Articolo metodologico

Sistemi di espressione cell-free: metodi di produzione e utilizzo

28 luglio 2023

 ,  , 
1US Army Combat Capabilities Development Command Chemical Biological Center, 2711th Human Performance Wing, Air Force Research Laboratory, Wright-Patterson Air Force Base, 3Office of Naval Research – Global

In questo articolo

Abstract

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ARTICOLI DISCUSSI:

Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. Sistema senza cellule OnePot PURE. Giornale degli esperimenti visualizzati. (172), DOI:10.3791/62625 (2021).

Smith, P. E. J., Slouka, T., Dabbas, M., Oza, J. P. Dalle cellule alla sintesi proteica cell-free entro 24 ore utilizzando il flusso di lavoro di autoinduzione cell-free. Giornale degli esperimenti visualizzati. (173), DOI:10.3791/62866 (2021).

Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Produzione rapida, economica e senza complicazioni di lisato batterico privo di cellule. Giornale degli esperimenti visualizzati. (176), DOI:10.3791/62753 (2021).

Dopp, J. L., Reuel, N. F. Metodi enzimatici rapidi per l'amplificazione di modelli lineari minimi per la prototipazione di proteine utilizzando sistemi privi di cellule. Giornale degli esperimenti visualizzati. (172), DOI:10.3791/62728 (2021).

McManus, J. B. et al. Caratterizzazione rapida di parti genetiche con sistemi privi di cellule. Giornale degli esperimenti visualizzati. (174), DOI:10.3791/62816 (2021).

Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. Un toolkit di trascrizione-traduzione di streptomyces ad alto rendimento per applicazioni di biologia sintetica e prodotti naturali. Giornale degli esperimenti visualizzati. (175), DOI:10.3791/63012 (2021).

Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Cromatografia liquida accoppiata all'indice di rifrazione o alla rilevazione spettrometrica di massa per la profilazione dei metaboliti in sistemi privi di cellule basate su lisato. Giornale degli esperimenti visualizzati. (175), DOI:10.3791/62852 (2021).

Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparazione di microcapsule multifunzionali a base di seta caricate con plasmidi di DNA che codificano RNA aptameri e riboswitch. Giornale degli esperimenti visualizzati. (176), DOI:10.3791/62854 (2021).

Jaenes, K. et al. Studio dalla progettazione all'implementazione per lo sviluppo e la convalida del paziente della diagnostica cartacea dell'interruttore di apporto. Giornale degli esperimenti visualizzati. (184), DOI:10.3791/63223 (2022).

Editoriale

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I sistemi di espressione libera cellulare (CFE) sono una suite di strumenti che ricostituiscono i processi cellulari chiave di trascrizione, traduzione e metabolismo al di fuori dei confini della cellula1. Tali metodi sono cresciuti rapidamente in popolarità offrendo una sperimentazione semplificata attraverso la rimozione delle membrane cellulari e una complessità ridotta attraverso la rimozione del DNA genomico e la corrispondente complessità delle interazioni tra un costrutto genetico e l'ospite. I sistemi CFE sono ora utilizzati per la ricerca di base, il rilevamento, la bioproduzione e l'istruzione. Questa raccolta di metodi presenta nove esempi di nuovi modi per produrre e utilizzare sistemi privi di cellule.

Tre dei metodi si concentrano sul rendere più accessibile la produzione di sistemi privi di cellule. Grasemann et al. descrivono un modo più semplice per realizzare il sistema PURE, un sistema CFE che ricostituisce tutti i componenti necessari per la trascrizione e la traduzione, piuttosto che utilizzare lisati cellulari2. Invece di esprimere e purificare ciascuno dei 36 componenti proteici, gli autori raggruppano i ceppi di espressione, offrendo la produzione di un sistema PURE funzionale entro una settimana. Smith et al. offrono un processo semplificato per la produzione di sistemi CFE a base di lisato utilizzando un approccio di coltura semplificato che riduce il flusso di lavoro totale a 24 ore, realizzabile entro il normale orario di lavoro3. Cooper et al. descrivono un metodo che utilizza un ceppo modificato di E. coli che consente la lisi cellulare mediante congelamento-scongelamento, eliminando la necessità di attrezzature specializzate richieste da altri metodi4. Tutti questi metodi contribuiscono a una tendenza degli sforzi per rendere la produzione di sistemi privi di cellule raggiungibile da laboratori con meno infrastrutture e competenze nei complicati protocolli tradizionali. Con la disponibilità di kit commerciali concorrenti, sempre più laboratori possono esplorare i vantaggi dei sistemi CFE con pochi rischi. Con metodi come quelli presentati qui, questi laboratori possono quindi scegliere di creare i propri sistemi CFE su misura per le loro esigenze senza un enorme investimento in attrezzature o tempo.

Due metodi si concentrano sui vantaggi della sperimentazione rapida e ad alta produttività possibile con i sistemi CFE. Dopp et al. presentano un metodo per amplificare i modelli di DNA lineare per lo screening rapido di costrutti genetici5. Utilizzando il loro approccio, i disegni genetici possono essere ordinati dalle società di sintesi del DNA e quindi amplificati e sottoposti a screening entro 24 ore. McManus et al. descrivono un approccio simile in base al quale un gene reporter viene amplificato con primer variabili che codificano per diversi componenti regolatori6. Il basso costo degli oligo abbinati ai sistemi CFE consente uno screening rapido ed economico di componenti come i promotori. Entrambi i metodi evidenziano il potenziale dei sistemi CFE per una rapida sperimentazione, riducendo i tempi per la progettazione e il collaudo di un costrutto da settimane con la clonazione tradizionale a giorni o addirittura ore.

I tre metodi successivi forniscono strumenti per usi specializzati dei sistemi CFE. Toh et al. offrono un metodo per creare sistemi CFE da Streptomyces venezuelae7. La maggior parte dei protocolli CFE si basa su E. coli, inclusi tutti gli altri metodi di questa raccolta. Questo nuovo metodo per il S. venezuelae porta i vantaggi dei sistemi CFE a un organismo di ampio interesse per la produzione di prodotti naturali. Dinglasan et al. forniscono un modo per misurare le concentrazioni di metaboliti nelle reazioni prive di cellule8. Tali misurazioni sono fondamentali per le applicazioni nell'ingegneria metabolica cell-free, in cui il metabolismo intatto dei sistemi CFE viene utilizzato per produrre prodotti non proteici di interesse. In terzo luogo, Drachuk et al. presentano la microincapsulazione del DNA per l'aggiunta alle reazioni CFE9. Questo approccio è rappresentativo di un insieme di tecniche che consentono di reintrodurre razionalmente i vantaggi della compartimentazione nei sistemi CFE dopo la rimozione delle membrane naturali durante la produzione di sistemi CFE. Ognuno di questi metodi diversifica la gamma di applicazioni a cui possono essere applicati i sistemi CFE.

Infine, Jaenes et al. descrivono i metodi per produrre una diagnostica del mondo reale per il virus Zika basata su sistemi CFE10. I test e la strumentazione sono a basso costo rispetto alle tecnologie concorrenti come la PCR e gli autori hanno testato con successo la loro diagnostica utilizzando campioni di pazienti in più paesi. Questo lavoro è un forte esempio di applicazioni di rilevamento del punto di necessità, che è forse l'area in cui i sistemi CFE sono pronti ad avere l'impatto più immediato nel mondo reale.

Come raccolta, questi metodi catturano una fascia rappresentativa delle principali aree di ricerca attive nei sistemi CFE negli ultimi anni. I metodi che migliorano la produzione di sistemi CFE e consentono la sperimentazione ad alta produttività sono ben rappresentati e sono presenti esempi dei numerosi usi più specifici dei sistemi CFE. Altre aree di interesse includono la produzione di proteine complesse per applicazioni mediche, l'incorporazione di amminoacidi non canonici, l'ottimizzazione per la conservazione a lungo termine e lo sviluppo di cellule artificiali. Prevediamo che l'adozione dei sistemi CFE continuerà ad accelerare, data la ridotta barriera all'ingresso, il potenziale per una rapida sperimentazione e una gamma più ampia di funzionalità, il tutto reso possibile da metodi come quelli presentati in questa raccolta. Le sfide rimanenti dipendono dallo spazio applicativo. Per la bioproduzione, la riduzione dei costi su larga scala attraverso il passaggio a substrati più economici e un migliore riciclaggio saranno fondamentali. Per il rilevamento, è necessario un lavoro significativo basato sull'esempio di Jaenes et al. per dimostrare prestazioni robuste in varie applicazioni al momento del bisogno. In generale, il settore deve continuare a perfezionare le tecniche di base, ampliando al contempo il repertorio di ciò che può essere fatto con i sistemi CFE.

Dichiarazioni

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Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

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Gli autori ringraziano il programma di Ricerca Applicata per l'Avanzamento delle Priorità S&T dell'Ufficio del Segretario della Difesa per aver sostenuto la collaborazione che ha portato a questa raccolta.

Riferimenti

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  1. Silverman, A. D., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free gene expression: an expanded repertoire of applications. Nature Reviews. Genetics. 21 (3), 151-170 (2020).
  2. Grasemann, L., Lavickova, B., Elizondo-Cantú, M. C., Maerkl, S. J. OnePot PURE cell-free system. Journal of Visualized Experiments. (172), e62625(2021).
  3. Smith, P. E. J., Slouka, T., Oza, J. P. From cells to cell-free protein synthesis within 24 hours using cell-free autoinduction workflow. Journal of Visualized Experiments. (173), e62866(2021).
  4. Cooper, R. M., Tonooka, T., Didovyk, A., Hasty, J. Rapid, affordable, and uncomplicated production of bacterial cell-free lysate. Journal of Visualized Experiments. (176), e62753(2021).
  5. Dopp, J. L., Reuel, N. F. Rapid, enzymatic methods for amplification of minimal, linear templates for protein prototyping using cell-Free Systems. Journal of Visualized Experiments. (172), e62728(2021).
  6. McManus, J. B., et al. Rapid characterization of genetic parts with cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (174), e62816(2021).
  7. Toh, M., Chengan, K., Hanson, T., Freemont, P. S., Moore, S. J. A high-yield streptomyces transcription-translation toolkit for synthetic biology and natural product applications. Journal of Visualized Experiments. (175), e63012(2021).
  8. Dinglasan, J. L. N., Reeves, D. T., Hettich, R. L., Doktycz, M. J. Liquid chromatography coupled to refractive index or mass spectrometric detection for metabolite profiling in lysate-based Cell-free systems. Journal of Visualized Experiments. (175), e62852(2021).
  9. Drachuk, I., Harbaugh, S., Kelley-Loughnane, N., Chávez, J. L. Preparation of multifunctional silk-based microcapsules loaded with DNA plasmids encoding RNA aptamers and riboswitches. Journal of Visualized Experiments. (176), e62854(2021).
  10. Jaenes, K., et al. Design to implementation study for development and patient validation of paper-based toehold switch diagnostics. Journal of Visualized Experiments. (184), e63223(2022).

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