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Storicamente, gli scienziati hanno fatto molto affidamento sugli studi sugli animali per determinare se un prodotto medico (ad esempio, un farmaco o un dispositivo medico) è sicuro prima di testarlo sull'uomo. Sebbene la sperimentazione animale sia ancora giustificata in molte situazioni, trovare alternative è altamente auspicabile. Con i recenti progressi della scienza e dell'ingegneria, lo sviluppo di alternative alla sperimentazione animale è più fattibile che mai. Una rinnovata attenzione allo sviluppo di metodi alternativi in vitro per la valutazione della sicurezza cardiaca è almeno in parte attribuibile ai progressi nella tecnologia delle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Le cellule cardiache umane possono essere generate in laboratorio utilizzando un semplice campione di sangue o di pelle di un paziente, producendo cardiomiociti derivati da cellule staminali pluripotenti indotte umane (iPSC-CM) adatti per robusti test ad alto rendimento. Anche i progressi nella bioingegneria tissutale 3D, nelle tecnologie di array di microelettrodi, nell'imaging di cellule vive e in altre tecnologie sono stati determinanti per lo sviluppo dei protocolli inclusi in questa raccolta.
Il protocollo di Gerges et al.1 applica un metodo ottico non invasivo (MyoBLAZER) per valutare i cambiamenti di contrattilità nei cardiomiociti ventricolari primari umani adulti. Le celle sono a ritmo elettrico e l'analisi delle immagini misura l'accorciamento dei sarcomi su più celle in parallelo. Questo metodo è in grado di raccogliere curve concentrazione-risposta ogni 30 minuti per composto per dispositivo e fornisce dati sulla relazione struttura-attività. Questo metodo ottico non invasivo aiuta a preservare la fisiologia e la farmacologia dei cardiomiociti umani adulti durante lo screening ad alto rendimento. Inoltre, l'uso di cardiomiociti adulti umani può fornire un elemento traslazionale fondamentale per prevedere la contrattilità.
La metodologia di Lickiss et al.2 presenta una tecnologia ibrida di contrattilità e impedenza/potenziale di campo extracellulare (EFP), che aggiunge significative caratteristiche di pro-maturazione a una piattaforma standard industriale a 96 pozzetti utilizzando un substrato di coltura cellulare morbido, flessibile e a base di silicio. L'approccio si è dimostrato efficace ristabilendo la risposta inotropa fisiologica positiva all'isoproterenolo nelle hiPSC-CM sane disponibili in commercio, che è consapevolmente assente nella coltura standard (substrato rigido) senza la necessità di un sistema 3D. Il sistema ibrido consente la misurazione diretta della forza di contrazione (mN/mm2), della frequenza di battimento, nonché della densità e dell'integrità del monostrato di celle. Affronta anche le sfide di un sistema 3D tradizionale (ad esempio, bassa produttività, notevoli esigenze di formazione), riducendo il tempo e i costi necessari per completare il saggio.
La collezione include anche il lavoro di Feaster et al.3, che dimostrano un metodo in vitro, ad alto rendimento e non invasivo per valutare la terapia di modulazione della contrattilità cardiaca (CCM) in cardiomiociti di cellule staminali umane 2D piastrati su un materasso Matrigel flessibile, utilizzando la microscopia basata su video senza sonda. Gli autori evidenziano gli effetti acuti della CCM sulle proprietà contrattili delle hiPSC-CM sane e malate. Questo strumento offre un metodo a basso costo per comprendere la sicurezza o l'efficacia dei CCM e potrebbe ridurre la dipendenza dagli studi sugli animali e assistere nel processo decisionale normativo dei dispositivi medici di elettrofisiologia cardiaca.
Il protocollo perfezionato di Schaefer et al.4 descrive una nuova estensione del sistema standard di array di microelettrodi (MEA) che normalmente registra il potenziale di campo extracellulare nelle hiPSC-CM, consentendo registrazioni del potenziale d'azione intracellulare aprendo le membrane cellulari con impulsi di raggio laser di nanosecondi. Questo dispositivo non solo include i vantaggi standard della MEA (ad esempio, monitoraggio della propagazione del segnale, esperimenti acuti e cronici), ma consente anche di comprendere la forma del potenziale d'azione intracellulare senza l'uso di forti impulsi di campo elettrico per l'elettroporazione cellulare.
Il protocollo di Berry et al.5 descrive una nuova piattaforma che consente la fabbricazione riproducibile di tessuti muscolari ingegnerizzati in 3D (EMT) per misurazioni dirette della forza di contrattilità. Lo strumento è in grado di rilevare le variazioni di micronewton nella forza di contrattilità, rendendolo così un potente strumento per lo screening dei composti dose-dipendenti. La contrattilità nel tessuto cardiaco basato su hiPSC, così come nei tessuti muscolari scheletrici, può essere registrata in un massimo di 24 tessuti contemporaneamente e i dati possono essere analizzati longitudinalmente per settimane o mesi. Pertanto, per i ricercatori sono necessarie competenze o formazione aggiuntive minime.
Infine, la pubblicazione di Zhao et al.6 descrive una serie di saggi funzionali (potenziale di campo extracellulare, potenziale d'azione, contrattilità e calcio) ottimizzati per l'uso con cardiomiociti che possono essere generati internamente dai laboratori degli utenti. Questo può essere fatto utilizzando protocolli di differenziazione precedentemente pubblicati e iPSC disponibili presso la Stanford University Cardiovascular Institute Biobank (https://med.stanford.edu/scvibiobank/request-cells.html), fornendo un'ampia gamma di cellule "malate" e di controllo. Si tratta di un set completo di metodi per le principali registrazioni di contrattilità cardiaca ed elettrofisiologia, inclusi approcci standard (patch clamp, array di microelettrodi, sonde di fluorescenza sensibili al calcio e misure di contrattilità basate su video).
In conclusione, sebbene l'attuale raccolta di metodi non pretenda di essere completa (e continui a crescere), è già un insieme relativamente completo di metodi che illustrano molte sfide attuali nella contrattilità e nelle registrazioni elettrofisiologiche nei cardiomiociti umani. Include protocolli per cardiomiociti umani primari1, hiPSC-CM disponibili in commercio derivati da donatori sani 2,3,4, nonché protocolli ottimizzati per cellule portatrici di una firma di cardiopatia congenita 3,6. Questi metodi si estendono a varie condizioni di coltura cellulare, dalle singole cellule per esperimenti di patch clamp6, ai convenzionali monostrati 2D hiPSC-CM su substrati rigidi 1,4, ai monostrati di cardiomiociti 2D su substrati morbidi e flessibili 2,3 e, infine, ai tessuti cardiaci ingegnerizzati in 3D5. Le metodiche incluse utilizzano diversi approcci per la registrazione dei parametri di fisiologia cardiaca più rilevanti, come la contrattilità (misurata indirettamente con saggi basati su video 1,3,6 o direttamente con forza contrattile 2,5), il potenziale d'azione (in una singola cellula utilizzando patch clamp6, un potenziale di campo extracellulare surrogato con un MEA 4,6, o utilizzando un nuovo approccio per porare le cellule per registrare registrazioni simili al potenziale d'azione con il sistema MEA standard4) e transitori di calcio (utilizzando sonde sensibili al calcio6). Nel loro insieme, questi metodi forniscono non solo protocolli dettagliati che possono essere riprodotti in altri laboratori, ma illustrano anche alcune delle sfide con i metodi cardiaci in vitro umani, come ad esempio: immaturità hiPSC-CM, specialmente quando si utilizza una coltura 2D standard su substrato rigido; effetti indesiderati di sonde fluorescenti sensibili alla tensione o al calcio; bassa produttività delle registrazioni convenzionali del potenziale d'azione; difficoltà nell'interpretazione delle registrazioni della durata del potenziale di campo standard; e mancanza di saggi per la valutazione dei dispositivi medici (ad esempio, rispetto ai farmaci). È stimolante vedere quanti laboratori stanno lavorando per migliorare questi metodi, il che porterà inevitabilmente a un ampio adattamento di questi metodi in futuro.