Articolo metodologico

Approcci basati sulla spettrometria di massa per l'analisi della struttura di ordine superiore delle proteine

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DOI:

10.3791/64979

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3 marzo 2023

 , 
1Biologics Development, Bristol Myers Squibb, 2Eli Lilly and Company

In questo articolo

Abstract

ARTICOLI DISCUSSI:

Espino, J. A., Jones, L. M. Impronta proteica del radicale ossidrilico in vivo per lo studio delle interazioni proteiche in Caenorhabditis elegans. Giornale degli esperimenti visualizzati. (158), E60910 (2020).

Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Caratterizzazione delle proteine cellulari con ossidazione fotochimica rapida delle proteine all'interno della cellula. Giornale degli esperimenti visualizzati. (157), E60911 (2020).

Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Approcci spettrometrici di massa per studiare la struttura e le interazioni delle proteine nelle polveri liofilizzate. Giornale degli esperimenti visualizzati. (98), E52503 (2015).

Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. Una piattaforma di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) per lo studio di enzimi biosintetici peptidici. Giornale degli esperimenti visualizzati. (159), E61053 (2020).

Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Marcatura covalente con dietilpirocarbonato per lo studio della struttura delle proteine di ordine superiore mediante spettrometria di massa. Giornale degli esperimenti visualizzati. (172), E61983 (2021).

Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Incubatore a piattaforma con tavolino XY mobile: Una nuova piattaforma per l'implementazione dell'ossidazione fotochimica rapida delle proteine all'interno della cellula. Giornale degli esperimenti visualizzati. (171), E62153 (2021).

Haupt, C. et al. Combinazione di reticolazione chimica e spettrometria di massa di complessi proteici intatti per studiare l'architettura di assemblaggi proteici multi-subunità. Giornale degli esperimenti visualizzati. (129), E56747 (2017).

Lento, C. et al. Spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio con ionizzazione elettrospray risolta nel tempo per lo studio della struttura e della dinamica delle proteine. Giornale degli esperimenti visualizzati. (122), e55464 (2017).

Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Impronta proteica di radicali ossidrilici senza laser per eseguire analisi strutturali di ordine superiore delle proteine. Giornale degli esperimenti visualizzati. (172), E61861 (2021).

Misra, S. K., Sharp, J. S. Abilitazione della compensazione in tempo reale nelle ossidazioni fotochimiche veloci delle proteine per la determinazione dei cambiamenti della topografia delle proteine. Giornale degli esperimenti visualizzati. (163), E61580 (2020).

Chaihu, L. et al. Scambio idrogeno/deuterio basato su elettroforesi capillare per la caratterizzazione conformazionale di proteine con spettrometria di massa top-down. Giornale degli esperimenti visualizzati. (172), E62672 (2021).

Editoriale

La struttura di ordine superiore (HOS) è un aspetto importante della caratterizzazione delle proteine in quanto è strettamente correlata alla funzione delle proteine. La spettrometria di massa (MS) è uno dei metodi chiave per valutare la proteina HOS1. Sebbene gli approcci basati sulla MS non siano in grado di risolvere la struttura della proteina con risoluzione atomica, presentano i vantaggi di una risoluzione spaziale medio-alta, un'elevata specificità, bassi requisiti di quantità di campioni, un elevato rendimento e capacità proteomiche.

Gli approcci di impronta proteica basati sulla MS valutano la proteina HOS analizzando la superficie accessibile al solvente della proteina e sono solitamente abbinati a diversi approcci di marcatura chimica. La marcatura reversibile, ad esempio mediante scambio idrogeno-deuterio (HDX), prende di mira gli idrogeni dell'ammide principale nella proteina 1,2. L'etichettatura irreversibile utilizza sostanze chimiche che prendono di mira specifici residui di amminoacidi3 o radicali che marcano una varietà di residui diversi con una maggiore velocità di reazione1. Anche la reticolazione chimica fa parte della categoria delle marcature irreversibili, ma la sua caratteristica bivalente consente la determinazione dei vincoli spaziali tra due siti reticolati, il che offre intuizioni topologiche uniche 4,5. Tutti questi approcci possono essere combinati per formare una "cassetta degli attrezzi", rendendo la MS uno strumento prezioso per chiarire la proteina HOS.

Abbiamo organizzato questa raccolta di metodi per presentare i recenti progressi nel campo dell'analisi dell'HOS proteica basata sulla MS. La prima serie di articoli presenta approcci basati su HDX. Habibi e Thibodeaux6 descrivono un approccio HDX-MS continuo dal basso verso l'alto relativamente classico. Con lo scambio idrogeno-deuterio (H/D) in soluzione a più tempi di scambio seguito dalla digestione della pepsina in colonna, il livello di assorbimento del deuterio può essere determinato a livello del peptide. Quando si eseguono esperimenti differenziali (cioè stati legati e non legati), i peptidi che mostrano livelli di assorbimento di deuterio aumentati o diminuiti rappresentano aree che subiscono cambiamenti nell'HOS. Gli autori utilizzano lanthipeptide sintetasi per dimostrare bene il flusso di lavoro HDX-MS.

Oltre all'approccio bottom-up, l'HDX-MS può anche essere eseguita in modo top-down, consentendo agli analisti di applicare diverse strategie di separazione a livello di proteina intatta. Chaihu et al.7 utilizzano l'elettroforesi capillare per separare diversi stati proteici o proteoforme che coesistono nella soluzione. Le proteine subiscono lo scambio H/D durante l'elettroforesi mentre migrano nel capillare nella soluzione elettrolitica di fondo deuterata, e questo è seguito dall'analisi MS top-down e dalle frammentazioni in fase gassosa per valutare i livelli di assorbimento del deuterio sia a livello globale che a livello di frammento. Infine, ci sono anche altri due metodi in questa collezione che evidenziano diversi metodi di scambio H/D, vale a dire lo scambio per potenza liofilizzata8 e lo scambio dopo ionizzazione elettrospray9.

Il secondo gruppo di articoli riguarda il metodo di etichettatura irreversibile. Tra questi, l'ossidazione fotochimica rapida delle proteine (FPOP) utilizza i radicali come specie marcatrici per marcare la superficie della proteina10,11. In pratica, il perossido di idrogeno viene fotoattivato attraverso un laser per produrre radicali ossidrilici, che fungono da specie di marcatura attiva. Misra e Sharp12 presentano una strategia per la dosimetria radicalica in cui l'adenina viene utilizzata come reporter per la concentrazione di radicali e un sistema di dosimetria radicalica in linea viene utilizzato per monitorare la risposta dell'adenina. Ciò consente la compensazione in tempo reale delle concentrazioni di radicali ossidrilici e, quindi, la normalizzazione delle condizioni di reazione per fornire una lettura accurata. Successivamente, Weinberger e Chea hanno collaborato con il gruppo Sharp per sviluppare una piattaforma FPOP13 senza laser. Sostituendo il pericoloso laser con una sorgente di luce al plasma e combinandolo con la dosimetria radicalica in linea e un sistema automatizzato di raccolta dei campioni, sviluppano e forniscono una soluzione integrata per i ricercatori che devono caratterizzare la proteina HOS.

I tre articoli del gruppo di Jones 14,15,16 esplorano la possibilità di portare FPOP e l'impronta proteica negli studi in vivo. Il vantaggio di questo approccio è senza precedenti, in quanto consente di analizzare la proteina HOS nell'ambiente nativo. L'applicazione di successo dell'impronta nelle cellule14 e in Caenorhabditis elegans15 apre nuove possibilità per tracciare l'HOS dell'intero proteoma nel suo stato nativo, consentendo così una profonda comprensione della proteina HOS che non può essere raggiunta attraverso altri strumenti.

Un altro importante metodo di marcatura irreversibile utilizza reagenti chimici che mirano a specifici residui di aminoacidi3. Kirsch et al.17 riportano un flusso di lavoro ben utilizzato per l'impronta proteica attraverso la marcatura covalente. Utilizzando il dietilpirocarbonato come reagente di marcatura, gli autori sondano i cambiamenti nella proteina HOS etichettando alcuni tipi di residui di amminoacidi sulla superficie della proteina. Attraverso esperimenti differenziali seguiti da digestione proteolitica e analisi MS bottom-up, il flusso di lavoro consente l'identificazione di cambiamenti nell'accessibilità dei solventi, che sono direttamente correlati ai cambiamenti di HOS.

Infine, la reticolazione chimica è un altro approccio importante che utilizza reagenti chimici bivalenti per marcare le proteine 4,5. I reticolanti chimici vengono utilizzati per reticolare due proteine che sono spazialmente vicine l'una all'altra e, spesso, formano un complesso strutturale. Haupt et al.18 riportano un protocollo in cui dimostrano l'uso di cross-linker chimici per comprendere l'architettura dei complessi proteici. Il complesso proteico reticolato può essere analizzato a due diversi livelli. Attraverso la digestione proteolitica seguita dall'identificazione della MS, i dipeptidi reticolati rivelano i siti di interazione del complesso proteico. Quando si analizza il campione reticolato attraverso la massa intatta, le informazioni stechiometriche sulle subunità proteiche all'interno del complesso sono prontamente disponibili.

Per riassumere, negli ultimi tre decenni abbiamo assistito a uno sviluppo sostanziale degli strumenti basati sulla MS per l'analisi dell'HOS proteico. L'impronta irreversibile e reversibile accoppiate con l'analisi MS si completano a vicenda e insieme contribuiscono in modo significativo alla caratterizzazione della proteina HOS. I lavori inclusi in questa raccolta di metodi rappresentano metodi all'avanguardia nel campo dell'analisi dell'HOS proteica basata sulla MS; questi studi sono una risorsa preziosa per i ricercatori che stanno cercando di utilizzare approcci basati sulla SM per rispondere a domande critiche. Da una prospettiva più ampia, l'incorporazione dei dati di footprinting nelle previsioni strutturali è fondamentale per superare il limite della risoluzione spaziale nei metodi basati sulla MS. Esistono lavori pionieristici che dimostrano la fattibilità di un tale approccio19,20. Inoltre, anche l'integrazione della piattaforma è fondamentale, poiché questi approcci sono complementari tra loro e forniscono approfondimenti da prospettive diverse21,22. I metodi riportati in questa raccolta dimostrano la potenza di tale integrazione, e ci sarà uno sviluppo continuo in questa direzione. Con tutti questi progressi, l'approccio basato sulla SM è cresciuto oltre la determinazione del peso molecolare e si assisterà a una crescita continua in questo campo nei prossimi decenni.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Gli autori non hanno riconoscimenti.

Riferimenti

  1. Liu, X. R., Zhang, M. M., Gross, M. L. Mass spectrometry-based protein footprinting for higher-order structure analysis: Fundamentals and applications. Chemical Reviews. 120 (10), 4355-4454 (2020).
  2. Konermann, L., Pan, J., Liu, Y. -H. Hydrogen exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Chemical Society Reviews. 40 (3), 1224-1234 (2011).
  3. Mendoza, V. L., Vachet, R. W. Probing protein structure by amino acid-specific covalent labeling and mass spectrometry. Mass Spectrometry Reviews. 28 (5), 785-815 (2009).
  4. Sinz, A. Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein–protein interactions. Mass Spectrometry Reviews. 25 (4), 663-682 (2006).
  5. Leitner, A. Cross-linking and other structural proteomics techniques: How chemistry is enabling mass spectrometry applications in structural biology. Chemical Science. 7 (8), 4792-4803 (2016).
  6. Habibi, Y., Thibodeaux, C. J. A hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS) platform for investigating peptide biosynthetic enzymes. Journal of Visualized Experiments. (159), e61053(2020).
  7. Chaihu, L., et al. Capillary electrophoresis-based hydrogen/deuterium exchange for conformational characterization of proteins with top-down mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e62672(2021).
  8. Moorthy, B. S., Iyer, L. K., Topp, E. M. Mass spectrometric approaches to study protein structure and interactions in lyophilized powders. Journal of Visualized Experiments. (98), e52503(2015).
  9. Lento, C., et al. Time-resolved electrospray ionization hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry for studying protein structure and dynamics. Journal of Visualized Experiments. (122), e55464(2017).
  10. Xu, G., Chance, M. R. Hydroxyl radical-mediated modification of proteins as probes for structural proteomics. Chemical Reviews. 107 (8), 3514-3543 (2007).
  11. Li, K. S., Shi, L., Gross, M. L. Mass spectrometry-based fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) for higher order structure characterization. Accounts of Chemical Research. 51 (3), 736-744 (2018).
  12. Misra, S. K., Sharp, J. S. Enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61580(2020).
  13. Weinberger, S. R., Chea, E. E., Sharp, J. S., Misra, S. K. Laser-free hydroxyl radical protein footprinting to perform higher order structural analysis of proteins. Journal of Visualized Experiments. (172), e61861(2021).
  14. Chea, E. E., Rinas, A., Espino, J. A., Jones, L. M. Characterizing cellular proteins with in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (157), e60911(2020).
  15. Espino, J. A., Jones, L. M. In vivo hydroxyl radical protein footprinting for the study of protein interactions in Caenorhabditis elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e60910(2020).
  16. Johnson, D., Punshon-Smith, B., Espino, J. A., Gershenson, A., Jones, L. M. Platform incubator with movable XY stage: A new platform for implementing in-cell fast photochemical oxidation of proteins. Journal of Visualized Experiments. (171), e62153(2021).
  17. Kirsch, Z. J., Arden, B. G., Vachet, R. W., Limpikirati, P. Covalent labeling with diethylpyrocarbonate for studying protein higher-order structure by mass spectrometry. Journal of Visualized Experiments. (172), e61983(2021).
  18. Haupt, C., et al. Combining chemical cross-linking and mass spectrometry of intact protein complexes to study the architecture of multi-subunit protein assemblies. Journal of Visualized Experiments. (129), e56747(2017).
  19. Biehn, S. E., Lindert, S. Accurate protein structure prediction with hydroxyl radical protein footprinting data. Nature Communications. 12 (1), 341(2021).
  20. Biehn, S. E., Lindert, S. Protein structure prediction with mass spectrometry data. Annual Review of Physical Chemistry. 73, 1-19 (2022).
  21. Zhang, M. M., et al. Epitope and paratope mapping of PD-1/nivolumab by mass spectrometry-based hydrogen-deuterium exchange, cross-linking, and molecular docking. Analytical Chemistry. 92 (13), 9086-9094 (2020).
  22. Zhang, M. M., et al. An integrated approach for determining a protein–protein binding interface in solution and an evaluation of hydrogen–deuterium exchange kinetics for adjudicating candidate docking models. Analytical Chemistry. 91 (24), 15709-15717 (2019).

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Protein InteractionsHydroxyl Radical FootprintingPhotochemical OxidationHydrogen-deuterium ExchangeCovalent LabelingProtein AnalysisElectrospray IonizationChemical Cross-linkingMulti-subunit AssembliesConformational Characterization
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