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Le interazioni biomolecolari sono attori chiave nei processi biologici e quindi un aspetto di fondamentale importanza delle scienze della vita. Le tecniche di fluorescenza sono diventate alcuni dei metodi più potenti e ampiamente applicati per studiare e comprendere questi processi. Gli approcci di fluorescenza in vitro offrono il potenziale per il rilevamento in tempo reale di interazioni molecolari extracellulari e intracellulari, il che costituisce un grande vantaggio rispetto ad altri approcci. Questo è stato utilizzato per una varietà di interazioni proteina-proteina, proteina-acido nucleico e proteina-membrana, che svolgono un ruolo cruciale nella regolazione dei processi cellulari.
Questa raccolta offre una panoramica di varie tecniche e applicazioni basate sulla fluorescenza per lo studio delle interazioni biomolecolari e amplia la nostra comprensione dei processi cellulari.
Reiser et al.1 descrivono un metodo ad alto rendimento per analizzare la cinetica cellulare da singole cellule tramite l'acquisizione e l'elaborazione automatizzata di immagini (Live Cell Imaging on Single Cell Arrays [LISCA]). Utilizzando questa tecnica, i reporter fluorescenti forniscono una lettura risolta nel tempo di vari processi biologici indipendenti come l'espressione genica di una singola cellula dopo la trasfezione, la risposta cellulare nelle cascate di segnalazione, gli eventi apoptotici o la differenziazione delle cellule staminali. Gli autori eseguono l'imaging in array di cellule isolate utilizzando la microscopia time-lapse a scansione, portando a centinaia di traiettorie di singole cellule e dati sufficienti per l'analisi statistica. Le tracce temporali di fluorescenza di singole cellule aiuteranno i ricercatori a comprendere meglio i meccanismi di consegna genica e a risolvere l'eterogeneità cellulare, un segno distintivo dei sistemi biologici complessi normalmente dettati da fluttuazioni intrinseche.
Konate et al.2 riportano un metodo biofisico per caratterizzare l'interazione, la perturbazione e/o la permeabilizzazione dei peptidi che interagiscono con la membrana. Nel loro protocollo, descrivono con precisione i diversi passaggi per formulare e purificare i liposomi e per caratterizzare la perdita di fluorescenza. Il metodo viene applicato con un peptide penetrante nelle cellule (CPP) chiamato WRAP in associazione con un piccolo RNA interferente (siRNA) o combinato con un potente peptide terapeutico (iCAL36) e viene confrontato con il noto CPP, la penetratina. Questa tecnica presenta molteplici vantaggi. È veloce e semplice da implementare. Consente uno stretto controllo della composizione della membrana lipidica per imitare diversi tipi di membrane cellulari. I fluorofori possono essere adattati a seconda del peptide di interesse e delle sue proprietà di perdita della membrana. Infine, il campione è estremamente stabile dopo la preparazione. La versatilità della tecnica la rende un approccio utile per sondare varie questioni biologiche riguardanti il danno cellulare o la somministrazione di farmaci.
La presenza di fosfatidilserina (PS) nelle membrane cellulari dei mammiferi è importante in diversi processi di segnalazione come l'apoptosi cellulare o nel reclutamento di proteine per la riparazione della membrana. Il trasferimento e i cambiamenti nella distribuzione del PS sulla superficie delle membrane plasmatiche sono una questione chiave che Ikhlef et al.3 affrontano con il loro articolo. Descrivono un protocollo per misurare in tempo reale il trasporto e lo scambio di lipidi PS e PI-4-P da parte della proteina di lievito ricombinante Osh6p. Il metodo utilizza sensori fluorescenti per rilevare se una proteina di trasferimento lipidico (LTP) estrae o trasferisce lipidi in membrane artificiali lungo un gradiente tra le vescicole lipidiche. Questo protocollo consente di lavorare con lipidi non marcati per consentire il corretto legame dei lipidi all'LTP. Inoltre, si ottiene una migliore risoluzione temporale rispetto ai metodi convenzionali, come i saggi basati sulla radioattività o la spettrometria di massa. Questo metodo aiuterà i ricercatori a comprendere meglio l'estrazione e lo scambio di lipidi tra diversi organelli e membrane.
Il trasferimento di energia per risonanza di Förster (FRET) è un potente metodo per studiare i sistemi biomolecolari. Questa tecnica può essere applicata a singole molecole (ad esempio, smFRET) e consente la misura di distanze assolute all'interno di biomolecole. Abdelhamid et al.4 presentano un protocollo passo-passo su come eseguire smfBox, una configurazione confocale recentemente sviluppata in grado di misurare l'efficienza FRET tra due coloranti su singole molecole a diffusione libera. Mostrano come implementare e utilizzare la tecnica smFRET dalla preparazione del campione alla configurazione dello strumento, all'allineamento, all'acquisizione dei dati e all'analisi. Inoltre, descrivono come determinare i fattori di correzione necessari per misurazioni accurate della distanza derivate da FRET. In questo caso, il metodo viene applicato a duplex di DNA a diffusione libera e può essere esteso a un'ampia gamma di applicazioni, come lo studio dei cambiamenti conformazionali delle proteine o delle interazioni proteina-DNA.
I processi biologici coinvolgono interazioni biomolecolari molto diverse e numerose che lasciano ampio spazio per lo sviluppo di nuovi saggi o sensori basati sulla fluorescenza. Questa raccolta offre ai ricercatori una panoramica delle innovazioni e degli sviluppi nei metodi basati sulla fluorescenza. Ogni articolo fa luce su un diverso metodo basato sulla fluorescenza, evidenziando quanto siano diventati importanti e versatili i saggi fluorescenti. La raccolta descrive questi metodi e quindi incoraggia l'uso diffuso di essi tra diversi gruppi e aree di ricerca.