Articolo metodologico

Assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo su chip per la bioingegneria

DOI:

10.3791/65032

⸱

17 marzo 2023

 ,  , 
1Laboratory of Physical Chemistry and Soft Matter, Wageningen University & Research

* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Il presente protocollo descrive l'assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo (OLA), una tecnica microfluidica per generare liposomi biocompatibili. OLA produce liposomi monodispersi di dimensioni micron con un incapsulamento efficiente, consentendo una sperimentazione immediata su chip. Si prevede che questo protocollo sia particolarmente adatto per la biologia sintetica e la ricerca sulle cellule sintetiche.

Abstract

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La microfluidica è uno strumento ampiamente utilizzato per generare goccioline e vescicole di vario tipo in modo controllato e ad alto rendimento. I liposomi sono semplicistiche imitazioni cellulari composte da un interno acquoso circondato da un doppio strato lipidico; Sono preziosi nella progettazione di cellule sintetiche e nella comprensione dei fondamenti delle cellule biologiche in vitro e sono importanti per le scienze applicate, come la consegna del carico per applicazioni terapeutiche. Questo articolo descrive un protocollo di lavoro dettagliato per una tecnica microfluidica su chip, l'assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo (OLA), per produrre liposomi biocompatibili monodispersi, di dimensioni micron. L'OLA funziona in modo simile al soffiaggio delle bolle, in cui una fase acquosa interna (IA) e una fase circostante di 1-ottanolo che trasporta lipidi vengono pizzicate da flussi di fluidi esterni contenenti tensioattivi. Questo genera prontamente goccioline a doppia emulsione con tasche sporgenti di ottanolo. Mentre il doppio strato lipidico si assembla all'interfaccia delle gocce, la tasca si stacca spontaneamente per dare origine a un liposoma unilamellare pronto per ulteriori manipolazioni e sperimentazioni. L'OLA offre diversi vantaggi, come la generazione costante di liposomi (>10 Hz), l'incapsulamento efficiente di biomateriali e le popolazioni di liposomi monodispersi, e richiede volumi di campione molto piccoli (~ 50 μL), che possono essere cruciali quando si lavora con preziosi biologici. Lo studio include dettagli sulla microfabbricazione, la litografia morbida e la passivazione superficiale, necessari per stabilire la tecnologia OLA in laboratorio. Un'applicazione di biologia sintetica proof-of-principle è anche mostrata inducendo la formazione di condensati biomolecolari all'interno dei liposomi attraverso il flusso protonico transmembrana. Si prevede che questo protocollo video di accompagnamento faciliterà i lettori a stabilire e risolvere i problemi OLA nei loro laboratori.

Introduzione

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Tutte le cellule hanno una membrana plasmatica come confine fisico, e questa membrana è essenzialmente un'impalcatura sotto forma di un doppio strato lipidico formato dall'auto-assemblaggio di molecole lipidiche anfifiliche. I liposomi sono le controparti sintetiche minime delle cellule biologiche; Hanno un lume acquoso circondato da fosfolipidi, che formano un doppio strato lipidico con i gruppi di testa idrofili rivolti verso la fase acquosa e le code idrofobiche sepolte verso l'interno. La stabilità dei liposomi è governata dall'effetto idrofobico, così come dall'idrofilia tra i gruppi polari, dalle forze di van der Waals tra le code di carbonio idrofobiche e dal legame idrogeno tra le molecole d'acqua e le teste idrofile 1,2. A seconda del numero di doppi strati lipidici, i liposomi possono essere classificati in due categorie principali, vale a dire vescicole unilamellari che comprendono un singolo doppio strato e vescicole multilamellari costruite da più doppi strati. Le vescicole unilamellari sono ulteriormente classificate in base alle loro dimensioni. Tipicamente di forma sferica, possono essere prodotte in una varietà di dimensioni, tra cui piccole vescicole unilamellari (SUV, diametro 30-100 nm), grandi vescicole unilamellari (LUV, diametro 100-1.000 nm) e, infine, vescicole unilamellari giganti (GUV, diametro >1.000 nm)3,4. Sono state sviluppate varie tecniche per produrre liposomi, e queste possono essere categorizzate ampiamente in tecniche di massa5 e tecniche microfluidiche6. Le tecniche di massa comunemente praticate includono la reidratazione del film lipidico, l'elettroformazione, il trasferimento di emulsione invertita e l'estrusione 7,8,9,10. Queste tecniche sono relativamente semplici ed efficaci, e queste sono le ragioni principali per il loro uso diffuso nella comunità della biologia sintetica. Tuttavia, allo stesso tempo, soffrono di gravi inconvenienti per quanto riguarda la polidispersità delle dimensioni, la mancanza di controllo sulla lamellarità e la bassa efficienza di incapsulamento 7,11. Tecniche come l'incapsulamento continuo dell'incrocio dell'interfaccia delle gocce (cDICE)12 e il tiro delle gocce e la filtrazione dimensionale (DSSF)13 superano in una certa misura queste limitazioni.

Gli approcci microfluidici sono saliti alla ribalta nell'ultimo decennio. La tecnologia microfluidica fornisce un ambiente controllabile per la manipolazione dei flussi di fluidi all'interno di microcanali definiti dall'utente grazie al caratteristico flusso laminare e al trasferimento di massa dominato dalla diffusione. I dispositivi lab-on-a-chip risultanti offrono possibilità uniche per il controllo spaziotemporale delle molecole, con volumi di campione significativamente ridotti e capacità di multiplexing14. Sono stati sviluppati numerosi metodi microfluidici per produrre liposomi, tra cui getto pulsato 15, doppia emulsione templante 16, espulsione transitoria della membrana 17, trasferimento di emulsione di goccioline18 e focalizzazione idrodinamica 19. Queste tecniche producono liposomi monodispersi, unilamellari, delle dimensioni di cellule con elevata efficienza di incapsulamento e alta produttività.

Questo articolo descrive in dettaglio la procedura per l'assemblaggio di liposomi assistiti da ottanolo (OLA), un metodo microfluidico su chip basato sul pinch-off idrodinamico e sul successivo meccanismo di deumidificazione con solvente20 (Figura 1). Si può mettere in relazione il funzionamento dell'OLA con un processo di soffiaggio delle bolle. Una giunzione a sei vie focalizza la fase acquosa interna (IA), due flussi organici che trasportano lipidi (LO) e due flussi acquosi esterni (OA) contenenti tensioattivi in un singolo punto. Ciò si traduce in goccioline di doppia emulsione acqua-in-(lipidi + ottanolo)-in-acqua. Mentre queste goccioline fluiscono a valle, la minimizzazione dell'energia interfacciale, il flusso di taglio esterno e l'interazione con le pareti del canale portano alla formazione di un doppio strato lipidico all'interfaccia quando la tasca del solvente si stacca, formando così liposomi unilamellari. A seconda delle dimensioni della tasca di ottanolo, il processo di deumidificazione può richiedere da decine di secondi a un paio di minuti. Alla fine del canale di uscita, le goccioline di ottanolo meno dense galleggiano in superficie, mentre i liposomi più pesanti (a causa di una soluzione incapsulata più densa) affondano sul fondo della camera di visualizzazione pronti per la sperimentazione. Come esperimento rappresentativo, viene dimostrato il processo di separazione di fase liquido-liquido (LLPS) all'interno dei liposomi. Per questo, i componenti richiesti sono incapsulati all'interno di liposomi a un pH acido che impedisce LLPS. Innescando esternamente un cambiamento di pH e, quindi, un flusso protonico transmembrana, si formano goccioline di condensa separate dalla fase all'interno dei liposomi. Ciò evidenzia le effettive capacità di incapsulamento e manipolazione del sistema OLA.

Protocollo

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1. Fabbricazione del master wafer

  1. Prendi un wafer di silicio pulito da 4 pollici (10 cm) di diametro (vedi Tabella dei materiali). Pulirlo ulteriormente utilizzando aria pressurizzata per rimuovere eventuali particelle di polvere.
  2. Montare il wafer su un rivestimento rotante e erogare delicatamente ~ 5 ml di un fotoresist negativo (vedi Tabella dei materiali) al centro del wafer. Cerca di evitare bolle d'aria, poiché potrebbero interferire con il processo di stampa a valle del wafer.
  3. Per ottenere uno strato di fotoresist spesso 10 μm, rivestire il wafer a 500 giri/min per 30 s con un'accelerazione di 100 giri/min per la diffusione iniziale, seguita da uno spin di 60 s a 3.000 giri/min con un'accelerazione di 500 giri/min. Nel caso in cui si desideri uno spessore diverso, modificare i parametri di rotazione secondo le istruzioni del produttore.
  4. Cuocere la cialda su una piastra riscaldante per 2 min a 65 °C e poi per 5 min a 95 °C.
  5. Una volta che il wafer si è raffreddato, montare il wafer nella camera di stampa della macchina litografica ottica a scrittura diretta (vedere Tabella dei materiali) e inserire il progetto OLA (Figura 2A, Supplementary Coding File 1) nel software.
    NOTA: Il progetto OLA consiste essenzialmente di due canali OA, due canali LO e un canale IA, che si fondono per formare una giunzione a sei vie che continua come canale di post-produzione e finisce nel pozzo sperimentale (EW).
  6. Stampare il/i disegno/i OLA sul wafer rivestito utilizzando un laser UV (vedere Tabella dei materiali) con una dose di 300 mJ/cm2.
  7. Una volta stampato il disegno, cuocere il wafer a 65 °C per 1 minuto, seguito da 95 °C per 3 minuti.
  8. A questo punto, assicurati che il contorno del dispositivo stampato appaia sul wafer e sia visibile ad occhio nudo. Per lavare via il fotoresist non polimerizzato, immergere il wafer in un becher di vetro contenente la soluzione di sviluppo (vedere Tabella dei materiali) fino a quando il fotoresist non polimerizzato non è completamente rimosso.
    NOTA: un trattamento eccessivo da parte dello sviluppatore può influire sulla risoluzione di progettazione.
  9. Lavare il wafer con acetone, isopropanolo e acqua deionizzata (DI) in sequenza e, infine, con aria pressurizzata / N2 usando una pistola a cerbottana.
  10. Cuocere a fatica il wafer a 150 °C per 30 minuti per assicurarsi che il disegno stampato sia saldamente fissato alla superficie del wafer e non si stacchi nel processo di fabbricazione a valle. Il wafer master è quindi pronto per un ulteriore utilizzo (Figura 2B).

2. Preparazione del dispositivo microfluidico

  1. Posizionare il wafer master su un pezzo quadrato di alluminio e avvolgere il foglio di alluminio attorno al wafer, formando una struttura simile a un pozzo (Figura 2C).
  2. Misurare 40 g di polidimetilsilossano (PDMS) e 4 g di agente di polimerizzazione (10:1, rapporto peso, vedere tabella dei materiali) in una provetta da centrifuga da 50 mL e mescolare energicamente con una spatola o una punta di pipetta per 2-3 minuti.
  3. La miscelazione vigorosa del PDMS e dell'agente di polimerizzazione intrappola le bolle d'aria all'interno della miscela. Ruotare il tubo a 100 x g per 2-3 minuti per rimuovere la maggior parte delle grandi bolle d'aria.
  4. Versare circa 15-20 g della miscela preparata al punto 2.3 sul wafer principale e degassare utilizzando un essiccatore. Conservare la miscela in eccesso per realizzare vetrini rivestiti con PDMS (fase 3).
  5. Incubare il gruppo in forno a 70 °C per almeno 2 ore.
  6. Togliere la cialda master dal forno e lasciarla raffreddare. Per rimuovere il blocco PDMS solidificato, rimuovere il foglio di alluminio e staccare con attenzione il blocco PDMS dal bordo del wafer.
    NOTA: il wafer è fragile e potrebbe rompersi, quindi è importante eseguire questo processo con attenzione.
  7. Una volta rimosso il blocco PDMS, mantenere la struttura modellata rivolta verso l'alto e, utilizzando una lama affilata o un bisturi, tagliare singoli blocchi PDMS, ciascuno contenente un singolo dispositivo microfluidico.
  8. Posizionare il blocco PDMS su una superficie scura e regolare la direzione della luce (una lampada da tavolo è utile per questo) in modo che i canali incisi siano lucidi e, di conseguenza, visibili. Praticare fori negli ingressi e nel canale di uscita utilizzando punzoni bioptici di 0,5 mm e 3 mm di diametro (vedi Tabella dei materiali), rispettivamente.
    NOTA: Utilizzare un punzone bioptico affilato per evitare crepe nel PDMS, che possono causare perdite in seguito. Spingere delicatamente il pugno bioptico attraverso il blocco PDMS e assicurarsi che passi completamente attraverso di esso. Per rimuovere il punzone della biopsia, ritrarlo delicatamente mentre lo si ruota in direzioni alternative. Il blocco PDMS con il design OLA inciso è ora pronto per essere legato a un vetrino rivestito PDMS.

3. Realizzare la diapositiva in vetro rivestito PDMS

  1. Prendere un vetrino trasparente, versare circa 0,5 ml di PDMS (preparato in eccesso al punto 2.4) sul centro del vetrino e distribuirlo sul vetrino inclinando delicatamente il vetrino, assicurando una copertura totale del vetrino con PDMS.
  2. Montare il vetrino sul rivestimento di rotazione, assicurarne la posizione centrale (in modo che il centro della slitta si sovrapponga al centro dell'albero di pressione) e ruotare il vetrino a 500 giri/min per 15 s (con un incremento di 100 giri/min) e poi a 1.000 giri/min per 30 s (con un incremento di 500 giri/min).
  3. Posizionare il vetrino rivestito PDMS (lato rivestito rivolto verso l'alto) su una piattaforma rialzata come un blocco di PDMS (1 cm x 1 cm) in una piastra di Petri coperta e cuocere a 70 °C per 2 ore.

4. Incollaggio del dispositivo microfluidico

  1. Pulire il blocco PDMS (preparato al punto 2) incollando e rimuovendo due volte lo scotch disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali). Assicurarsi di tenere il lato pulito rivolto verso l'alto fino all'uso.
  2. Pulire il vetrino rivestito PDMS con aria pressurizzata/N2 con una pistola a soffiaggio e mantenere il lato pulito rivolto verso l'alto.
  3. Posizionare il blocco PDMS (canali incisi rivolti verso l'alto) e il vetrino rivestito PDMS (lato rivestito rivolto verso l'alto) nella camera a vuoto dell'aspirapolvere dell'aspirapolvere (vedere Tabella dei materiali).
  4. Accendere il vuoto ed esporre il contenuto al plasma dell'aria a una frequenza radio di 12 MHz (modalità RF alta) per 15 s per attivare le superfici. Il plasma di ossigeno può essere visto sotto forma di una tonalità rosata.
  5. Immediatamente dopo il trattamento al plasma, posizionare il vetrino rivestito PDMS su una superficie pulita con il lato PDMS rivolto verso l'alto. Posizionare delicatamente il blocco PDMS con il modello microfluidico ora rivolto verso il vetrino rivestito PDMS, consentendo loro di aderire (Figura 2D).
    NOTA: la rimozione dell'aria intrappolata nel dispositivo è fondamentale per garantire un legame completo.
  6. Cuocere i dispositivi incollati a 70 °C per 2 ore.

5. Funzionalizzazione superficiale del dispositivo microfluidico

NOTA: Prima della funzionalizzazione della superficie, è importante calibrare la pompa di pressione secondo il protocollo del produttore (vedere la tabella dei materiali) e assemblare il tubo per collegarlo al dispositivo microfluidico.

  1. Collegamento del dispositivo microfluidico alle pompe a pressione
    1. Collegare il regolatore di flusso azionato dalla pressione a una fonte di pressione esterna (fino a 6 bar). Sono necessari almeno quattro canali di pressione dell'aria indipendenti: tre moduli singoli di 0-2 bar e un modulo di -0,9-4 bar.
    2. Calibrare la pompa a pressione secondo il protocollo del produttore (vedere Tabella dei materiali).
    3. Tagliare il tubo (1/16 in OD x 0,02 in ID) in quattro pezzi di dimensioni uguali di circa 20 cm di lunghezza.
    4. Inserire connettori piegati a 90° in acciaio inossidabile da 23 G (vedere la tabella dei materiali) ad un'estremità di ciascun pezzo. Questa estremità viene successivamente inserita nei tre ingressi (OA, LO e IA) del dispositivo microfluidico e la quarta viene utilizzata per rimuovere la soluzione in eccesso (fase 5.2.5).
    5. Inserire l'altra estremità del tubo nel supporto del serbatoio microfluidico e sigillarlo utilizzando raccordi microfluidici, assicurandosi che il tubo sia abbastanza lungo da toccare il fondo del serbatoio (tubi da 1,5 ml, vedere Tabella dei materiali). Ciò impedisce alle bolle d'aria indesiderate di entrare nel dispositivo microfluidico durante il trattamento PVA / produzione di liposomi.
  2. Trattamento PVA del canale di uscita
    NOTA: Prima della generazione del liposoma, è fondamentale rendere il dispositivo parzialmente idrofilo a valle della giunzione di produzione. Questo viene fatto trattando questi canali con una soluzione di alcol polivinilico (PVA) al 5% (p/v). La soluzione di PVA viene preparata sciogliendo la polvere di PVA (vedi Tabella dei materiali) in acqua a 80 °C per 3 ore con agitazione costante utilizzando un agitatore magnetico. Filtrare la soluzione prima di utilizzarla per il trattamento superficiale. Immediatamente dopo il legame del dispositivo, i canali microfluidici sono idrofili a causa dell'attivazione superficiale indotta dal plasma e gradualmente diventeranno nuovamente idrofobici. Si consiglia di attendere 2 ore dopo la cottura (fase 4.6) prima di iniziare il trattamento PVA.
    1. Erogare 200 μL di soluzione PVA al 5% p/v in un tubo da 1,5 mL e collegarlo al supporto del serbatoio microfluidico. Inserire il tubo (quello menzionato al punto 5.1.3) in modo che un'estremità sia immersa nella soluzione PVA e l'altra estremità sia collegata all'ingresso del canale OA del dispositivo microfluidico.
      NOTA: una concentrazione inferiore di PVA può portare a una funzionalizzazione superficiale inferiore agli standard.
    2. Ripetere il passaggio precedente senza PVA (tubo vuoto da 1,5 ml) e collegarlo ai canali LO e IA.
    3. Aumentare la pressione della fase OA a 100 mbar per far fluire la soluzione PVA nei canali OA. Aumentare le pressioni delle fasi IA e LO a 120 mbar per evitare il riflusso della soluzione PVA all'interno di questi canali (Figura 2E).
      NOTA: Se necessario, regolare le pressioni dei singoli canali per mantenere stabile il menisco alla giunzione di produzione.
    4. Far scorrere la soluzione PVA in questo modo per circa 5 minuti, garantendo la completa funzionalizzazione del canale di uscita.
    5. Per rimuovere la soluzione PVA, staccare il tubo dall'ingresso OA e aumentare immediatamente la pressione nei canali LO e IA a 2 bar. Contemporaneamente, utilizzare un tubo collegato a un canale a pressione negativa (-900 mbar) rimuovere il PVA in eccesso prima dal canale di uscita e poi dall'ingresso OA (Figura 2F).
    6. Cuocere il dispositivo a 120 °C per 15 minuti e lasciarlo raffreddare prima dell'uso. Il dispositivo può essere conservato in condizioni ambientali per almeno 1 mese.
      NOTA: Si raccomanda di attendere 1 giorno (a temperatura ambiente) prima di procedere con OLA per assicurarsi che il PDMS non trattato riacquisti la sua idrofobicità dopo il trattamento al plasma.

6. Assemblaggio liposomico assistito da ottanolo (OLA)

  1. Preparazione dello stock lipidico
    NOTA: Qui si usa come esempio una miscela di lipidi 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC) e 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfoetanolammina-N-(lissamina rodamina B sulfonile) (Liss Rhod PE) (vedi tabella dei materiali); Gli utenti dovrebbero preparare la composizione lipidica di cui hanno bisogno in modo simile.
    1. Erogare 76 μL di DOPC (25 mg/ml) e 16,6 μL di Liss Rhod PE (1 mg/ml) in un matraccio a fondo tondo utilizzando siringhe di vetro separate.
    2. Tenere il matraccio a fondo rotondo in posizione verticale e utilizzare una pistola a soffiaggio compressa N2 per dare un leggero flusso di azoto per far evaporare il cloroformio e formare un film lipidico essiccato sul fondo del pallone.
    3. Introdurre il matraccio nell'essiccatore per almeno 2 ore sotto vuoto continuo per eliminare eventuali residui di cloroformio.
    4. Aggiungere 100 μL di etanolo nel matraccio a fondo arrotondato, seguito da un leggero pipettaggio o agitazione per assicurarsi che i lipidi siano sciolti per formare uno stock lipidico al 10% (p/v).
      NOTA: Nel caso in cui una particolare composizione lipidica non sia completamente solubile in etanolo, utilizzare una miscela di etanolo/cloroformio, mantenendo il volume di cloroformio il più piccolo possibile.
    5. Pipettare la soluzione in un flaconcino di vetro scuro. Lavare delicatamente il flaconcino con azoto usando una pistola per sostituire l'aria con un'atmosfera inerte. Sigillare il coperchio con pellicola di paraffina e conservare a -20 °C.
      NOTA: la soluzione madre può essere utilizzata per un massimo di alcuni mesi. Ogni volta che la fiala viene aperta, sostituire delicatamente l'aria con azoto e richiudere con coperchio con pellicola di paraffina.
  2. Preparazione delle soluzioni OLA
    1. Realizzare soluzioni stock dei componenti indispensabili: 20 mM dextran (Mw 6.000); 60% (v/v) glicerolo; un buffer di scelta. In questo caso, è stata preparata una soluzione salina tamponata con fosfato 5x (0,68 M NaCl, 13,5 mM KCl, 50 mM Na 2HPO 4, 9 mM KH2PO 4; pH 7,4) (vedi tabella dei materiali).
      NOTA: Poiché il glicerolo puro è altamente viscoso, si consiglia di tagliare un piccolo pezzo all'estremità della punta della pipetta in modo obliquo per un pipettaggio efficace.
    2. Preparare 100 μL di campioni di IA, OA e soluzione di uscita (ES, la soluzione desiderata per riempire l'EW). Per facilitare la visualizzazione, la proteina fluorescente gialla (YFP) è stata aggiunta alla soluzione IA in questo caso particolare. Controllare l'equilibrio osmotico tra IA e OA calcolando l'osmolarità dei componenti incapsulati e aggiungendo una quantità appropriata di zucchero o sale nell'OA, se necessario. Questo viene fatto al fine di prevenire lo scoppio o il restringimento dei liposomi durante la produzione.
      NOTA: Le composizioni finali delle tre fasi sono le seguenti:
      IA: 15% glicerolo, 5 mM destrano (Mw 6.000), 5,4 μM YFP, 1x PBS
      OA: 15% glicerolo, 5% tensioattivo F68, 1x PBS
      ES: 15% glicerolo, 1x PBS
      Una concentrazione inferiore di tensioattivo F68 influisce negativamente sulla generazione di doppie emulsioni.
    3. Preparare 80 μL della fase LO pipettando 4 μL di lipidi madre in 76 μL di 1-ottanolo (vedere Tabella dei materiali). La concentrazione finale di DOPC è di 5 mg/ml.
    4. Centrifugare i campioni a 700 x g per 60 s per rimuovere eventuali aggregati di grandi dimensioni prima di procedere con gli esperimenti microfluidici. Ciò impedisce a qualsiasi evidente fattore di intasamento di entrare nel chip microfluidico.
  3. Produzione di liposomi
    1. Erogare le soluzioni (IA, LO, OA) in tre provette da 1,5 ml, assemblarle (come indicato al punto 5.1) e collegarle al chip microfluidico trattato con PVA (fase 5.2.6).
    2. Applicare una pressione positiva sui tre canali: ~100 mbar sui canali IA e LO e ~200 mbar sul canale OA.
      NOTA: Poiché la pressione OA è superiore alle altre, la soluzione OA sarà la prima ad arrivare a EW; Questo è altamente raccomandato.
    3. Una volta che la soluzione OA raggiunge EW, diminuire la pressione OA a 100 mbar e aumentare il LO a 200 mbar.  La soluzione LO che arriva alla giunzione di produzione comporterà probabilmente bolle d'aria a causa dello spostamento dell'aria dai canali LO. Una volta che le bolle d'aria sono state erogate nell'EW, regolare la pressione LO a 100 mbar. Infine, aumentare la pressione IA a 200 mbar e attendere che tutta l'aria nel canale IA venga rimossa. La sequenza ideale di arrivo all'incrocio delle tre fasi è, quindi, OA, LO e IA.
    4. Dopo aver rimosso l'aria dai tre canali, regolare tutte le pressioni del canale a 50 mbar e pipettare 10 μL di ES nella camera di uscita. Dopo aver pipettellato l'ES, posizionare un vetrino di copertura sul foro di uscita per evitare l'evaporazione. Nel caso in cui il LO venga spinto indietro, aumentare gradualmente la pressione LO con incrementi di 1 mbar fino a quando non inizia a fluire verso la giunzione.
    5. Una volta che tutte e tre le fasi iniziano a co-fluire alla giunzione, assicurarsi che inizi la produzione di doppia emulsione e regolare in base alla sua qualità (Figura 3A-C). Modificare le pressioni gradualmente (passi di 0,1-1 mbar) piuttosto che bruscamente a meno che la pressione non venga modificata per eliminare un intasamento indesiderato nel canale.
      NOTA: i canali da regolare dipendono da ciò che accade alla giunzione. Ad esempio, l'IA deve essere ridotta se le emulsioni sono troppo grandi; l'OA deve essere aumentata se si formano doppie emulsioni ma scoppiano invece di essere pizzicate; e il LO deve essere diminuito se la tasca di ottanolo è troppo grande.
    6. Controllare che le goccioline a doppia emulsione fluiscano a valle verso EW. Mentre fluiscono, le tasche di ottanolo diventano sempre più prominenti e alla fine vengono pizzicate, formando liposomi (Figura 3D-F). Assicurarsi che il canale di post-produzione sia sufficientemente lungo e che la migrazione delle doppie emulsioni sia abbastanza lenta per la deumidificazione.
      NOTA: Entro pochi minuti dopo una produzione decente, i liposomi e le goccioline di ottanolo usciranno dal canale di post-produzione e andranno nell'EW. Di conseguenza, essendo meno densi dell'acqua, le goccioline di ottanolo galleggiano sulla superficie dell'ES. A causa dell'aggiunta di destrano nell'IA, i liposomi sono più pesanti dell'ambiente circostante e vanno sul fondo della camera pronti per l'osservazione e l'ulteriore manipolazione.

Risultati

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Questo studio dimostra la formazione di condensati senza membrana attraverso il processo di separazione di fase liquido-liquido (LLPS) all'interno dei liposomi come esperimento rappresentativo.

Preparazione del campione
L'IA, l'OA, l'ES e la soluzione di alimentazione (FS) sono preparati come segue:

IA: 12% glicerolo, 5 mM destrano, 150 mM KCl, 5 mg/mL poli-L-lisina (PLL), 0,05 mg/mL poli-L-lisina-FITC marcato (PLL-FITC), 8 mM adenosina trifosfato (ATP), 15 mM citrato-HCl (pH 4)

OA: 12% v/v glicerolo, 5% p/v F68, 150 mM KCl, 15 mM citrato-HCl (pH 4)

ES: 12% glicerolo, 150 mM KCl, 15 mM citrato-HCl (pH 4)

FS: 12% glicerolo, 150 mM KCl, 75 mM Tris-HCl (pH 9)

Formazione di condensa all'interno dei liposomi
Un semplice saggio di coacervazione complessa sensibile al pH di poli-L-lisina caricata positivamente (PLL) e adenosina trifosfato (ATP) multivalente caricata negativamente è stato selezionato per dimostrare i fenomeni di LLPS nei liposomi. Per prevenire la separazione di fase di polilisina e ATP durante l'incapsulamento, il pH della soluzione è stato mantenuto a 4, al quale l'ATP è neutro. L'aumento del pH dell'ES mediante l'aggiunta di FS (un tampone di pH 9) alla fine ha aumentato il pH all'interno dei liposomi a causa del flusso protonico transmembrana, rendendo l'ATP caricato negativamente e innescando la sua separazione di fase con PLL21 caricato positivamente (Figura 4A). Dopo circa 2 ore di generazione di liposomi, le pressioni IA e LO sono state disattivate. La pressione del canale OA è stata mantenuta a 100 mbar per far fluire lentamente i liposomi rimanenti nella camera di osservazione. Una volta che tutti i liposomi nel canale sono stati recuperati nell'EW, le pressioni sono state disattivate per fermare il flusso e impedire ai liposomi di muoversi. I liposomi generati ad un pH più basso hanno mostrato una fluorescenza omogenea (dal PLL-FITC fluorescente incapsulato) nel loro lume (Figura 4B,D). Le goccioline di ottanolo galleggianti sulla superficie sono state rimosse mediante pipettaggio accurato di 5 μL di soluzione dall'alto per evitare che influenzassero ulteriori fasi di pipettaggio. Successivamente, 10 μL di tampone FS sono stati aggiunti all'EW, che ha indotto la separazione di fase del PLL e dell'ATP incapsulati. La fluorescenza omogenea FITC di ciascun liposoma si è gradualmente trasformata in distinte goccioline di condensato fluorescente. Alla fine, le singole goccioline si sono fuse in una goccia di condensa più grande che si è diffusa liberamente all'interno dei liposomi (Figura 4C, E-G).

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Figura 1: Schema che mostra l'assemblaggio e il funzionamento di OLA. Il regolatore di pressione è collegato ai serbatoi contenenti soluzioni acquose esterne, lipidi-in-ottanolo e acquose interne. I tubi inseriti nei serbatoi sono collegati ai rispettivi ingressi del dispositivo OLA. Flussi appropriati nei tre canali portano alla formazione di doppie emulsioni acqua-in-(lipido-in-ottanolo)-in-acqua. Le doppie emulsioni formate migrano verso il pozzetto di uscita, durante il quale le tasche di ottanolo si staccano per formare liposomi. I liposomi formati vengono raccolti sul fondo del pozzo per la visualizzazione e ulteriori sperimentazioni. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 2: Preparazione del chip OLA (fotolitografia, microfabbricazione, trattamento superficiale). (A) Progettazione digitale che mostra le caratteristiche principali del progetto OLA, tra cui tre ingressi, un'uscita e una giunzione di produzione a sei vie. (B) Uno schema del wafer master che mostra più progetti OLA prodotti utilizzando la litografia UV. (C) Un elastomero PDMS fuso sul wafer principale, posto in un pozzo creato con un foglio di alluminio e polimerizzato mediante cottura a 70 °C per 2 ore. (D) Un dispositivo microfluidico legato mediante trattamento al plasma di ossigeno, in cui il blocco PDMS contenente il disegno OLA è fissato a un vetrino rivestito di PDMS. (E) Funzionalizzazione superficiale del chip fabbricato per rendere il dispositivo parzialmente idrofilo. Questo viene fatto facendo scorrere il 5% w / v PVA per 5 minuti dal canale acquoso esterno verso il canale di uscita. La pressione positiva dell'aria negli altri canali impedisce alla soluzione PVA di entrare in questi canali. (F) Il PVA viene rimosso applicando un vuoto nel canale di uscita. Il dispositivo viene cotto a 120 °C per 15 minuti ed è quindi pronto per l'uso. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 3: Dimostrazione dell'OLA che produce in modo efficiente doppie emulsioni monodisperse ed eventualmente liposomi con un eccellente incapsulamento. (A) Un'immagine in campo chiaro che mostra una rapida generazione di goccioline a doppia emulsione. (B) Il canale lipidico fluorescente mostra la formazione di una tasca di ottanolo a causa della parziale deumidificazione. La fase lipido-in-ottanolo conteneva una miscela di DOPC (5 mg/ml) e Lis Rhod PE in un rapporto di 1.000:1. (C) Il canale acquoso interno che mostra l'incapsulamento della proteina fluorescente gialla (YFP). Gli inserti in (A-C) mostrano viste rappresentative ingrandite dei rispettivi pannelli (barre di scala = 10 μm). (D-F) Deumidificazione della tasca di ottanolo nel canale di uscita, che forma un liposoma. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

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Figura 4: Separazione di fase liquido-liquido innescata da pH di pLL/ATP all'interno dei liposomi. (A) Schema della transizione pH-dipendente della soluzione omogenea di pLL e ATP incapsulata all'interno del liposoma (a sinistra) a coacervati pLL/ATP separati in fase (a destra). L'ambiente acido iniziale nel liposoma rende la carica molecolare di ATP neutra, inibendo la coacervazione. Quando il pH all'interno dei liposomi si equilibra con l'aumento del pH applicato esternamente, l'ATP guadagna una carica negativa, innescando la coacervazione. (B-C) Grafici a linee (corrispondenti alle linee tratteggiate nei pannelli [D] e [G], rispettivamente) che mostrano la distribuzione spaziale del pLL (canale verde) e della membrana (canale rosso). (D-G) Immagini time-lapse che mostrano la formazione di coacervati pLL / ATP all'interno dei liposomi. L'aggiunta esterna di un tampone basico aumenta il livello di pH all'interno dei liposomi nel corso dei minuti e avvia la coacervazione. t = 0 min si riferisce al tempo appena prima del verificarsi del primo evento di coacervazione. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Supplementary Coding File 1: file CAD del progetto OLA. Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

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La complessità cellulare rende estremamente difficile comprendere le cellule viventi quando studiate nel loro insieme. Ridurre la ridondanza e l'interconnettività delle cellule ricostituendo i componenti chiave in vitro è necessario per approfondire la nostra comprensione dei sistemi biologici e creare imitazioni cellulari artificiali per applicazioni biotecnologiche22,23,24. I liposomi servono come un eccellente sistema minimo per comprendere i fenomeni cellulari. Un elenco non esaustivo di questi fenomeni comprende la dinamica del citoscheletro e le conseguenti deformazioni della membrana 25,26, la regolazione spaziotemporale dei condensati biomolecolari 27,28 e la loro interazione con la membrana 29, l'incapsulamento di un'ampia varietà di biomolecole, compresi i sistemi di trascrizione-traduzione senza cellule 30, la sintesi lipidica priva di cellule 31 e l'evoluzione delle proteine 32,33,34. I liposomi sono stati anche ampiamente utilizzati come vettori per la somministrazione di farmaci e sono stati approvati dalla Food and Drug Administration (FDA) e dall'Agenzia europea per i medicinali (EMA) per uso clinico11. I liposomi e le nanoparticelle a base lipidica sono utilizzati come vettori per la somministrazione di farmaci, compresi i vaccini mRNA come il recente vaccino COVID-1935.

Questo studio descrive un protocollo dettagliato sulla fotolitografia, l'assemblaggio microfluidico e la funzionalizzazione superficiale per eseguire la tecnica OLA al fine di generare liposomi su chip (Figura 1 e Figura 3). I liposomi prodotti utilizzando OLA sono monodispersi (coefficiente di variazione: 4%-11% della media) e nell'intervallo delle dimensioni delle cellule biologiche (tipicamente tra 5-50 μm di diametro), e possono essere regolati utilizzando velocità di flusso appropriate dei canali acquosi interni ed esterni36. Ad esempio, la popolazione di liposomi osservata nella Figura 1 ha una distribuzione dimensionale di 23,3 μm ± 1,8 μm (n = 50). Con velocità di produzione tipiche di 10-30 Hz, i liposomi formati sono unilamellari, come è stato precedentemente confermato inserendo una singola proteina transmembrana specifica per doppio strato, alfa-emolisina36, nella membrana, nonché utilizzando il saggio sbiancante ditionato-37. OLA è anche compatibile con un'ampia varietà di composizioni lipidiche, offrendo all'utente flessibilità nella scelta dei lipidi. È importante sottolineare che la composizione lipidica inizialmente utilizzata si riflette nella composizione liposomica finale38.

Essendo una tecnologia relativamente nuova, c'è ulteriore spazio per migliorare l'OLA. Ad esempio, la funzionalizzazione delle superfici mediante PVA è cruciale ma noiosa da eseguire. Un modo più semplice e semplice per funzionalizzare la superficie del dispositivo ridurrebbe significativamente il tempo di fabbricazione del chip e la variabilità chip-to-chip. Il tensioattivo Pluronico F68 è un componente importante nella fase acquosa esterna per stabilizzare inizialmente le doppie emulsioni; Tuttavia, il suo utilizzo può essere restrittivo in alcuni casi. La sostituzione di Pluronic F68 con un tensioattivo più biocompatibile o la rimozione completa del tensioattivo può migliorare la versatilità del sistema. Durante la migrazione delle doppie emulsioni generate nel canale di uscita, possono scoppiare a causa del taglio. L'aggiornamento del design OLA per migliorare la stabilità della doppia emulsione e la separazione delle tasche di ottanolo potrebbe, quindi, aumentare la produttività. Tuttavia, l'OLA ha diversi vantaggi, che includono principalmente l'incapsulamento efficiente, i liposomi monodispersi e unilamellari e la sperimentazione controllata su chip.

L'OLA è stato impiegato e adattato in una vasta gamma di studi, tra cui la crescita e la divisione dei liposomi39, studiando il processo di separazione di fase liquido-liquido27 e la sua interazione con la membrana21 e comprendendo la formazione di bioprodotti di crescita batterica nei liposomi40. I saggi ad alto rendimento basati su OLA vengono utilizzati anche per comprendere il trasporto ionico attraverso la membrana 41 e la permeabilità del farmaco attraverso il doppio strato lipidico37, come sistema di somministrazione di farmaci per scopi terapeutici42, per studiare l'effetto degli antimicrobici sulla membrana43 e come strumento per incapsulare cristalli liquidi44. Oltre alla vasta gamma di applicazioni della tecnologia OLA, sono in fase di sviluppo versioni modificate di OLA adatte a scopi particolari 45,46,47,48,49,50. Nel complesso, considerando i pro e i contro, crediamo fermamente che OLA sia una piattaforma versatile per la biologia sintetica.

Dichiarazioni

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Gli autori non dichiarano conflitti di interesse.

Ringraziamenti

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Vorremmo ringraziare Dolf Weijers, Vera Gorelova e Mark Roosjen per averci gentilmente fornito YFP. S.D. riconosce il sostegno finanziario del Consiglio olandese delle ricerche (numero di sovvenzione: OCENW. KLEIN.465).

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
1-OctanolSigma-AldrichNo. 297887
Provette da 1,5 mLFisher scientific10451043Eppendorf 3810X Provette per microcentrifuga in polipropilene
ATPSigma-AldrichNo. A2383
Punzone per biopsiaDarwin microfluidicsPT-T983-050,5 mm e 3 mm di diametro
Citrate-baseSigma-AldrichNo. 71405
DextranSigma-AldrichNo. 31388Mr~6.000
Macchina per litografia ottica a scrittura direttaDurham Magneto Optics LtdMicroWriter ML3 Configurazione e software per bambini
Lipidi DOPCAvantiSKU:850375C
F68Sigma-AldrichNo. 24040032
Vetrino coprioggettiCorning#1, 24 x 40 mm
GliceroloSigma-AldrichNo. G2025
Acido cloridricoThermo Scientific AcrosNo. 124630010
Liss Rhod PE lipideAvantiSKU:810150C
ParafilmSigma-AldrichNo. P7793
PhotoresistMicro resist technology GmbHEpoCore 10
Photoresist developermicro resist technology GmbHmr-Dev 600
Detergente al plasmaHarrick plasmaPDC-32G
PolidimetilsilossanoDowSylgard 184PDMS e agente indurente
Poli-L-lisinaSigma-AldrichNo. P7890
Poli-L-lisina– FITC etichettatoSigma-Aldrichn. P3543
Alcool polivinilicoSigma-Aldrichn. P8136peso molecolare 30.000... 70.000, 87%– Regolatore di pressione idrolizzato al 90%
Elveflow OBK1 Mk3 +Regolatore di flusso
Scotch Nastromagico Nastro
Wafer di siliconeMateriali di silicone0620R16002
Spin coaterLaurell Technologies CorporationModello WS-650MZ-23NPP
Acciaio inossidabile 90 gradi Accoppiatori PDMS piegatiMicrofluidica DarwinPN-BEN-23G
Tris-baseSigma-AldrichNo. 252859
Tubi TygonMicrofluidica Darwin 1/16" OD x 0,02" ID
Laser UV Lunghezza d'onda 365 nm
opaco invisibile

Riferimenti

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