ATAC-seq adipocita-specifico con tessuti adiposi mediante selezione del nucleo attivato dalla fluorescenza

Kyungchan Kim; Solaema Taleb; Jisun So; Jamie Wann; Hyun Cheol Roh

doi:10.3791/65033

Articolo metodologico

ATAC-seq adipocita-specifico con tessuti adiposi mediante selezione del nucleo attivato dalla fluorescenza

DOI:

10.3791/65033

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17 marzo 2023

Kyungchan Kim¹ , Solaema Taleb¹ , Jisun So¹ , Jamie Wann¹ , Hyun Cheol Roh¹

¹Department of Biochemistry and Molecular Biology, Indiana University School of Medicine

In questo articolo

Sommario

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Presentiamo un protocollo per il dosaggio della cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alto rendimento (ATAC-seq) specificamente sugli adipociti utilizzando la selezione del nucleo con tessuti adiposi isolati da topi reporter transgenici con marcatura a fluorescenza nucleare.

Abstract

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Il saggio per la cromatina accessibile alla trasposasi con sequenziamento ad alta produttività (ATAC-seq) è una tecnica robusta che consente la profilazione dell'accessibilità della cromatina a livello di genoma. Questa tecnica è stata utile per comprendere i meccanismi regolatori dell'espressione genica in una serie di processi biologici. Sebbene ATAC-seq sia stato modificato per diversi tipi di campioni, non ci sono state modifiche efficaci dei metodi ATAC-seq per i tessuti adiposi. Le sfide con i tessuti adiposi includono la complessa eterogeneità cellulare, il grande contenuto lipidico e l'elevata contaminazione mitocondriale. Per superare questi problemi, abbiamo sviluppato un protocollo che consente l'ATAC-seq adipocyte-specific utilizzando la selezione del nucleo attivata dalla fluorescenza con tessuti adiposi dal topo transgenico reporter Nuclear tagging and Translating Ribosome Affinity Purification (NuTRAP). Questo protocollo produce dati di alta qualità con letture di sequenziamento minime sprecate, riducendo al contempo la quantità di input del nucleo e reagenti. Questo articolo fornisce istruzioni dettagliate passo-passo per il metodo ATAC-seq convalidato per l'uso di nuclei di adipociti isolati da tessuti adiposi di topo. Questo protocollo aiuterà nello studio della dinamica della cromatina negli adipociti su diverse stimolazioni biologiche, che consentiranno nuove intuizioni biologiche.

Introduzione

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Il tessuto adiposo, specializzato per immagazzinare l'energia in eccesso sotto forma di molecole lipidiche, è un organo chiave per la regolazione metabolica. Lo stretto controllo della formazione e del mantenimento degli adipociti è vitale per la funzione del tessuto adiposo e l'omeostasi energetica di tutto il corpo¹. Molti regolatori trascrizionali svolgono un ruolo critico nel controllo della differenziazione, della plasticità e della funzione degli adipociti; Alcuni di questi regolatori sono implicati nei disordini metabolici nell'uomo ^2,3. I recenti progressi nelle tecniche di sequ....

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Protocollo

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La cura e la sperimentazione degli animali sono state eseguite secondo procedure approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Indiana University School of Medicine.

1. Preparativi prima di iniziare l'esperimento

Preparazione dei tessuti
1. Per la marcatura del nucleo adipocitario, incrociare topi NuTRAP con linee adiponectina-Cre specifiche per adipociti (Adipoq-Cre) per generare topi Adipoq-NuTRAP, che sono emizigoti sia per Adipoq-Cre che per NuTRAP.
2. Sezionare i tessuti adiposi di interesse dai topi Adipoq-NuTRAP come descritto in precedenza¹⁴.

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Risultati

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Per analizzare il tessuto adiposo utilizzando questo protocollo ATAC-seq, abbiamo generato topi Adipoq-NuTRAP che sono stati alimentati con diete chow; abbiamo quindi isolato i nuclei degli adipociti dal tessuto adiposo bianco epididimo (eWAT), dal tessuto adiposo bianco inguinale (iWAT) e dal tessuto adiposo bruno (BAT) utilizzando la citometria a flusso. I nuclei isolati sono stati utilizzati per la marcatura, seguita dalla purificazione del DNA, dall'amplificazione PCR, dalle fasi di controllo della qualità, dal seque.......

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Discussione

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In questo articolo, abbiamo presentato un protocollo ATAC-seq ottimizzato per valutare l'accessibilità della cromatina adipocita-specifica in vivo. Questo protocollo ATAC-seq che utilizza il mouse Adipoq-NuTRAP ha generato con successo profili di accessibilità della cromatina adipociti-specifici. Il fattore più critico per esperimenti ATAC-seq di successo e riproducibili è la qualità del nucleo. È fondamentale congelare immediatamente i tessuti adiposi sezionati in azoto liquido e conservarli in modo sicuro a -8.......

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Dichiarazioni

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari rilevanti o materiali relativi alla ricerca descritta in questo articolo.

Ringraziamenti

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Questo lavoro è stato sostenuto dallo IUSM Showalter Research Trust Fund (a H.C.R.), un centro IUSM per il diabete e le malattie metaboliche Pilot and Feasibility grant (a H.C.R.), il National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK129289 a H.C.R.), e l'American Diabetes Association Junior Faculty Award (7-21-JDF-056 a H.C.R.).

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
Nome	Azienda	Numero di catalogo
Animali
Adiponectina-Cre	topo The Jackson Laboratory	28020
NuTRAP mouse	The Jackson Laboratory	29899
Reagenti & Materiali
1,5 mL Provette DNA-LoBind	Eppendorf	86-923
100 & micro; filtro cellulare	m Falcon	352-360
provette da 15 mL	VWR	525-1071
2x tampone TD	Illumina	15027866
piastra PCR a 384 pozzetti	Biosystem applicato	4483285
40 &; filtro cellulare m	Falcon	352-340
provette da 50 mL	VWR	525-1077
Reagente AMPure XP (perline SPRI)	Beckman Coulter	A63881
Kit DNA ad alta sensibilità	Agilent Technologies	5067-4626
Pellicola adesiva trasparente	Biosystem applicato	4306311
acqua distillata priva di DNasi/RNasi	Invitrogen	10977015
Dounce macinatore di tessuti	DWK Life Sciences	357542
DTT	Sigma	D9779
DynaMag-96 magnete con gonna laterale	Thermo Fishers	12027
tubi FACS	Falcon
HEPES	Boston BioProducts	BBH-75
Hoechst 33342	Invitrogen	2134015
KCl (2 M)	Boston BioProducts	MT-252
Rack di separazione magnetica per PCR 8 strisce di provette	EpiCypher	10-0008
MgCl₂(1 M)	Boston BioProducts	MT-200
Kit di purificazione PCR MinElute	Qiagen	28004
NEBNext High-Fidelity 2x PCR master mix	BioLabs	M0541S
NP40	Thermo Fishers	28324
PCR 8-tube strip	USA scientific	1402-4708
Cocktail di inibitori della proteasi (100x)	Thermo Fishers	78439
Kit di test Qubit dsDNA HS	Invitrogen	Q32851
Saccarosio	Sigma	S0389-1KG
SYBR Green I (10.000x)	Invitrogen	S7563
TDE I enzima	Illumina	15027865
Instruments
Citometro a flusso	BD Biosciences	FACSAria Fusion
Fluorimetro Qubit	Invitrogen	Q33226
Sistema di PCR in tempo reale	Thermo Fishers	QuantStudio?5

Bioanalizzatore 28719128

Riferimenti

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Sethi, J. K., Vidal-Puig, A. J. Thematic review series: Adipocyte biology. Adipose tissue function and plasticity orchestrate nutritional adaptation. Journal of Lipid Research. 48 (6), 1253-1262 (2007).
Farmer, S. R. Transcriptional cont....

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ATAC Seq Adipocyte Nuclei Adipose Tissue Chromatin Accessibility Nucleus Isolation Fluorescence Activated Sorting Transgenic Reporter Mice Mitochondrial Contamination Adipocyte Marker Genes Nucleosome Profiling

ATAC-seq adipocita-specifico con tessuti adiposi mediante selezione del nucleo attivato dalla fluorescenza

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