Articolo metodologico

Definizione del modello di sindrome del midollo centrale nel topo C57BL/6J

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DOI:

10.3791/65028

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8 settembre 2023

 ,  , 
1Department of Orthopaedics, Qilu Hospital of Shandong University, 2Department of Orthopaedics, Tianjin Medical University General Hospital

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

L'attuale protocollo che simula la sindrome del midollo centrale (CCS) nei topi ha migliorato la ripetibilità e ridotto al minimo i danni operativi agli animali da esperimento, evitando di interrompere eccessivamente la struttura anatomica. La strategia in questo studio è vantaggiosa perché consente la ricerca sui meccanismi di lesione producendo risultati coerenti.

Abstract

I modelli animali di sindrome del midollo centrale (CCS) potrebbero apportare notevoli benefici alla ricerca preclinica. I percorsi anatomici identificabili possono fornire approcci di esposizione minimamente invasivi e ridurre le lesioni extra agli animali da esperimento durante il funzionamento, consentendo il mantenimento di una morfologia anatomica coerente e stabile durante gli esperimenti per ridurre al minimo le differenze comportamentali e istologiche tra gli individui per migliorare la riproducibilità degli esperimenti. In questo studio, il midollo spinale di livello C6 è stato esposto utilizzando una piattaforma coassiale per lesioni del midollo spinale (SCICP) e la combinazione con una tecnica minimamente invasiva. Con l'assistenza di uno stabilizzatore vertebrale, abbiamo fissato le vertebre e compresso il midollo spinale di topi C57BL/6J con pesi da 5 g/mm2 e 10 g/mm2 con SCICP per indurre diversi gradi di lesione del midollo spinale C6. In linea con la precedente descrizione della CCS, i risultati rivelano che la lesione in questo modello è concentrata nella materia grigia intorno al midollo centrale, consentendo ulteriori ricerche sulla CCS. Infine, i risultati istologici sono forniti come riferimento per i lettori.

Introduzione

Negli ultimi anni si è assistito a un costante aumento dell'incidenza di lesioni del midollo spinale (SCI), con un maggior numero di lesioni nelle persone anziane causate da tauma1 meno violenta. Queste lesioni coinvolgono più frequentemente il rachide cervicale e più spesso portano a una disfunzione neurologica incompleta2.

Nel ventunesimo secolo, la CCS è il tipo più diffuso di lesione midollare incompleta, rappresentando più della metà di tutte le lesioni. Rispetto alla lesione midollare incompleta convenzionale, la CCS è caratterizzata da una compromissione sproporzionatamente maggiore degli arti superiori rispetto a quelli inferiori3. È caratterizzata da debolezza prevalentemente degli arti superiori con disfunzione sensoriale e vescicale meno significativa. Si ritiene che la CCS sia causata da emorragia ed edema post-traumatico della regione centrale o, come recentemente proposto, dalla degenerazione walleriana da compressione del midollo spinale nella stenosi del canale spinale. La gestione della CCS manca di evidenze di alto livello per guidare, il che richiede una comprensione completa della sua fisiopatologia4. Tuttavia, non sono stati segnalati modelli di CCS. Modelli animali adatti sono essenziali per la comprensione della fisiopatologia, che possono fornire una base di ricerca per studi clinici e preclinici 5,6,7,8,9,10.

In questo studio, viene stabilito un modello di CCS nei topi con una piattaforma coassiale per lesioni del midollo spinale (SCICP) e un piano operativo minimamente invasivo, che consente ulteriori ricerche e comprensione della CCS. Il modello si è dimostrato valido nel corso del processo di ricerca mediante analisi istologica, di risonanza magnetica (MRI) e di immunofluorescenza.

Protocollo

Gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato per l'etica e il benessere degli animali da laboratorio del Cheeloo College of Medicine dell'Università di Shandong (numero di approvazione: 22021). Sono stati eseguiti in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio pubblicata dal National Institutes of Health (NIH Publications No. 85-23, revisionato nel 1996). Tutti i topi utilizzati in questo studio erano topi femmina C57BL/6J di 9-10 settimane acquistati dalla Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, Cina). Un totale di 9 topi coinvolti in questo studio sono stati ugualmente randomizzati ai gruppi di controllo, lieve e grave. A 7, 28 e 70 giorni dopo l'infortunio, un topo di ogni gruppo è stato sacrificato.

1. Laminectomia C6 ed esposizione del midollo spinale

NOTA: L'esposizione è stata eseguita al microscopio. Il sanguinamento può essere evitato prestando attenzione a due aspetti: (i) Tutti i vasi sanguigni devono essere evitati. (ii) I muscoli devono essere separati nei punti di origine e di terminazione del muscolo.

  1. Preparare gli strumenti chirurgici e lo SCICP.
    NOTA: La struttura di SCICP è stata riportata in un precedente studio11. La differenza rispetto allo studio precedente è che il presente protocollo realizza la lesione del midollo spinale per compressione. Due pesi diversi (10,4 g e 20,8 g) di questa piattaforma possono produrre una compressione rispettivamente di 5 g/mm2 e 10 g/mm2 (Figura 1). L'esposizione del midollo spinale e le fasi di compressione sono mostrate nella Figura 2.
  2. Somministrare isoflurano al topo per inalazione utilizzando un cono nasale (induzione: 3%-5%, mantenimento: 1,5%-2%).
  3. Dopo che l'anestesia ha avuto effetto, esplora un piccolo rigonfiamento sulla linea mediana dietro il collo dei topi, che è il processo spinoso della seconda vertebra toracica (T2).
  4. Radere i peli intorno a questo rigonfiamento. Disinfettare la pelle con tre applicazioni alternate di una soluzione di iodoforo seguita da antisettici cutanei al 75% di etanolo.
  5. Posizionare il mouse prono sul tavolo operatorio. Applicare un unguento per gli occhi per proteggere gli occhi.
  6. Stendere un cuscinetto di 3-4 mm di spessore sotto il torace per consentire una curva arcuata del rachide cervicale, facilitando l'esposizione dello spazio interlamina e una via aerea non ostruita durante l'operazione. Iniettare buprenorfina come analgesia preoperatoria (0,05-0,1 mg/kg, SQ).
  7. Eseguire un'incisione longitudinale di 1-1,5 cm con un bisturi sterile centrato sul processo spinoso della 2avertebra toracica per esporre lo strato fasciale (Figura 2A).
  8. Rimuovere una porzione di tessuto adiposo al di sopra del T2 con microforbici sterili per trovare il processo spinoso del T2.
  9. Separare i muscoli trapezoidali e romboidali bilaterali da C5-T2 lungo la linea mediana con delle microforbici (Figura 2B).
  10. Separare i muscoli sulla lamina delle vertebre C5-T2 con microforbici e ritrarre lo strato muscolare ai lati con microdivaricatori sterili (Figura 2C).
  11. Tagliare i muscoli multifidi e spinali cervicali sulla superficie delle vertebre.
  12. Localizzare T2 in base al punto più alto dei processi spinosi. Sondare i processi spinosi successivamente verso l'estremità rostrale da T2 per localizzare C6 (Figura 3).
  13. Sollevare la lamina C6 con una pinza, tagliare la lamina e il midollo spinale è esposto (Figura 2D).

2. Lesione da compressione del midollo spinale cervicale

  1. Clamp le faccette articolari C6-7 con lo stabilizzatore vertebrale e bloccarlo (Figura 2E).
  2. Puntare la punta del peso sterile verso il midollo spinale esposto e assicurarsi che la parte inferiore piatta della punta sia posizionata parallelamente alla superficie dorsale del midollo spinale (Figura 2F).
  3. Regolare la manica in modo che il peso comprima il midollo spinale. Interrompere la regolazione quando il peso mantiene una posizione relativa costante con il midollo spinale (Figura 2G).
    NOTA: Non rendere questo processo troppo violento o rapido nel caso in cui il peso eserciti una forza di contusione sul midollo spinale.
  4. Rimuovere il peso e lo stabilizzatore vertebrale dopo una compressione di 5 minuti.
  5. Osservare le alterazioni del colore del midollo spinale dopo la compressione al microscopio (Figura 2H).
  6. Risciacquare con PBS sterile e utilizzare l'aspirazione per pulire il sito dell'operazione.
  7. Suturare i muscoli e la pelle a strati utilizzando una sutura non assorbibile in polipropilene (misura: 6-0).
  8. Disinfettare l'area chirurgica, posizionare il mouse su un tappetino caldo fino a quando il mouse non ripristina la piena coscienza, quindi riportare il mouse nella gabbia del mouse.
  9. Iniettare buprenorfina per analgesia (0,05-0,1 mg/kg, SQ) ogni 8-12 ore per 3 giorni.

3. Analisi istologica

  1. Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di tribromoetanolo all'1,25% (0,02 ml/g di peso corporeo) nei giorni 7, 28 o 70 dopo l'infortunio. Infondere per via transcardiaca il topo con 60 mL di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e 20 mL di paraformaldeide11 al 4%.
  2. Sezionare il midollo spinale a 0,5 cm dal centro della lesione da entrambi i lati con micro forbici e preservare la sezione lunga 1 cm.
  3. Immergere la sezione conservata del midollo spinale in saccarosio al 30% a 4 °C per 48 ore.
  4. Incorporare i tessuti con OCT, tagliare i tessuti in sezioni spesse 6 μm con un criotomo e raccogliere le sezioni su un vetrino.
  5. Colorazione con ematossilina ed eosina
    1. Risciacquare le sezioni da 6 μm con 1x PBS per 5 minuti 3 volte per rimuovere l'OCT residuo.
    2. Immergere le sezioni nell'ematossilina per 90 s. Lavare le sezioni sotto l'acqua corrente per 3 min.
    3. Immergere le sezioni in eosina per 4 min. Immergere in alcol al 95% per 30 secondi per rimuovere l'eosina in eccesso.
    4. Infine, disidratare i vetrini con alcol (alcol al 95% e alcol al 100% due volte, in successione) per 30 secondi e mettere i vetrini in un bagno di xilene per la pulizia per 2 minuti. Quindi, sigillare le sezioni con un vetro di copertura e gel di resina.
  6. Colorazione blu di Prussia
    1. Immergere i vetrini per 20 minuti in una miscela uguale di ferrocianuro di potassio (10%) e acido cloridrico (10%).
    2. Risciacquare 3 volte con acqua distillata e contromacchiare per 5 minuti con Nuclear Fast Red.
    3. Risciacquare tre volte con acqua distillata, seguito da un risciacquo con alcol al 95% e due risciacqui con alcol al 100% per 5 minuti.
    4. Pulire le sezioni in xilene due volte per 3 minuti ciascuna e poi sigillare con gel di resina12.
  7. Colorazione a immunofluorescenza
    1. Incubare i vetrini con i seguenti anticorpi primari per 1 ora a 37 °C: molecola 1 (Iba-1) di coniglio anti-ionizzata per legare il calcio (1:500), che è stata up-regolata nella microglia dopo lesione nervosa; proteina acida fibrillare anti-gliale di topo (GFAP) (1:300), che è espressa negli astrociti del sistema nervoso centrale; coniglio anti-neurofilamento-200 (NF-200) (1:2000), che è espresso nel neurofilamento.
    2. Incubare con anticorpi secondari per 1 ora a temperatura ambiente (RT): Alexa Fluor488 capra anti-topo e Alexa Fluor594 capra anti-coniglio (1:1.000).
    3. Scattare fotografie e analizzarle ulteriormente con un microscopio a fluorescenza13.

4. Risonanza magnetica per immagini

  1. Anestetizzare il topo a 7 giorni dall'infortunio con anestesia con isoflurano (1%-2% isoflurano, 20%-30% O2 ) somministrata attraverso una mini maschera.
  2. Scansionare il midollo spinale cervicale con orientamento sagittale. Utilizzare le seguenti impostazioni per l'imaging MRI: sequenza spin-echo (SE) in modo multislice e interleaved con TR/TE = 2500/12 ms, matrice di acquisizione = matrice 256 x 128 sul campo visivo (FOV) = 12 x 8 mm2, spessore della fetta = 1 mm e numero di eccitazioni (NEX) = 2.
    NOTA: Mantenere la frequenza respiratoria del mouse a 10-15/min durante la scansione per eliminare gli artefatti dell'immagine correlati alla respirazione14.

Risultati

La sezione sagittale di HE suggerisce che, anche se l'area danneggiata nella sostanza grigia era più ampia nel gruppo grave, era presente una continuità sulla sostanza bianca. Inoltre, la differenza nell'area della materia grigia danneggiata tra i gruppi gravi e lievi supporta la ragionevolezza dell'impostazione del gruppo nel protocollo (Figura 4).

Le sezioni coronali di HE mostrano che la lesione esiste principalmente nella sostanza grigia in entrambi i gruppi. Nel gruppo grave, la struttura della sostanza bianca che circonda la sostanza grigia aveva maggiori probabilità di essere influenzata, ma il contorno della sostanza bianca era ancora mantenuto (Figura 5). L'immunofluorescenza NF-200 suggerisce che, anche se la sostanza bianca che circonda la materia grigia è stata colpita nel gruppo grave, la sostanza bianca era ancora relativamente intatta. Questi risultati sono coerenti con le caratteristiche descritte per la CCS nel precedente studio4 (Figura 6).

Non sono stati trovati globuli rossi nelle sezioni sagittali di HE a 7 giorni dopo la lesione sia nel gruppo lieve che in quello grave. La colorazione blu di Prussia non ha rivelato emosiderosi nel gruppo lieve ma nel gruppo grave. Questi risultati indicano che l'incentivo di un'emorragia può richiedere un grado di danno relativamente grave (Figura 7).

L'immunofluorescenza ha rivelato aree di elevata espressione di GFAP e Iba-1 sia in lesioni lievi che gravi, suggerendo una risposta infiammatoria e la formazione di una cicatrice gliale nella lesione. Inoltre, il gruppo grave ha mostrato un'area di lesione più ampia rispetto al gruppo lieve (Figura 8).

La risonanza magnetica è un metodo relativamente minimamente invasivo per osservare il midollo spinale. I risultati suggeriscono che sia nel gruppo lieve che in quello grave, c'è un cambiamento di segnale ipointenso nella lesione con un contorno di segnale elevato. Il gruppo grave ha mostrato un'area di segnale ipointenso significativamente più ampia (Figura 9). Il segnale ipointenso suggerisce un precipitato dal lisato reticolocitario in quest'area e il segnale iperintenso circostante suggerisce una risposta infiammatoria. Abbiamo condotto diversi test comportamentali nel nostro studio precedente. Ad esempio, il test della forza di presa negli arti anteriori rivela una differenza significativa15.

Pesi e manicotto per l'impostazione del reometro; utilizzato negli esperimenti di misurazione della viscosità.
Figura 1: Il manicotto e i pesi di SCICP. La superficie della punta è stata progettata per essere di 1,3 mm x 1,6 mm in base all'area esposta del midollo spinale misurata dopo la laminectomia C6. Il peso è rivestito in PTFE, che riduce efficacemente l'attrito tra la parete interna del manicotto e il peso. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Sequenza della procedura chirurgica, passaggi A-H, dissezione tissutale, incisione, pinze, configurazione sperimentale.
Figura 2: Esposizione e compressione del midollo spinale. (A) Incisione longitudinale della pelle; (B) Separare i muscoli rostralmente dal processo spinoso T2; (C) Separare i muscoli sopra le lamine; (D) laminectomia C6; (E) Fissaggio del corpo vertebrale; (F) Determinazione del luogo di compressione; (G) Compressione del midollo spinale; (H) Nessun danno significativo alla sostanza bianca sopra il midollo spinale dopo la compressione del midollo spinale. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Diagramma anatomico dello scheletro che mostra la sesta vertebra cervicale e il processo spinoso T2.
Figura 3: Anatomia dello scheletro cervicale del topo. Il sito indicato dalla freccia è il processo spinoso T2. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Pannello di vetrini istologici, tessuti a vari stadi di infezione, da lieve a grave, barre graduate da 1 mm.
Figura 4: Le sezioni sagittali colorate con HE. (A) Sezione sagittale del midollo spinale cervicale. (B,C) Il gruppo Grave ha avuto danni più gravi rispetto al gruppo Lieve, ma entrambi si sono concentrati sulla materia grigia intorno al midollo centrale. Le immagini a 7, 28 e 70 dpi non suggeriscono alcuna differenza significativa nell'espressione della lesione nello stesso gruppo di lesioni in periodi diversi e che la continuità della sostanza bianca nel midollo spinale superiore e inferiore viene mantenuta. Barra della scala: 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Confronto istologico tissutale, 28 dpi; controllo, lieve e grave degenerazione nervosa; immagine al microscopio.
Figura 5: Lesioni del midollo spinale cervicale con sezioni coronali colorate con HE. (A-C) La lesione colpisce principalmente la materia grigia che circonda il midollo centrale, come si vede nei pannelli B e C. Il gruppo con lesioni gravi soffre di una gamma più ampia di danni rispetto al gruppo con lesioni lievi, che ha maggiori probabilità di influenzare la sostanza bianca. Barra graduata: 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Microscopia del midollo spinale, colorazione NF-200; Sezioni trasversali: di controllo, lieve, grave; Analisi a 28 dpi.
Figura 6: Immunofluorescenza coronale NF-200 dopo lesione. Risposta NF-200 senza differenze significative al contorno della sostanza bianca. Barra graduata: 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Confronto istologico; controllo, lieve, grave danno tissutale a 7 dpi; immagini di diapositive; Scala da 400 μm.
Figura 7: Colorazione blu di Prussia. (A-C) L'emosiderosi è stata osservata nel gruppo grave ma non nel gruppo lieve. Barra graduata: 400 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Microscopia a immunofluorescenza che mostra le espressioni dei marcatori Iba1 e GFAP con immagini unite.
Figura 8: GFAP sagittale e immunofluorescenza Iba-1 dopo lesione. (A-C) All'aumentare del grado di lesione, aumenta l'area di risposta GFAP e Iba-1. Barra della scala: 1 mm. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Analisi MRI della curvatura spinale confrontando casi di controllo, lievi e gravi a 7 dpi.
Figura 9: Risonanza magnetica sagittale dopo lesione del midollo spinale cervicale (immagini pesate in T2). La regione della lesione è stata osservata come un segnale ipointenso nei gruppi con lesioni lievi e gravi, con un'area significativamente più ampia di segnale ipointenso nel gruppo con lesioni gravi. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussione

Tra i numerosi tipi di lesione del midollo spinale, la CCS è uno dei tipi di lesione potenzialmente più curabili 3,4. A causa della mancanza di modelli di ricerca di laboratorio, la ricerca sulla CCS degli anni '50 si è concentrata su studi clinici e indagini di dissezione cadaverica 3,16,17. Il presente studio mostra l'utilizzo di strumenti compatibili e procedure minimamente invasive per stabilire il modello CCS dei topi. Da un punto di vista tecnico, questa piattaforma ha una forte operabilità e una buona riproducibilità. Dato che i risultati dell'esperimento dimostrano la validità, la nostra tecnica per stabilire il modello più vicino allo standard che gli studi precedenti hanno definito per CCS4.

Precedenti studi sulle lesioni da compressione hanno impiegato principalmente clip per aneurisma, palloncini e pinze calibrate 9,10,18. Inoltre, la maggior parte delle lesioni si è verificata a livello del midollo spinale toracico18. Il midollo spinale a livello C6 è stato scelto come segmento danneggiato in questo studio per studiare le caratteristiche della CCS. Vale la pena sottolineare che anche il tasso di sopravvivenza del modello CCS è un fattore essenziale per garantire la coerenza sperimentale. Il presente studio riporta che causano lesioni da compressione bilaterale al midollo spinale cervicale del topo, mentre lesioni traumatiche del midollo spinale di alto livello, in particolare lesioni bilaterali, potrebbero essere fatali per gli animali da esperimento se troppo gravi. Secondo El-Bohy, è più probabile che il midollo spinale C4/5 influenzi il tratto bulbospinale discendente e i motoneuroni respiratori, il che porta gli animali da esperimento alla depressione respiratoria e alla morte 18,19,20,21,22,23., In questo studio, i topi con diversi gradi di compressione sul midollo spinale cervicale C6 hanno caratteristiche di lesione significativamente differenziate suggerite da esami istologici. Sebbene ci fossero significative differenze comportamentali e istologiche nel modello di clampaggio del midollo spinale cervicale del topo riportato da Forgione, era necessaria l'interruzione dei peduncoli, dei processi articolari, delle lamine e persino delle radici nervose per bloccare il midollo spinale con le pinze modificate, che avevano un'influenza significativa sulla stabilità delle strutture cervicali24. Un altro studio sulle lesioni cervicali ha riportato l'utilizzo del processo trasverso come sito di fissazione5. Anche se i processi articolari sono stati impediti dal danno, la rottura del tessuto muscolare eccessivo potrebbe anche portare a un impatto sulla stabilità del midollo spinale. Nel presente studio, solo la 6alamina cervicale è stata resecata per mantenere la stabilità del midollo spinale cervicale, con le articolazioni articolari adiacenti preservate e danni muscolari eccessivi evitati. Allo stesso tempo, la compressione dall'alto del midollo spinale previene i danni alle radici nervose.

I risultati di HE suggeriscono che l'area di danno al midollo spinale cervicale dei topi in ciascun gruppo era principalmente nella materia grigia vicino al midollo centrale, che caratterizzava la CCS, con differenze significative nella portata della lesione tra i diversi gruppi. In particolare, le sezioni patologiche che abbiamo mostrato potrebbero aver alleviato la manifestazione della lesione perché i campioni sono stati raccolti pochi giorni dopo l'infortunio. L'immunofluorescenza (NF-200) ha mostrato meno danni ai tratti neurali nella regione della sostanza bianca del midollo spinale, il che ha anche confermato che il danno nella CCS era principalmente concentrato intorno al midollo centrale. Il risultato dell'immunofluorescenza è stato aggravato da precedenti risultati istologici di patologia. Studi precedenti hanno dimostrato che la CCS porta all'edema vicino al midollo centrale, portando all'ematoma e, infine, alla disfunzione nella porzione mediale del tratto corticospinale laterale3. L'emorragia è stata segnalata come una componente tipica della CCS, ma è stata osservata raramente nei successivi studi di imaging e autopsia17. In questo studio, i risultati dell'HE a 7 giorni dopo l'infortunio hanno suggerito segni di edema tissutale in tutti i gruppi; Tuttavia, non sono stati trovati globuli rossi residui nell'area della lesione. Pertanto, il blu di Prussia è stato utilizzato per esaminare l'area della lesione per l'emorragia e i risultati corrispondevano all'emosiderosi osservata nell'area della lesione del gruppo con lesioni gravi a 7 giorni dopo l'infortunio, mentre il gruppo con lesioni lievi non lo ha fatto. Le immagini della risonanza magnetica T2 hanno mostrato che sia le lesioni lievi che quelle gravi avevano aree a basso segnale nell'area danneggiata della lesione a 7 giorni dopo l'infortunio. indicando qui la deposizione di lisato di reticolociti. Questi risultati forniscono prove circostanziali che la discrepanza tra i risultati precedentemente riportati è probabilmente dovuta al fatto che il test di risonanza magnetica è potenzialmente più sensibile del test istologico14, oltre alla gravità della lesione, che può anche influenzare la quantità di emorragia nell'area della lesione. Anche la GFAP è stata ampiamente espressa nell'area danneggiata. Allo stesso tempo, l'espressione di Iba-1 è stata osservata anche in aree intatte, suggerendo la persistenza di una risposta infiammatoria, coerente con i risultati della risonanza magnetica, dove un anello di segnale iperintenso intorno all'area del segnale ipointenso nella lesione suggerisce la presenza di una risposta infiammatoria. In definitiva, sulla base dei risultati del presente studio, l'area di lesione nel modello si è concentrata sulla materia grigia intorno al midollo centrale, che è generalmente coerente con le descrizioni precedentemente riportate13. Sfortunatamente, non abbiamo eseguito la risonanza magnetica ripetutamente in tutti gli animali da esperimento per mostrare come il sito della lesione cambia dinamicamente nel tempo. I futuri ricercatori possono includere questo aspetto nel loro lavoro per una migliore indagine sulla CCS. Inoltre, l'immunomarcatura con marcatori neuronali come NeuN, che definiscono la materia grigia, può essere inclusa nello studio.

In conclusione, le caratteristiche dei risultati sulla patologia e sulle scansioni MRI hanno strette somiglianze con quelle descritte per la CCS in studi precedenti4. L'attuale protocollo, che modella in modo fattibile la CCS, consente ulteriori ricerche e comprensione della CCS.

Dichiarazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Ringraziamenti

Questo studio è stato supportato dal National Key Research and Development Project of Stem Cell and Transformation Research (2019YFA0112100) e dallo State Key Program of National Natural Science of China (81930070).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Soluzione fissativa al 4%SolarbioP1110
Anticorpo polipeptidico pesante anti-neurofilamentoAbcamab8135Rapporto di diluizione (1:2000)
Soluzione colorante con eosina (solubile in acqua)BiosharpBL727B
ReagenteFuyu etanolo
Microscopio a fluorescenzaKEYENCEBZ-X800
Affettatrice SurgelataLeica
GFAP (GA5) Mouse mAb Cell Signaling TECHNOLOGY#3670Rapporto di diluizione (1:600)
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-topo di capra (H+L), Alexa Fluor Plus 488ThermoFisher SCIENTIFICA32723TRRapporto di diluizione (1:1000)
Anticorpo secondario altamente adsorbito anti-coniglio di capra (H+L), Alexa Fluor Plus 594ThermoFisher SCIENTIFICA32740Rapporto di diluizione (1:1000)
Ematossilina Soluzione coloranteBiosharpBL702A
TopiJinan Pengyue Animale sperimentaleCompany C57BL/6J 
Apparecchio per microchirurgia Shandong ULT Biotechnology Co., LtdTutti gli strumenti chirurgici sonoforbici oftalmiche su misura, micro pinze per zanzare, pinze per microchirurgia, micro forbici
Siero di pecora normale per il blocco (soluzione di lavoro)Zhong Shan Jin QiaoZLI-9022soluzione di lavoro
O.C.T. CompostoSAKURA4583
Soluzione tamponata con fosfato (PBS) SolarbioP1020pH 7.2– 7.4
Kit per la colorazione del ferro blu di Prussia (con eosina)SolarbioG1424
RWD Stazione di anestesia per inalazione da laboratorioRWD Life Science Co., LtdR550
Sistema di imaging microCT in vivo per piccoli animaliPerkinElmer Quantum GX2
Piattaforma coassiale per lesioni del midollo spinaleShandong ULT Biotechnology Co., LtdSu misura (standard di Feng)https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~
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dbacbba& sf=qq_sm& is_share=
1& shopAutoEnter=1& share_cmpt
=native_wechat& is_silence_auth=1
Microscopio chirurgico Zumax  Fornitore verificato - Medical Co., Ltd.zumax, OMS2355
Tris Soluzione salina+Tween tamponata (TBST)SolarbioT1082di diluizione (1:19)
Reagentexilene
al 4% Rapporto Fuyu

Riferimenti

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