicino alla membrana.
   10. Registrare una serie di immagini a membrana che consentono il corretto tracciamento della posizione e il monitoraggio dello stato aperto-chiuso dei singoli canali ionici. Per determinare il tipo di mobilità laterale (ad esempio, movimento libero vs ancoraggio transitorio [per riferimento, vedi¹⁶]) e lo stato dell'attività del canale (ad esempio, aperto o chiuso), acquisire traiettorie sufficientemente lunghe (ad esempio, da 30 s a 1 minuto) e ben campionate (ad esempio, frame rate di 48 ^s-1).
       NOTA: L'osservazione della diffusione canalizzata, ristretta o del luppolo¹⁶ richiede che la frequenza di campionamento sia sufficientemente veloce per misurare la diffusione senza restrizioni entro limiti confinanti. Inoltre, assicurarsi che il tempo di campionamento dei dati sia sufficientemente lungo per misurare la transizione dalla diffusione non vincolata a quella vincolata (per i dettagli, vedere Jacobson et ^al.16).
6. Elaborazione di immagini e dati
   NOTA: I pacchetti di elaborazione delle immagini open source³³ o le routine auto-scritte¹⁷ basate su pacchetti software commerciali possono essere utilizzati per analizzare le dinamiche spaziotemporali dei singoli canali ionici nei DIB. Per essere in grado di correlare la mobilità laterale della membrana con il flusso ionico attraverso i singoli canali, non devono essere applicati algoritmi di filtro.
   1. Correggere le serie temporali dell'immagine per lo sbiancamento applicando procedure standard³⁴ utilizzando routine autoscritte, adattando l'intensità media del fotogramma dell'immagine completa a , dove t è l'indice del fotogramma (tempo) e a k sono i parametri di adattamento. Quindi, correggere la serie temporale secondo , dove I(t) è l'intensità. In alternativa, per le analisi iniziali dei dati, eseguire correzioni in background utilizzando software open source con algoritmi di rolling-ball implementati³³ e un raggio di rolling-ball, a seconda del punto e della dimensione dei pixel della telecamera (ad esempio, 50 pixel).
   2. Determinare le posizioni spaziali e le ampiezze di un punto di fluorescenza all'interno di una regione di interesse definita (ROI) (ad esempio, 30 x 30 pixel), adattando I(t) in un dato momento t a una funzione gaussiana bidimensionale con inclinazione planare che tiene conto dei possibili gradienti di illuminazione locale secondo . Qui, x = (x, y) è il ROI con le informazioni sull'intensità della fluorescenza, A e σ sono l'ampiezza e le larghezze della gaussiana, p_k sono parametri che caratterizzano l'intensità di fondo del ROI e μ = (x 0, y ₀) definisce la posizione della gaussiana. Il flusso ionico attraverso un singolo canale è dato dal parametro A. La traiettoria del canale è data da x, e permette di determinare la mobilità laterale del canale. In alternativa, è possibile determinare le posizioni e le intensità dei singoli spot utilizzando piattaforme open-source³³ e plug-in come descritto^35,36. Stimare l'accuratezza posizionale³⁷ dopo la conversione della lettura della fotocamera EMCCD in numeri di fotoni³⁸.
   3. Tracciare l'ampiezza di fluorescenza A rispetto al tempo e la traiettoria corrispondente x per determinare una possibile correlazione tra la diffusività del canale e il flusso ionico attraverso il canale. Esegui questa operazione con qualsiasi software di grafica. In caso di movimento libero del canale laterale, determinare il coefficiente di diffusione laterale D mediante regressione lineare del ritardo temporale τ, e calcolare lo spostamento quadratico medio delle macchie da x secondo .
      NOTA: I coefficienti di diffusione tipici¹⁷ per TOM-CC e OmpF che si muovono liberamente nelle membrane DIB sono compresi tra 0,5 e 1,5 μm^{2 s-1}. Le molecole la cui costante di diffusione è inferiore a 0,01 mm²·^s-1 sono definite immobilizzate¹⁷.

La registrazione ottica a canale singolo senza elettrodi in tempo reale rivela l'interazione tra il movimento laterale delle proteine e la funzione dei singoli canali ionici nelle membrane DIB. La ricostituzione del complesso del nucleo mitocondriale TOM (Figura 1A) in una membrana DIB (Figura 4D) illustra una forte correlazione temporale tra mobilità laterale e permeabilità ionica (Figura 5A). Il gating TOM-CC sembra essere sensibile alla modalità di movimento laterale17. I canali mobili mostrano il flusso di Ca2+ attraverso i loro pori e alte intensità del punto di fluorescenza. Le molecole intrappolate e non in movimento mostrano intensità di fluorescenza basse e medie. Per il poro generale di importazione proteica dei mitocondri TOM-CC, questo approccio a singola molecola ha rivelato una forte correlazione temporale tra mobilità laterale e permeabilità ionica, suggerendo che il canale TOM-CC ha proprietà meccanosensibili17. Un arresto laterale delle molecole di TOM-CC che si muovono liberamente è accompagnato da una chiusura parziale o completa del canale TOM-CC. L'imaging delle membrane DIB con OmpF (Figura 1E e Figura 4F), che è quasi completamente incorporato nella membrana, non mostra effetti stop-and-go (Figura 5B). Gli arresti casuali di OmpF non sono associati a un cambiamento di intensità e, quindi, alla chiusura dei suoi pori. Sulla base dei segnali di fluorescenza38, l'accuratezza posizionale dei singoli canali può essere stimata nell'intervallo tra 5 e 10 nm. Tuttavia, va notato che questa precisione non può essere raggiunta se i canali oscillano leggermente a causa dell'ancoraggio mobile con l'idrogel di agarosio, come mostrato, ad esempio, per le molecole TOM-CC in uno stato intermedio con uno spostamento medio delle radici di 120 nm (Figura 5A).

Figura 1: Isolamento di TOM-CC. (A) Struttura criogenica EM di N. crassa TOM-CC30,39. I mitocondri di un ceppo di N. crassa contenente un Tom22 con un tag 6xHis sono stati solubilizzati in DDM e sottoposti a cromatografia di affinità Ni-NTA (B) e cromatografia a scambio anionico (C). (D) SDS-PAGE di TOM-CC isolato. (E) Struttura cristallina (PDB, 1OPF) e (F) SDS-PAGE di E. coli purificato OmpF. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 2: Diagramma di flusso dell'assemblaggio della camera in PMMA. Fase 1: Un vetrino di copertura è rivestito con un idrogel di agarosio. Fase 2: Il coprislip rivestito di spin è montato in una camera di microscopia PMMA personalizzata. Fase 3: L'ulteriore agarosio a basso punto di fusione viene aggiunto nella porta di ingresso della camera PMMA su una piastra calda a 35 °C. Fase 4: I monostrati lipidici si formano attorno alle goccioline acquose in un'interfaccia tampone/olio (a sinistra) e sull'interfaccia idrogel/olio di agarosio (a destra). Fase 5: Le singole goccioline acquose vengono pipettate nei pozzetti della camera PMMA per formare un doppio strato lipidico al contatto dei due monostrati lipidici. Fase 6: La formazione delle membrane DIB è convalidata dalla microscopia a contrasto a modulazione di Hofmann. Fase 7: Le immagini delle aree selezionate delle membrane DIB con canali ionici inseriti vengono acquisite mediante microscopia TIRF. Verde: 0,75% agarosio; giallo: 2,5% agarosio contenente ioni Ca2+ ; magenta: fase lipidica/oleosa; blu scuro: tampone acquoso contenente colorante e proteine sensibili al Ca2+. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 3: Setup sperimentale. (A) Rappresentazione schematica di una membrana DIB in un pozzetto PMMA. Il doppio strato poggia su un film di agarosio ultrasottile allo 0,75% per consentire l'imaging TIRF del flusso di Ca 2+ attraverso un canale ionico nel tempo utilizzando un colorante di fluorescenza sensibile al Ca2+ (Fluo-8) in trans. (B) Il flusso Ca2+ è controllato esclusivamente dalla pressione osmotica da cis a trans. Ciò consente sia la determinazione della posizione nella membrana che lo stato aperto-chiuso del canale. Il canale mostrato qui è il canale conduttore proteico TOM-CC dei mitocondri di N. crassa 30. (C) Traiettoria di un singolo canale TOM-CC. Verde: canale mobile; giallo: canale non mobile. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 4: Imaging di TOM-CC e OmpF nelle membrane DIB . (A) Membrana DIB ripresa mediante microscopia a contrasto a modulazione di Hoffmann che mostra l'area di contatto a doppio strato tra l'idrogel e la goccia. (B) Membrana DIB rotta ripresa come in (A). Freccia, bordo della camera in PMMA. (C) Membrana DIB ripresa mediante microscopia TIRF senza canali proteici. (D) Membrana DIB con TOM-CC ricostituito, ripresa mediante microscopia TIRF. I quadrati bianchi segnano punti di alta (SH), intermedia (SI) e bassa (SL) intensità. (E) L'adattamento del profilo di intensità di fluorescenza dei tre punti contrassegnati in (A) alle funzioni gaussiane bidimensionali rivela la posizione dei singoli TOM-CC e il flusso Ca2+ attraverso il canale. (F) Membrana DIB con OmpF ricostituito. (G) Adattamento gaussiano dello spot fluorescente contrassegnato in (F). In contrasto con il complesso proteico a due pori β barile TOM-CC, l'OmpF a tre pori β barile rivela solo uno stato di permeabilità. Dimensione pixel, 0,16 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figura 5: L'attività del canale è correlata alla mobilità laterale di TOM-CC. (A) La traccia di ampiezza fluorescente (in alto) e la traiettoria corrispondente (in basso) di TOM-CC indicano che l'attività del canale aperto-chiuso di TOM-CC è correlata alla mobilità laterale della membrana del complesso. La traiettoria visualizza tre stati di permeabilità. Verde: stato completamente aperto; giallo: stato di permeabilità intermedio; rosso: stato del canale chiuso; stella rossa: TOM-CC nello stato intermedio oscilla intorno alla sua posizione media di circa ±60 nm. Le precisioni posizionali37 basate sui segnali di fluorescenza negli stati completamente aperto e intermedio variano tra 5 nm e 10 nm. (B) Traccia di ampiezza fluorescente (in alto) e traiettoria corrispondente (in basso) di OmpF. OmpF rivela solo un livello di intensità, indipendentemente dal fatto che sia in movimento o intrappolato. I segmenti di traiettoria corrispondenti ai periodi di tempo delle molecole intrappolate sono contrassegnati in grigio. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Tabella 1: Soluzioni tampone per l'isolamento TOM-CC.

Tabella 2: Soluzioni tampone per l'isolamento di OmpF.

Non dichiariamo conflitti di interesse.