Monitoraggio della pexofagia mediata da Stub1

Summary

Questo protocollo fornisce istruzioni per l'attivazione e il monitoraggio della pesofagia mediata da Stub1 in cellule vive.

Abstract

Le cellule di mammifero possono trasformare i perossisomi attraverso la pesofagia mediata da Stub1. Il percorso consente potenzialmente il controllo cellulare della quantità e della qualità dei perossisomi. Durante questo processo, la proteina da shock termico 70 e l'ubiquitina E3 ligasi, Stub1, traslocano sui perossisomi per essere girati per iniziare la pexofagia. L'attività della ligasi Stub1 consente l'accumulo di ubiquitina e di altri moduli correlati all'autofagia su perossisomi mirati. L'elevazione dei livelli di specie reattive dell'ossigeno (ROS) all'interno del lume perossisomale può attivare la pesofagia mediata da Stub1. Si può, quindi, utilizzare la generazione di ROS assistita da coloranti per innescare e monitorare questo percorso. Questo articolo delinea le procedure per l'utilizzo di due classi di coloranti, proteine fluorescenti e fluorofori sintetici, per avviare la pesofagia all'interno di colture cellulari di mammifero. Questi protocolli basati sulla generazione di ROS assistiti da coloranti non solo possono essere utilizzati per colpire tutti i perossisomi all'interno di una popolazione cellulare a livello globale, ma possono anche consentire la manipolazione di singoli perossisomi all'interno di singole cellule. Descriviamo anche come la pexofagia mediata da Stub1 può essere seguita usando la microscopia a cellule vive.

Introduction

I perossisomi sono organelli legati a membrana singola presenti nella maggior parte delle cellule eucariotiche. I perossisomi sono un compartimento metabolico essenziale per effettuare la beta-ossidazione degli acidi grassi a catena molto lunga, il catabolismo delle purine e la sintesi dei fosfolipidi eterici e degli acidi biliari¹. L'acetil-CoA derivata dai perossisomi controlla l'omeostasi lipidica regolando la segnalazione centrale nel metabolismo². Pertanto, non sorprende che le funzioni perossisomiali compromesse siano implicite in varie malattie, tra cui disturbi neurodegenerativi, invecchiame....

Protocol

1. Preparazione di cellule che esprimono proteine diKillerRed o automarcanti (SLP) nel lume dei perossisomi

1. Seminare le cellule desiderate su piatti di coltura cellulare con fondo di vetro. Per l'esperimento qui, seminare 2 x 10⁵ cellule umane SHSY5Y in 840 μL di terreno di coltura (DMEM / F-12 integrato con il 10% di siero bovino fetale e l'1% di penicillina / streptomicina) o 6 x 10⁴ cellule NIH3T3 di topo in 840 μL di terreno di coltura (DMEM integrato con siero bovino al 10% e penicillina / streptomicina) su un piatto di coltura da 35 mm con un micropozzetto di vetro di 20 mm di diametro.
   NOTA: Il numero di celle....

Results

Lo schema di induzione della pesofagia mediata da Stub1 mostrato qui sfrutta la generazione di ROS assistita da coloranti all'interno del lume del perossisoma. Questa operazione richiede intensità luminose minime. I perossisomi contenenti proteine fluorescenti o coloranti possono quindi essere illuminati utilizzando microscopi confocali a scansione laser standard. L'illuminazione focale porta alla produzione istantanea e localizzata di ROS all'interno dei singoli perossisomi, come indicato dal reporter fluorescente roGFP.......

Discussion

Questo protocollo spiega in dettaglio come innescare la pesofagia mediata da Stub1 all'interno delle colture cellulari elevando i livelli di ROS perossisomale con la luce. Poiché il protocollo si basa sulla generazione di ROS assistita da coloranti, è necessario garantire un'espressione sufficiente di diKillerRed-VKSKL o colorazione del ligando SLP marcato con colorante all'interno delle cellule di interesse. Dato che diversi tipi di cellule o cellule di diverso background genetico possono ospitare perossisomi con propri.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Piatto di coltura da 35 mm con micropozzetto in vetro di 20 mm di diametro.	MatTek	P35G-1.5-20-C	20 mm fondo di vetro
3-ammino-1,2,4-triazolo (3-AT)	Sigma Aldrich	A8056
siero bovino	ThermoFisher Scientific	16170060
Incubatore per colture cellulari	Nuaire	NU-4750
diKillerRed-PTS1	Academia Sinica		realizzato aggiungendo il dimero tandem KillerRed con PTS1(VKSKL)
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	ThermoFisher Scientific	11965092
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12)	ThermoFisher Scientific	11330032
EGFP-C1	Clontech	pEGFP-C1	La spina dorsale di EGFP-C1 è stata utilizzata per la clonazione di EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62
EGFP-Hsp70	Academia Sinica		PCR del gene Hsp70 (HSPA1A) amplificato dal cDNA HeLa e clonato in EGFP-C1
EGFP-LC3B	Addgene	11546
EGFP-p62	Academia Sinica		generato inserendo il gene umano SQSTM1 (attraverso l'amplificazione PCR del cDNA della cellula HeLa) in EGFP-C1
EGFP-Stub1	Academia Sinica		generato inserendo il gene Stub1 di topo (attraverso l'amplificazione PCR del cDNA del rene di topo totale) in EGFP-C1
EGFP-Ub	Addgene	11928
siero fetale bovino	ThermoFisher Scientific	10437028
ligando HaloTag TMR	Promega	G8252
HaloTag-PTS1	Academia Sinica		PTS1 aggiunto e clonato nel
HEPES	ThermoFisher Scientific	15630080
	Microscopio Olympus	FV3000RS	405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex,  con incubatore a camera TOKAI HIT e attacco per piatto UNIV2-D35
Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand	Promega	GA1120
LED	VitaStar	PAR64	80 W, 555-570 nm
lipofectamine 2000	ThermoFisher Scientific	11668	reagente di trasfezione
NIH3T3 cellula	ATCC	CRL-1658	aderente
Opti-MEM	ThermoFisher Scientific	319850	media sierico ridotto
penicillina/streptomicina	ThermoFisher Scientific	15140
PMP34-TagBFP	Academia Sinica		PMP34 PCR amplificato da HeLa cDNA e clonato intoTagBFP-C (Evrogen FP171)
roGFP2-PTS1	Academia Sinica		generato aggiungendo eroGFP (tratto dal plasmide Addgene 20131) con la sequenza di aminoacidi VKSKL e clonato nella cellula EGFP-C1
SHSY5Y	ATCC	CRL-2266	aderente