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Gli approcci proteomici possono includere il rilevamento e la quantificazione dei peptidi, delle proteine e delle specifiche modificazioni post-traduzionali (PTM) presenti in un determinato stato cellulare, nonché delle proteine che si uniscono in specifici organelli o complessi proteici macromolecolari. La proteomica è un campo diversificato che può essere suddiviso in flussi di lavoro generali e quantitativi. La proteomica quantitativa si concentra sulla determinazione della quantità di proteina o PTM proteica in un campione. La domanda biologica deve essere presa in considerazione prima di eseguire qualsiasi esperimento di proteomica al fine di determinare la preparazione del campione, il sequenziamento e il metodo di analisi dei dati più appropriati necessari per rispondere alla domanda. Le proteine sono altamente dinamiche e gli spettrometri di massa sono sensibili al sequenziamento di proteine più abbondanti rispetto a PTM più abbondanti più basse; Pertanto, la scelta dei flussi di lavoro per la preparazione e il sequenziamento dei campioni è fondamentale. Questa raccolta di metodi descrive gli approcci per quantificare determinati tipi di proteine utilizzando metodi MS all'avanguardia e fornisce un flusso di lavoro di analisi dei dati per le reti proteiche.
La peptidomica è lo studio dei peptidi generati naturalmente durante i normali processi cellulari e in condizioni di malattia, e questo approccio è stato storicamente limitato alla quantificazione basata su anticorpi fino a quando la cromatografia liquida accoppiata alla spettrometria di massa e i processi di estrazione dei peptidi sono avanzati al loro stato attuale1. Questi progressi, insieme all'applicazione dell'inattivazione termica delle proteasi endogene, consentono ora l'identificazione e la quantificazione di centinaia di peptidi intracellulari. In Correa et al.2, gli autori descrivono un flusso di lavoro di preparazione del campione, che include l'inattivazione del calore, l'estrazione di peptidi in condizioni blande per preservare i legami peptidici e la quantificazione relativa attraverso la marcatura di isotopi stabili delle ammine. Gli autori hanno sviluppato un approccio economico che potrebbe consentire l'identificazione e la quantificazione di peptidi nativi e biologicamente attivi da colture cellulari e campioni di tessuto. Questo approccio potrebbe essere utilizzato per scoprire biomarcatori peptidici specifici per la malattia, peptidi antimicrobici o bersagli per il futuro sviluppo terapeutico.
I progressi negli approcci di spettrometria di massa e bioinformatica consentono ora la caratterizzazione dettagliata di proteomi da diverse fonti di materiale biologico3. Decifrare il significato biologico dai modelli di espressione proteomica in questi campioni complessi rimane una sfida significativa nel campo. Per affrontare questa sfida, Vanderwall et al. introducono JUMPn, un programma di biologia dei sistemi e il relativo flusso di lavoro associato che organizza i dati proteomici in moduli (cioè complessi proteici) che collegano cluster di co-espressione proteica con nodi di rete di interazione proteina-proteina (PPI) correlati4. Gli autori valutano l'efficacia di questo strumento utilizzando set di dati proteomici esistenti e dati simulati e mostrano la sua utilità per facilitare l'interpretazione biologica di set di dati complessi di proteomi. I loro risultati mostrano che questo approccio può essere utilizzato per misurare il fattore di trascrizione e l'attivazione della cascata chinasica, dimostrando la sua utilità per identificare i driver della malattia umana e per altri studi che tentano di determinare i meccanismi biologici dai dati del proteoma profondo.
I pirofosfati di inositolo (PP-InsPs) si trovano in tutte le cellule eucariotiche dove funzionano come molecole di segnalazione metabolica e regolano diversi processi5. Storicamente, a causa delle proprietà fisiche e della bassa abbondanza di PP-InsP, l'analisi è stata limitata all'uso di traccianti radioattivi, che sono costosi e richiedono una cura e una conservazione speciali. In alternativa, Qiu et al. hanno sviluppato un protocollo che consente la quantificazione assoluta ad alto rendimento di pirofosfati di inositolo da colture cellulari o da materiale di origine tissutale mediante elettroforesi capillare accoppiata a spettrometria di massa a ionizzazione elettrospray (CE-ESI-MS)6. Nel loro rapporto, mostrano come questo approccio possa essere utilizzato per profilare tutti i PP-InsP presenti in un campione, risolvendo le specie e identificando i regioisomeri al fine di identificare i cambiamenti spaziali e temporali in diverse condizioni e stati patologici.
Gran parte dei processi cellulari sono controllati attraverso la fosforilazione delle proteine e gli errori in queste vie di segnalazione sono associati a molti stati patologici diversi7. Tuttavia, ci sono ancora lacune significative nella comprensione dei meccanismi completi che regolano le fosfatasi e le chinasi proteiche in diversi tipi di cellule e in varie condizioni. Per colmare queste lacune nella comprensione, Smolen et al. introducono un nuovo flusso di lavoro che utilizza perle inibitrici della fosfatasi accoppiate alla spettrometria di massa (PIB-MS)8. Utilizzando un inibitore non selettivo della fosfoproteina fosfatasi, microcistina-LR, accoppiato a perle di tosefarosio, gli autori sono in grado di arricchire queste proteine bersaglio. Inoltre, utilizzando condizioni di lavaggio blande per rimuovere i contenimenti non specifici, sono stati anche in grado di catturare gli interattori proteici. Mostrano come questo approccio possa essere utilizzato per identificare e quantificare le fosfoproteine fosfatasi, il loro stato di fosforilazione e le potenziali interazioni proteina-proteina sia nella coltura cellulare che nei tessuti.
I progressi nei metodi di preparazione dei campioni, come le strategie per quantificare i peptidi endogeni, l'arricchimento di fosfatasi e chinasi, le interazioni proteiche e l'inositolo pirofosfati, stanno ampliando la base di conoscenze per la dinamica delle proteine nei processi biologici. Il progresso degli spettrometri di massa, come l'acquisizione indipendente dai dati, in contrasto con l'acquisizione dipendente dai dati, consente una maggiore profondità della capacità di sequenziamento per identificare i peptidi in modo tale che i peptidi più abbondanti non mascherino i peptidi più bassi durante la raccolta dei dati, il che consente di identificare altre classi di proteine. Gli spettrometri di massa timsTOF contribuiranno a far avanzare il futuro incorporando la mobilità ionica oltre alla cromatografia liquida come separazione aggiuntiva dei peptidi per consentire un sequenziamento ancora più profondo e una maggiore possibilità di rilevare i peptidi dalle strategie di preparazione dei campioni descritte in questa raccolta. Il campo della proteomica continuerà ad andare avanti sulla base di nuove metodologie di preparazione dei campioni, progressi negli spettrometri di massa per l'acquisizione dei dati e strumenti di analisi bioinformatica, come JUMPn, per comprendere le complessità e le funzioni biologiche.