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Il glicogeno, un polimero ramificato del glucosio, svolge un ruolo importante nel metabolismo energetico dei procarioti e degli eucarioti. In condizioni di limitazione dei nutrienti, i batteri e i lieviti utilizzano il glicogeno per la sopravvivenza cellulare1. Nei mammiferi, il glicogeno ha ruoli tessuto-specifici, incluso l'uso locale nei muscoli per alimentare la contrazione e nel fegato per regolare i livelli di glucosio nel sangue2. La sintesi del glicogeno è catalizzata dalla glicogeno sintasi, che unisce i residui di glucosio tramite legami alfa 1,4, e dall'enzima ramificato, che forma legami alfa 1,6, creando così ramificazioni nella macromolecola di glicogeno. L'utilizzo di questa riserva di energia è facilitato dalla glicogeno fosforilasi in combinazione con l'enzima deramificante, con conseguente rimodellamento del glicogeno e rilascio di glucosio-1-P. La struttura del glicogeno, compresa la dimensione delle particelle e la ramificazione, è interessante in parte perché la ramificazione influisce sulla solubilità del glicogeno, la dimensione delle particelle di glicogeno influisce sul loro tasso di degradazione e l'instabilità strutturale del glicogeno è stata implicata nel diabete. Inoltre, studiare la localizzazione subcellulare del glicogeno è importante in tessuti come i muscoli per fornire informazioni sul ruolo di questo carburante durante l'esercizio.
L'accumulo di glicogeno è controllato dalle attività relative degli enzimi che sintetizzano il glicogeno e di quelli che degradano la macromolecola. Wilson3 descrive le tecniche per misurare l'attività enzimatica della glicogeno sintasi, della glicogeno fosforilasi, dell'enzima ramificante e dell'enzima deramificato. Questi metodi biochimici misurano la produzione o il consumo di NADH/NADPH o il cambiamento colorimetrico con uno spettrofotometro. Si tratta di approcci scalabili che eludono i costi elevati, le apparecchiature specializzate e l'onere normativo associati al metodo più sensibile che utilizza i radioisotopi. I metodi descritti sono i più adatti per misurare l'attività enzimatica con enzimi purificati, anche se con una sufficiente diluizione dell'omogeneizzato e controlli adeguati, sono stati utilizzati con campioni di tessuto. Wilson3 descrive anche un semplice test colorimetrico per misurare la ramificazione del glicogeno. Sebbene questo metodo fornisca meno informazioni sulla struttura fine del glicogeno rispetto alle tecniche di separazione più laboriose, fornisce una misura semplice e rapida dei gradi relativi di ramificazione.
Fermont et al.4 descrivono l'uso dell'elettroforesi dei carboidrati assistita da fluorofori (FACE), un metodo per determinare la distribuzione della lunghezza della catena (CLD), che è un riflesso della dimensione delle particelle di glicogeno e della percentuale di ramificazione. La struttura del glicogeno influisce sulla capacità dei batteri di sopravvivere alla fame e il glicogeno anomalo si accumula in diverse malattie da accumulo di glicogeno, evidenziando così l'importanza dei metodi per studiare le dimensioni e la ramificazione di questa fonte di combustibile. La FACE comporta l'amminazione riduttiva di un gruppo emiacetalico con acido 8-ammino-1,3,6 pirene trisolfonico (APTS). Oltre a fornire informazioni sulla CLD, FACE è utile per misurare le proprietà catalitiche degli enzimi ramificati provenienti da varie fonti. La principale tecnica concorrente, HPAEC-PAD, ha il vantaggio di non richiedere estremità non riducenti, ma questa tecnica ha un problema di distorsione di massa.
Il grado di ramificazione e la dimensione delle particelle di glicogeno sono entrambe caratteristiche importanti del polimero del glucosio. È stato osservato utilizzando la microscopia elettronica che il glicogeno esiste in tre strutture: particelle beta sferiche (~20 nm), che includono diverse particelle gamma (3 nm), e particelle alfa più grandi a forma di rosetta (~300 nm) composte da particelle beta5. I metodi tradizionali per isolare il glicogeno sono sufficienti per misurare la concentrazione di glicogeno, ma compromettono la struttura fine del glicogeno, il che significa che è necessario lo sviluppo di una tecnica più blanda. Un'estrazione con acqua fredda mediante centrifugazione in gradiente di densità di saccarosio è descritta per l'uso nei batteri da Wang, Wang et al.6. Questa tecnica è superiore ad altri metodi per preservare sia le molecole di glicogeno più grandi, misurate dalla cromatografia ad esclusione dimensionale (SEC), sia le catene più lunghe, misurate dall'elettroforesi capillare assistita da fluorofori (FACE)6. Anche Wang, Liu et al.7 applicano un metodo simile al fegato. L'importanza di comprendere la struttura del glicogeno è dimostrata da un recente rapporto che mostra che, nel diabete, le particelle di glicogeno alfa epatico sono "fragili", il che si traduce in una degradazione più rapida rispetto alle particelle alfa stabili, con un possibile impatto sul controllo della glicemia. I limiti di questi metodi di isolamento basati su gradiente di saccarosio includono la perdita di glicogeno nel surnatante, che può essere mitigata da una minore concentrazione di saccarosio, e la degradazione enzimatica di una parte del glicogeno a causa delle condizioni blande utilizzate. Quest'ultimo è mitigato da una breve fase di ebollizione, anche se questo interrompe le proteine associate.
Infine, Jensen et al.8 descrivono l'uso della microscopia elettronica a trasmissione (TEM) per visualizzare la distribuzione subcellulare del glicogeno e la dimensione delle particelle in singole fibre muscolari scheletriche. Questo metodo è l'unico disponibile per lo studio dei pool di glicogeno subsarcolemmale, intermiofibrillare e intramiofibrillare ed è stato utilizzato su tessuti muscolari di una varietà di animali. Poiché alcuni processi subcellulari utilizzano preferenzialmente il glicogeno come combustibile, è importante caratterizzare la posizione di queste riserve di combustibile. Inoltre, questo metodo fornisce la capacità di esaminare il metabolismo del glicogeno in diversi tipi di fibre muscolari, il che è importante nell'esercizio, dove l'affaticamento è glicogeno-dipendente solo in fibre selezionate. Una limitazione del metodo TEM è l'incapacità di rilevare piccole particelle di glicogeno, e questo è un problema in particolare per le condizioni in cui il glicogeno viene degradato, come durante la contrazione muscolare.
In conclusione, questa raccolta di metodi fornisce un esempio delle tecniche che vengono utilizzate per sondare la struttura del glicogeno e degli enzimi che regolano l'anabolismo e il catabolismo di questa macromolecola. Questi metodi saranno fondamentali per migliorare la nostra comprensione del metabolismo del glicogeno sia in condizioni fisiologiche che patologiche.