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Anche prima che il Premio Nobel 2017 fosse assegnato per la microscopia crioelettronica (cryoEM) di molecole biologiche, il campo stava generando entusiasmo. La rivoluzione della risoluzione era ben avviata e la biologia strutturale stava cercando la crioEM come metodo di caratterizzazione che si avvicinava al gold standard della cristallografia a raggi X1. All'inizio, il campo della crioEM comprendeva principalmente i dati generati dai microscopi elettronici a trasmissione criogenica (cryoTEM). Ora, con l'avanzare dei microscopi, degli strumenti di preparazione dei campioni e dei metodi di preparazione dei campioni, i tipi di dati generati sono diventati più diversificati. La CryoEM non è più riservata alla caratterizzazione delle proteine mediante crioTEM. Il settore è cresciuto e ora comprende dati generati da microscopi elettronici a crio-scansione e fasci ionici focalizzati (cryoSEM/FIB). L'impatto è più ampiamente avvertito in più discipline, tra cui la ricerca di imaging su molecole, cellule, tessuti e materiali sintetici come gli idrogel.
I progressi nelle capacità di imaging sono stati una forza trainante nello sviluppo della crioEM. I miglioramenti apportati alle telecamere, ai rilevatori e all'elaborazione delle immagini hanno aperto la strada all'imaging con un minore apporto di energia, che consente ai delicati campioni biologici di sopravvivere al processo di imaging. Nei TEM, l'esposizione al fascio a basse dosi si è tradotta nell'applicazione della tomografia in cui un singolo campione viene ripreso ripetutamente da più angolazioni per generare una ricostruzione 3D 2,3. I progressi nei SEM/FIB hanno anche portato a una migliore risoluzione utilizzando meno energia. È importante sottolineare che ciò ha portato a un miglioramento dell'imaging di campioni non conduttivi, che si traduce in un migliore imaging del volume in SEM/FIB 4,5. Questi miglioramenti hanno fatto progredire tutte le immagini di microscopia elettronica biologica, ma hanno soprattutto migliorato la crioimaging, in cui i campioni sono delicati e non hanno metalli pesanti aggiunti per migliorare il contrasto.
Con l'avanzare delle capacità di imaging, sono progrediti anche gli strumenti di preparazione dei campioni. Nella preparazione dei campioni cryoEM, il primo passo è la vitrificazione dei campioni. I campioni idrati vengono congelati per formare ghiaccio amorfo, evitando così i danni causati dalla formazione di cristalli di ghiaccio. Le strategie principali sono il congelamento a tuffo in etano liquido per molecole e piccole cellule o il congelamento ad alta pressione (HPF) per campioni più grandi fino a poche centinaia di micron di spessore. I progressi nella tecnologia di congelamento a tuffo consentono una migliore cattura delle molecole in tutti gli orientamenti, riducendo l'autoassemblaggio lungo l'interfaccia aria/acqua6. Inoltre, i progressi nella tecnologia HPF consentono la luce e la stimolazione elettrica dei campioni pochi istanti prima del congelamento7. Più recentemente, è stata sviluppata una nuova tecnologia HPF in grado di interfacciarsi con un microscopio a fluorescenza, consentendo un breve ritardo (<2 s) tra l'imaging a fluorescenza di cellule vive e il congelamento HPF8.
I progressi di cui sopra hanno dato energia al campo della crioEM e ispirato lo sviluppo di nuovi metodi. C'è stato anche un rinvigorimento delle tecniche consolidate. Qui, presentiamo una raccolta di metodi incentrati sull'avanzamento della crioEM con l'obiettivo di diffondere queste strategie nel campo della ricerca in rapida espansione.
Mentre i miglioramenti nelle capacità di imaging e negli strumenti di preparazione dei campioni sono stati una delle principali forze trainanti dei progressi nel campo della crioEM, uno dei principali ostacoli in questa ricerca continua ad essere la preparazione pratica dei campioni. Truong et al.9 presentano un metodo che sfrutta la formazione di monostrati lipidici all'interfaccia aria/acqua. Uno strato lipidico si forma sulla griglia TEM e funge da impalcatura per le proteine di membrana di interesse. Per campioni multilamellari o a membrana impilata, Johnson et al.10 presentano una strategia per "staccare" gli strati in eccesso, lasciando un singolo strato sulla griglia appropriato per l'imaging TEM. In un altro articolo, Chang et al.11 riconoscono che alcune proteine dipendono dalla temperatura e che la struttura pertinente si osserva a temperature elevate. Descrivono un metodo di congelamento a tuffo modificato che consente di applicare i campioni alla griglia a temperature elevate, pur ottenendo ghiaccio vetroso dopo il congelamento a tuffo. Per controllare ulteriormente il processo di preparazione della criogriglia, Kang et al.12 presentano un metodo ad alto rendimento per produrre chip micromodellati per griglie TEM in cui i pori hanno una profondità controllabile. Questo metodo può fornire un'altra variabile per controllare lo spessore del ghiaccio amorfo durante la preparazione della griglia.
La correlazione di più modalità di imaging è di grande impatto. Bieber et al.13 descrivono un flusso di lavoro criogenico in cui una griglia congelata viene ripresa in un microscopio a criorescenza per localizzare una regione fluorescente di interesse. La griglia viene quindi trasferita a un crioSEM/FIB, dove vengono utilizzati i fiduciali per allineare l'immagine di fluorescenza con l'immagine SEM, consentendo così di mirare la regione fluorescente per la fresatura di FIB. La regione target viene assottigliata a poche centinaia di nanometri, quindi la griglia viene trasferita a un cryoTEM per la tomografia sulla posizione target assottigliata. DiCecco et al.14 dimostrano una correlazione tra TEM liquido e crioTEM, avvicinandosi così all'obiettivo di accoppiare i dati cryoTEM ad alta risoluzione con i dati TEM delle molecole in movimento dinamico.
Anche l'acquisizione automatizzata di grandi set di dati è un'area di interesse. Il tempo prezioso degli strumenti deve essere massimizzato e l'automazione è un passaggio fondamentale. Kumar et al.15 descrivono la configurazione click-by-click di un software di acquisizione dati automatizzato per l'imaging crioTEM.
Man mano che il campo della crioEM continua a svilupparsi, si vedranno ulteriori progressi nella preparazione dei campioni e l'impatto della crioEM si farà sentire ampiamente in più discipline. Alcuni progressi riguarderanno non nuove tecniche, ma il rafforzamento delle tecniche esistenti. Le tecniche saranno più veloci, più facili e più robuste, con una maggiore produttività. Man mano che l'automazione aumenta l'output dei dati, le aree chiave di sviluppo saranno l'analisi delle immagini e l'elaborazione dei dati. Inoltre, l'intelligenza artificiale svolgerà un ruolo importante. Dovremmo aspettarci di vedere una riduzione dei costi e dell'ingombro della strumentazione, che consentirà a questa tecnologia di diventare più ampiamente accessibile, anche se questi sviluppi potrebbero essere più lenti a concretizzarsi.