Articolo metodologico

Valutazione dei livelli di autofagia in due diversi modelli di cellule pancreatiche utilizzando l'immunofluorescenza LC3

DOI:

10.3791/65005

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28 aprile 2023

 ,  ,  ,  , 
1Instituto de Bioquimica y Medicina Molecular Prof Alberto Boveris (IBIMOL), Universidad de Buenos Aires, CONICET, 2Signalling Programme, The Babraham Institute

In questo articolo

Sommario

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L'obiettivo di questo protocollo è determinare i livelli autofagici nel cancro del pancreas e nelle cellule acinose pancreatiche attraverso l'immunofluorescenza LC3 e la quantificazione dei punti LC3.

Abstract

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L'autofagia è un processo catabolico specializzato che degrada selettivamente i componenti citoplasmatici, comprese le proteine e gli organelli danneggiati. L'autofagia consente alle cellule di rispondere fisiologicamente agli stimoli di stress e, quindi, mantenere l'omeostasi cellulare. Le cellule tumorali potrebbero modulare i loro livelli di autofagia per adattarsi a condizioni avverse come ipossia, carenza di nutrienti o danni causati dalla chemioterapia. L'adenocarcinoma pancreatico duttale è uno dei tipi più mortali di cancro. Le cellule tumorali pancreatiche hanno un'elevata attività autofagica a causa della sovraregolazione trascrizionale e dell'attivazione post-traduzionale delle proteine dell'autofagia.

Qui, la linea cellulare PANC-1 è stata utilizzata come modello di cellule tumorali umane pancreatiche e la linea cellulare acinosa pancreatica AR42J è stata utilizzata come modello fisiologico di cellule di mammifero altamente differenziate. Questo studio ha utilizzato l'immunofluorescenza della catena leggera 3 (LC3) della proteina associata ai microtubuli come indicatore dello stato di attivazione dell'autofagia. LC3 è una proteina autofagica che, in condizioni basali, mostra un modello diffuso di distribuzione nel citoplasma (noto come LC3-I in questa condizione). L'induzione dell'autofagia innesca la coniugazione di LC3 alla fosfatidiletanolammina sulla superficie degli autofagosomi appena formati per formare LC3-II, una proteina legata alla membrana che aiuta nella formazione e nell'espansione degli autofagosomi. Per quantificare il numero di strutture autofagiche etichettate, il software open source FIJI è stato utilizzato con l'aiuto dello strumento "3D Objects Counter".

La misura dei livelli autofagici sia in condizioni fisiologiche che nelle cellule tumorali ci permette di studiare la modulazione dell'autofagia in diverse condizioni come l'ipossia, il trattamento chemioterapico o l'abbattimento di alcune proteine.

Introduzione

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La macroautofagia (comunemente indicata come autofagia) è un processo catabolico specializzato che degrada selettivamente i componenti citoplasmatici, comprese le proteine e gli organelli danneggiati 1,2. L'autofagia consente alle cellule di rispondere fisiologicamente agli stimoli di stress e, quindi, mantenere l'omeostasi cellulare3. Durante l'autofagia, si forma una doppia vescicola di membrana: l'autofagosoma. L'autofagosoma contiene le molecole di carico e le guida al lisosoma per la degradazione 1,4.

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Protocollo

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1. Preparazione delle cellule

  1. Immergere i coperchi rotondi da 12 mm in etanolo assoluto e posizionarli verticalmente nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti.
  2. Rimuovere il coperchio ed esporre la piastra multipozzetto alle radiazioni ultraviolette per 15 minuti.
  3. Posizionare i coprivetrini orizzontalmente e lavarli con Modified Eagle Medium (DMEM) di Dulbecco.
  4. Semina un basso numero di cellule pancreatiche. L'importo deve essere adeguato per ottenere una confluenza del 50% -75% il giorno della fissazione16.
    NOTA: Si consiglia di seminare 2,5 × 10 4 PANC-1 o 4 × 104 cellule A....

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Risultati

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Questo protocollo esegue l'immunofluorescenza di CL3 in linee cellulari pancreatiche per determinare i livelli di autofagia in diverse condizioni. Il risultato di questo esperimento è stato l'ottenimento di immagini cellulari dai canali rosso e blu, corrispondenti a LC3 e DAPI. Le immagini LC3 indicano la distribuzione cellulare di questa proteina, mentre il DAPI mostra la localizzazione nucleare. La Figura 2A mostra un'immagine rappresentativa dell'immunofluorescenza di LC3 e della sua fusi.......

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Discussione

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Il metodo descritto in questo protocollo consente di visualizzare la distribuzione endogena di LC3 nella cellula e quantificare i livelli autofagici in diverse condizioni. Un altro metodo simile utilizzato per analizzare la distribuzione di LC3 e determinare l'attivazione dell'autofagia coinvolge la trasfezione LC3 marcata con fluorescenza (come RFP-LC3)19. La trasfezione RFP-LC3 ha il vantaggio di non aver bisogno di fissazione (che consente di applicare questo metodo nell'imaging di cellule vive.......

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Dichiarazioni

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Non sono stati dichiarati conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dell'Università di Buenos Aires (UBACyT 2018-2020 20020170100082BA), del Consiglio nazionale per la ricerca scientifica e la tecnologia (CONICET) (PIP 2021-2023 GI− 11220200101549CO; e PUE 22920170100033) e dell'Agenzia nazionale per la promozione scientifica e tecnologica (PICT 2019-01664).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)Corning46-013-CM
12 mm vetrini coprioggetti rotondiHDACBR_OBJ_6467
24 pozzetti Piastra per colture cellulariSorfa220300
Etanolo assolutoBiopack2207.10.00
Alexa Fluor 594 IgG anti-coniglio d'asino (H+L)InvitrogenR37119
Microscopio a scansione laser confocaleZeissLSM 800
DesametasoneSigma AldrichD4902
DMENSartorius01-052-1A
Siero fetale bovinoNATOCOR Lintc-634
GemcitabinaEli LillyVL7502
LC3B (D11) XP Rabbit mAbCell Signaling Technology3868S
MetanoloAnedra6197
Parafilm "M" (Pellicola sigillante da laboratorio)Bemis/CurwoodPM-996
Pen-Strep SolutionSartorius03-031-1B
PP242Santa Cruz BiotechnologySC-301606
Tripsina EDTAGibco11570626

Riferimenti

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  1. Grasso, D., Renna, F. J., Vaccaro, M. I. Initial steps in mammalian autophagosome biogenesis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6, 146(2018).
  2. Galluzzi, L., et al. Molecular definitions of autophagy and related processes. EMBO Journal. 36<....

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Autophagy LevelsLC3 ImmunofluorescencePancreatic Cell ModelsPANC 1 CellsAR42J CellsGemcitabine TreatmentConfocal Microscopy3D Objects CounterMethanol FixationDAPI Staining

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