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La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa devastante che colpisce circa 1 persona su 400 nel corso della sua vita. La malattia si presenta inizialmente con compromissione del motoneurone superiore e inferiore e alla fine progredisce fino alla paralisi e alla morte a causa di insufficienza respiratoria entro 2-5 anni dall'insorgenza dei sintomi1. La SLA può essere ereditaria, con oltre 30 diverse mutazioni genetiche ma solo 4 varianti genetiche (C9orf72, FUS, SOD1, TARDBP) che rappresentano circa il 55% della SLA familiare. La maggior parte dei casi di SLA, circa il 90%, rappresenta SLA sporadica, per la quale le cause principali non sono ancora deltutto comprese2. C'è un urgente bisogno di svelare i meccanismi della SLA utilizzando gli strumenti appropriati e gli organismi modello. In questa raccolta di metodi, forniamo una panoramica dei recenti progressi della ricerca in termini di imitazione di questa malattia e, si spera, di trovare opzioni di trattamento. Ad esempio, l'applicazione di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) che possono essere differenziate in motoneuroni o astrociti offre un sistema modello umanizzato 3,4,5. Inoltre, in questa raccolta di metodi, vengono presentati modelli animali, come Drosophila per studiare l'assorbimento del glucosio e la giunzione neuromuscolare (NMJ) in vivo 6,7, topi per studiare i neuroni corticali8 e C. elegans o zebrafish per studiare le menomazioni motorie 9,10 e il tessuto paziente post-mortem11.
Le larve di pesce zebra sono trasparenti e i loro motoneuroni sono direttamente visibili, il che le rende uno strumento perfetto per studi in vivo non invasivi. Asakawa et al. mostrano la transizione di fase di TDP-43 optogeneticamente espresso in singoli motoneuroni spinali9. Dopo l'irradiazione, il trasferimento citoplasmatico di TDP-43 può essere osservato e analizzato. L'aggregazione di TDP-43 citoplasmatico è un segno distintivo della degenerazione dei motoneuroni nella SLA. Questo metodo consente lo studio funzionale e l'analisi delle proteine associate alla SLA in modo subcellulare e temporale.
Utilizzando la microscopia a illuminazione strutturata (SIM) a super-risoluzione, Coyne e Rothstein descrivono in dettaglio un protocollo che isola i nuclei e descrive come studiare i complessi nucleoporinici11. I complessi nucleoporinici sono costituiti da copie multiple di circa 30 diverse proteine nucleoporine (Nups). È stato dimostrato che la compromissione del trasporto nucleocitoplasmatico (NCT) e le alterazioni di Nup sono segni distintivi precoci di molte malattie neurodegenerative, tra cui la SLA. Estraendo i nuclei, è possibile studiare le singole proteine Nup all'interno dell'NPC e il nucleoplasma in 3D. È interessante notare che questo può essere applicato non solo alle cellule derivate da iPSC, ma anche ai tessuti post-mortem.
Currey e Liachko descrivono due test per discriminare tra compromissione motoria lieve, moderata e grave nei modelli di ALS10 di C. elegans. Nel saggio di locomozione radiale, viene misurato il gattonamento su una superficie, il che lo rende un test facile ed economico. Nel secondo metodo, il saggio di nuoto, i movimenti di dimenatura possono essere misurati utilizzando un metodo di tracciamento basato su computer. Gli autori lo usano per studiare TDP-43 e tau.
Hayes et al. descrivono anche un metodo per studiare l'NCT8. Applicano un metodo di permeabilizzazione alle colture neuronali. Utilizzando neuroni corticali primari di topo, descrivono un metodo che mantiene l'integrità della membrana nucleare utilizzando la lisi ipotonica combinata con un cuscinetto di albumina sierica bovina. In questo modo, l'importazione di energia nucleare continua a funzionare in modo dipendente dall'energia, fornendo così una piattaforma di microscopia e analisi ad alto contenuto. Questa piattaforma avrà un'ampia applicabilità in futuro per lo studio del trasporto nucleare passivo e attivo nei neuroni primari.
La rapida valutazione di come la manipolazione, le proteine correlate alla malattia o l'RNA influenzino i processi sinaptici e se i farmaci terapeutici possano ripristinare queste funzioni è essenziale per la ricerca sulla SLA. Utilizzando motoneuroni derivati da iPSC e neuroni primari di topi, Krishnamurthy et al. presentano un protocollo che consente il monitoraggio in tempo reale delle dinamiche dell'afflusso di calcio presinaptico e della fusione della membrana delle vescicole sinaptiche3. Gli autori dimostrano che la trasfezione di C9orf72-(GA)50 compromette la trasmissione sinaptica, evidenziando l'idoneità di questi metodi per rilevare differenze basate su mutazioni nella funzione sinaptica.
L'alterato assorbimento del glucosio è una delle caratteristiche patobiologiche della SLA. In questo modello di Drosophila , Loganathan et al. descrivono un metodo basato su FRET per misurare i cambiamenti intracellulari nell'assorbimento del glucosio in cellule specifiche6. Utilizzando un sensore FRET di glucosio geneticamente codificato, convalidano il loro metodo con i neuroni di espressione TDP-43, che mostrano un maggiore assorbimento del glucosio. Nella linea mutante TDP-43G298S , l'aumento dell'assorbimento del glucosio è rilevabile solo dopo la stimolazione del glucosio. Questo metodo fornisce uno strumento importante per studiare la glicolisi non solo nella SLA, ma anche in generale in relazione alla rigenerazione dei motoneuroni.
Le tecniche di dissezione che preservano l'architettura NMJ sono della massima importanza per studiare i cambiamenti nei motoneuroni lungo la zampa di Drosophila nel tempo. Stilwell e Agudelo utilizzano una tecnica che consente la caratterizzazione della NMJ per identificare gli arbori dei motoneuroni utilizzando l'immunocitochimica7. È interessante notare che i neuroni adulti sono presenti per tutta la vita di una mosca, che è di circa 90 giorni. Confrontando una mutazione SOD1H71Y con il wild-type, gli autori dimostrano diversi marcatori per il gonfiore di bouton dipendente dall'età, gli aggregati proteici e l'ingrossamento dei mitocondri.
L'innovazione di imitare un NMJ utilizzando un sistema di co-coltura soddisfa l'urgente necessità di studiare la dissociazione tra motoneuroni e miotubi. In termini di questo metodo, Stoklund Dittlau et al. descrivono come coltivare motoneuroni umani derivati da iPSC e miotubi primari umani derivati da mesoangioblasti per formare NMJ funzionalmente attivi4. Gli autori mostrano la loro funzionalità attraverso l'attivazione dei motoneuroni con cloruro di potassio e l'afflusso di calcio nei miotubi marcati con Fluo-4, che è stato successivamente abolito dalla somministrazione di bloccanti NMJ.
Recentemente, i sistemi di co-coltura hanno guadagnato sempre più attenzione. Studiare non solo uno, ma più tipi di cellule in un piatto ha il vantaggio di imitare meglio le condizioni fisiologiche rispetto ai metodi che utilizzano cellule monocoltivate. La patobiologia correlata alla SLA, come la tossicità mediata dagli astrociti e l'ipereccitabilità neuronale, può essere studiata utilizzando questo approccio. Nel video di Taga et al., viene mostrata la generazione di neuroni corticali e astrociti in una co-coltura combinata con una configurazione multi-electrode array (MEA) per il monitoraggio dell'elettrofisiologia5. L'attività funzionale può essere monitorata nel tempo, consentendo flessibilità nella composizione cellulare e diverse condizioni di coltura. Ciò fornisce inoltre una piattaforma per testare il potenziale terapeutico dei farmaci e la loro influenza sull'attività funzionale.
Attualmente, ci sono solo tre trattamenti approvati dalla FDA per la SLA, tutti con un potenziale di applicazione limitato. Per trovare trattamenti più promettenti, la ricerca futura deve comprendere meglio la patobiologia impiegando più sistemi e approcci modello. Senza dubbio, i modelli umani derivati da iPSC forniranno una piattaforma interessante per studiare i meccanismi molecolari sottostanti. Questo, combinato con sistemi modello come zebrafish, C. elegans, Drosophila o roditori, porterà a progressi nel campo. Inoltre, si spera che la futura ricerca epidemiologica fornisca maggiori informazioni su come i fattori ambientali svolgano un ruolo nello sviluppo della SLA12. Con l'espansione dei set di dati e lo sviluppo della bioinformatica ad alta velocità, in futuro diventerà più facile svelare i denominatori comuni delle malattie neurodegenerative. Questo porterà a nuove strade per la terapia o addirittura per la prevenzione.