L'occhio contiene mezzi trasparenti privi di vasi sanguigni, tra cui la cornea, il cristallino e il vitreo. La luce deve passare attraverso questi mezzi prima di raggiungere i fotorecettori nella parte posteriore della retina. In particolare, la cornea, il cristallino e il vitreo sono privi di vasi sanguigni per evitare l'assorbimento della luce e la distorsione delle immagini1. I vasi sanguigni retinici sono organizzati in tre strati: lo strato superficiale, che si estende dal disco ottico alla periferia all'interno dello strato di fibre nervose; lo strato intermedio, che si trova all'interno dello strato plessiforme interno; e lo strato profondo, che è distribuito attraverso lo strato plessiforme esterno. Questa rete vascolare fornisce sangue alla retina interna, mentre i fotorecettori sono forniti per diffusione dai vasi sanguigni coroideali. Il nutrimento della retina interna ed esterna è strettamente controllato dalle barriere emato-retiniche interne ed esterne (BRB). Le cellule endoteliali retiniche, i periciti e le cellule gliali costituiscono il BRB interno. D'altra parte, le cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE), le cellule endoteliali coroideali e la membrana di Bruch formano il BRB esterno. I cambiamenti patologici nei vasi sanguigni retinici sono i segni distintivi di diverse malattie della retina, come la retinopatia diabetica, la degenerazione maculare legata all'età e la retinopatia del prematuro. Questi cambiamenti patologici includono, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, l'infiammazione vascolare, la rottura del BRB, la degenerazione capillare, i cambiamenti nel flusso sanguigno retinico e la neovascolarizzazione retinica patologica (RNV)2,3,4. Pertanto, è importante sviluppare metodi efficaci per studiare questi cambiamenti sia in vivo utilizzando animali da esperimento che in vitro coltivando varie cellule retiniche in condizioni simili all'ambiente biologico e biochimico nelle malattie umane. I ricercatori possono utilizzare diversi approcci sperimentali per sezionare i meccanismi molecolari e cellulari sottostanti alle malattie vascolari retiniche. L'obiettivo di questa raccolta di metodi è quello di condividere con altri ricercatori l'esperienza di scienziati della visione e oftalmologi in termini di metodi per studiare il normale sviluppo vascolare e le anomalie vascolari in varie malattie della retina.
L'articolo di Damsgaard et al. presenta un metodo ecografico a flusso potenziato che consente agli investigatori di visualizzare le vascolarizzazione dell'occhio in tre dimensioni senza l'uso di agenti di contrasto5. Questo metodo supera i limiti di altri metodi grazie alla sua stabilità nell'imaging dell'occhio dietro la retina pigmentata. Sebbene il metodo sia stato dimostrato nei pesci rossi, può essere applicato a tutte le altre specie sperimentali con globuli rossi nucleati. Questo metodo è prezioso per visualizzare i vasi sanguigni oculari in condizioni normali e patologiche e potrebbe essere utile nello studio del flusso sanguigno oculare. Tuttavia, questo metodo è limitato dalla mancanza di globuli rossi nucleati nei mammiferi. Pertanto, rispetto alle specie con globuli rossi nucleati, l'ecografia potenziata dal flusso produce solo un contrasto del flusso sanguigno nei mammiferi. Inoltre, questo metodo è sensibile al rumore del movimento, ad esempio quello dei movimenti respiratori, che possono creare immagini sfocate e artefatti. Questo rumore di movimento può essere regolato mediante gating prospettico o retrospettivo. Sia per le acquisizioni 2D che 3D, è fondamentale limitare gli artefatti di movimento causati dal movimento dell'animale a causa di un'anestesia inadeguata o di una configurazione instabile del trasduttore. Lo sviluppo di questa tecnica apre la strada all'esame non invasivo in vivo delle reti vascolari profonde nell'occhio nella stragrande maggioranza dei vertebrati che possiedono eritrociti nucleati.
Il metodo presentato da Macouzet-Romero et al. valuta il contributo relativo dei vasi retinici alla densità di perfusione maculare utilizzando la tomografia a coerenza ottica (OCT)-angiografia6. Questo metodo caratterizza la proporzione di un'area con circolazione da vasi dilatati. Da notare che la dilatazione vascolare può essere una risposta a condizioni patologiche. Questo approccio può delineare indirettamente la vasodilatazione e identificare indirettamente la bassa ossigenazione nelle malattie vascolari retiniche, come la retinopatia diabetica (DR), l'occlusione della vena centrale o la degenerazione maculare legata all'età (AMD). Utilizzando questo metodo, i principali risultati di Macouzet-Romero et al.6 sono stati che il contributo dei vasi più grandi dei capillari retinici alla circolazione retinica era del 18,2% nei soggetti sani. Pertanto, questa percentuale potrebbe essere utilizzata come riferimento per identificare i primi cambiamenti nella densità di perfusione dovuti a malattie vascolari retiniche. Ad esempio, il contributo percentuale è stato del 2,6% nei pazienti con ipertensione arteriosa e del 16,4% nei pazienti con diabete, suggerendo che questo metodo potrebbe potenzialmente essere utilizzato per valutare la progressione delle malattie retiniche associate ad anomalie vascolari.
Il metodo presentato da Subirada et al. valuta diversi parametri di alterazioni vascolari (l'entità della degenerazione capillare [aree avascolari], la neovascolarizzazione retinica patologica [aree neovascolari], dilatazione e tortuosità delle arteriole retiniche) in modelli sperimentali di retinopatie ischemiche, come la retinopatia indotta da ossigeno (OIR) e il diabete sperimentale7. Da notare che l'OIR riproduce la retinopatia del prematuro e alcuni aspetti della retinopatia diabetica proliferativa. La capacità di quantificare l'entità della neovascolarizzazione retinica (RNV) o della degenerazione capillare in modelli sperimentali è fondamentale per studiare i meccanismi molecolari e cellulari sottostanti, nonché per testare i possibili effetti terapeutici di interventi farmacologici o molecolari. In sintesi, questo articolo presenta tecniche classiche, consolidate e riproducibili per quantificare alcuni dei parametri vascolari più rilevanti considerati nella pratica clinica.
L'articolo di Vaglienti et al. presenta metodi per misurare i livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) nelle cellule gliali di Müller8. Il ruolo dello stress ossidativo nella disfunzione microvascolare retinica nelle retinopatie ischemiche è stato stabilito e ha incoraggiato i ricercatori a studiare la misura in cui le specie reattive dell'ossigeno (ROS) contribuiscono alla degradazione del BRB e dell'RNV sia in vivo che in vitro 9,10,11,12 . Vaglienti et al. utilizzano il 2',7'-diclorofluoresceina diacetato (DCFD) per valutare i livelli di generazione intracellulare di specie reattive dell'ossigeno (ROS). Questo metodo si basa sulla diffusione del DCFD nella cellula e quindi sull'ossidazione del DCFD da parte dei ROS in 2', 7' -diclorofluoresceina (DCF). Il DCF è altamente fluorescente e può essere rilevato mediante citometria a flusso o microscopia confocale. Questo metodo è in grado di visualizzare e misurare i livelli di generazione di ROS sia nelle cellule retiniche che nei tessuti.
L'articolo di Tomaszewski et al. dimostra l'isolamento e la crescita delle cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE) di topo13. Le cellule RPE contribuiscono al BRB esterno e svolgono un ruolo essenziale nell'emostasi e nell'integrità dei fotorecettori. La disfunzione delle cellule RPE è un segno distintivo di varie malattie della retina, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, AMD e DR. Pertanto, gli studi in vitro sulla funzione delle cellule RPE in salute e malattia sono fondamentali per comprendere i meccanismi molecolari e cellulari di diverse malattie vascolari della retina. A tal fine, l'isolamento primario delle cellule RPE potrebbe essere uno strumento importante per studiare i meccanismi sottostanti e la patogenesi di diverse malattie oculari, nonché per proporre nuove applicazioni terapeutiche per tali malattie. Questa tecnica consente lo studio dei cambiamenti nella struttura e nella funzione delle cellule RPE e del loro impatto sul BRB esterno in AMD e DR. Inoltre, la tecnica può essere applicata per studiare i cambiamenti nelle cellule RPE isolate da topi C57BL6 wild-type e da diversi topi geneticamente modificati e per testare diversi composti farmacologici come bersagli terapeutici per l'AMD14.
L'articolo di Elmasry et al. presenta un modello sperimentale ex vivo che può essere utilizzato per studiare le malattie retiniche neurovascolari coltivando espianti retinici per un periodo prolungato15. In questo sistema ex vivo, gli espianti retinici presentano reti vascolari e gliali intatte e neuroni retinici per un massimo di 2 settimane in coltura. Gli espianti retinici organotipici sono emersi come uno strumento affidabile per lo studio delle malattie retiniche, come la DR e le malattie degenerative della retina16,17. Rispetto ad altre tecniche esistenti, l'uso di espianti retinici supporta sia colture cellulari retiniche in vitro che modelli animali in vivo, aggiungendo una caratteristica unica che consente l'esame del crosstalk tra varie cellule retiniche (ad esempio, cellule vascolari, gliali e neuronali) con gli stessi parametri biochimici e indipendentemente dalle variabili sistemiche. Le colture di espianti mantengono insieme varie cellule retiniche nello stesso ambiente e mantengono le interazioni fisiche e molecolari intercellulari. Inoltre, gli studi hanno dimostrato che gli espianti retinici possono preservare la struttura morfologica e la funzionalità delle cellule retiniche in coltura. In sintesi, gli espianti retinici possono fornire una piattaforma adatta per studiare il crosstalk tra varie cellule retiniche in risposta a cambiamenti biochimici, come l'iperglicemia e l'ipossia, simili a quelli osservati nella retinopatia diabetica (DR) o nella retinopatia del prematuro (ROP). Questo approccio consente anche di testare interventi terapeutici in un ambiente biochimico ristretto. La coltura di espianti retinici rappresenta una tecnica controllabile e un modello sperimentale molto flessibile che consente numerose manipolazioni farmacologiche e può scoprire diversi meccanismi molecolari delle malattie retiniche.