$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Gli animali sono sistemi altamente complessi composti da centinaia di diversi tipi di cellule organizzate in dozzine di tessuti e organi distinti. Studiare come i gruppi di cellule interagiscono tra loro e con il loro ambiente durante lo sviluppo embrionale non solo ci dà una migliore comprensione di come sono costruiti i corpi adulti, ma può anche rivelare le basi molecolari e cellulari di malattie e difetti alla nascita. Alcuni sistemi modello sono più adatti di altri ad affrontare specifiche questioni biologiche e gli scienziati impiegano un'ampia varietà di specie e tecniche sperimentali per sondare l'intera diversità della biologia degli organismi. Ad esempio, un dato esperimento di biologia dello sviluppo potrebbe coinvolgere l'ingegneria genetica, le dissezioni animali, la biologia molecolare, la biochimica e la microscopia ad alta risoluzione. Tali metodi possono essere difficili da riprodurre sulla base di descrizioni scritte e figure e, pertanto, è importante documentarli in forma video per favorire la diffusione della tecnica e dei metodi di analisi adeguati.
La relazione tra i meccanismi di sviluppo e la rigenerazione, in particolare nel sistema nervoso, è un'area di intenso interesse e il pesce zebra, Danio rerio, è diventato un modello chiave in questo campo grazie alla sua crescita permanente e alle sue capacità rigenerative. In particolare, esiste una complessa interazione tra le cellule della retina e il tectum ottico, e questa interazione è necessaria per stabilire connessioni corrette man mano che nuovi neuroni vengono aggiunti agli occhi eal cervello. Hagen et al. descrivono una tecnica per caratterizzare come la crescita e lo sviluppo neurale sono influenzati dalla denervazione dopo la rimozione degli occhi in embrioni di zebrafish viventi2. Descrivono in dettaglio come 1) eseguire un intervento chirurgico di rimozione degli occhi, 2) coltivare le larve dopo l'intervento chirurgico, 3) fissare, sezionare e conservare i campioni di cervello, 4) eseguire l'immunofluorescenza e 5) montare e visualizzare correttamente i campioni. Questa tecnica può essere utilizzata per studiare un'ampia varietà di processi di sviluppo neurologico in tessuti fissi e può anche essere modificata per esperimenti su embrioni vivi.
Le cellule della cresta neurale (NCC) rappresentano un importante lignaggio di sviluppo che dà origine alle cellule del pigmento, alla cartilagine, alle ossa, alla muscolatura liscia, ai neuroni e alla glia, e queste cellule sono implicate in molti tipi di difetti alla nascita3. Oltre alla loro impressionante pluripotenza, le NCC subiscono anche una transizione da epiteliale a mesenchimale seguita da un'ampia migrazione durante lo sviluppo, rendendole così un paradigma affascinante per comprendere l'interazione tra destino cellulare e morfologia4. Gli embrioni di pollo sono un potente sistema per studiare la biologia delle NCC, perché le NCC possono essere visualizzate in vivo e coltivate ex vivo, consentendo così molti tipi di trattamenti molecolari che sono difficili con altri sistemi. Jacques-Fricke et al. descrivono un metodo flessibile per la coltura di pieghe neurali craniche per generare colture primarie di NCC su vetrini coprioggetti rivestiti di fibronectina, che possono poi essere seguiti da esperimenti di imaging fisso o di imaging dal vivo5. Descrivono come 1) incubare e isolare gli embrioni, 2) sezionare e placcare le pieghe neurali, 3) fissare e colorare gli NCC e 4) quantificare e analizzare la morfologia degli NCC.
La membrana basale, una matrice extracellulare generata lungo la superficie basale delle cellule epiteliali, è fondamentale per l'instaurazione della morfologia dei tessuti e della funzione degli organi negli animali6. L'epitelio follicolare di Drosophila , che circonda l'uovo in formazione, è un modello eccellente per studiare come si formano le membrane basali, poiché secerne tutti i principali componenti conservati della membrana basale7 e la matrice è orientata verso "l'esterno" della camera dell'uovo, facilitando così le analisi basate sulla microscopia8. Shah e Devergne descrivono l'uso di uno dei tipi più popolari di microscopia a super-risoluzione, Airyscan, per esaminare come il traffico vescicolare influisce sulla formazione della membrana basale9. Mostrano come 1) raccogliere e fissare le ovaie di Drosophila , 2) eseguire l'immunofluorescenza, 3) montare correttamente i campioni e 4) acquisire set di dati a super risoluzione di alta qualità per l'analisi tridimensionale. Segnaliamo che questo articolo include un tutorial estremamente utile e conciso sulla corretta acquisizione di set di dati confocali tridimensionali non saturi, che dovrebbe essere di interesse generale per chiunque desideri quantificare immagini a fluorescenza.
Sebbene le tecnologie di super-risoluzione basate su microscopi (ad esempio, STED, SIM e Airyscan)10 stiano diventando sempre più comuni, sono più costose dei microscopi confocali standard e non sono disponibili per tutti i ricercatori. Una tecnica alternativa per ottenere immagini a super-risoluzione è la microscopia ad espansione (ExM), che prevede l'ingrandimento fisico di un campione biologico in tre dimensioni incorporandolo e legandolo a un idrogel11 rigonfiabile. I campioni espansi possono quindi essere visualizzati utilizzando un microscopio confocale standard per generare immagini con una risoluzione laterale dell'ordine di decine di nanometri, rivaleggiando con altri tipi di microscopia a super-risoluzione12. Il nostro gruppo descrive come implementare l'ExM in embrioni di Drosophila a montatura intera per rivelare le caratteristiche subcellulari del citoscheletro di actomiosina e delle reti mitocondriali che non sono rilevabili con la microscopia confocale standard13. Descriviamo come 1) selezionare embrioni correttamente stadiati, 2) eseguire l'immunofluorescenza, 3) preparare e montare gli embrioni per l'espansione, 3) digerire ed espandere gli embrioni e 4) raccogliere set di dati a super-risoluzione. Questa tecnica dovrebbe essere modificabile per un'ampia gamma di campioni biologici dell'ordine di 1 mm, rendendola accessibile a un'ampia gamma di laboratori di biologia.
La biologia dello sviluppo è, per necessità, un campo altamente inventivo e interdisciplinare che attinge a tecniche provenienti da diverse aree scientifiche per quantificare la biologia cellulare così come si verifica nell'animale. Qui, evidenziamo quattro metodi di biologia dello sviluppo nel pesce zebra, nel pulcino e nel moscerino della frutta che presentano tecniche classiche e all'avanguardia per sondare la morfologia cellulare e la localizzazione delle proteine subcellulari durante lo sviluppo animale. Attualmente, il campo si concentra sulla fusione di analisi quantitative della morfologia e del comportamento cellulare con esperimenti trascrittomici e proteomici per rivelare la piena diversità delle molecole e delle forze biomeccaniche che controllano lo sviluppo animale.