Articolo metodologico

Purificazione del Complesso Attivo di Raccolta Fotosistema I-Light I da Tessuti Vegetali

DOI:

10.3791/65037

⸱

3 febbraio 2023

 , 
1School of Molecular Sciences, Arizona State University, 2Biodesign Center for Applied Structural Discovery, Arizona State University

In questo articolo

Sommario

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Questo protocollo descrive l'isolamento del Fotosistema I (PSI) - Light Harvesting Complex I (LHCI) da tessuti vegetali. PSI insieme a PSII è responsabile della conversione della luce in energia chimica nei fotoautotrofi ossigenati e ha un'efficienza quantica di ~1, che lo rende un obiettivo per lo studio del trasferimento di energia guidato dalla luce.

Abstract

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Questo metodo viene utilizzato per isolare il fotosistema I (PSI) insieme al Light Harvesting Complex I (LHCI), la sua antenna nativa, dalle piante. PSI-LHCI è un grande complesso proteico di membrana che coordina centinaia di fattori di raccolta della luce e di trasporto degli elettroni ed è il sistema di raccolta della luce più efficiente trovato in natura. I fotoni assorbiti dalle quattro proteine antenna LHCA che compongono LHCI vengono trasferiti attraverso l'interazione eccitonica al centro di reazione centrale del PSI e vengono utilizzati per facilitare la separazione di carica guidata dalla luce attraverso la membrana tilacoidale, fornendo potenza ed energia riducenti per la fissazione del carbonio negli organismi fotoautotrofi. L'elevata efficienza quantica del PSI rende questo complesso un modello eccellente per studiare il trasferimento di energia guidato dalla luce. In questo protocollo, il tessuto vegetale viene omogeneizzato meccanicamente e i cloroplasti vengono separati dai detriti cellulari mediante filtrazione e centrifugazione. I cloroplasti isolati vengono quindi lisati osmoticamente e le membrane tilacoidi vengono recuperate mediante centrifugazione e solubilizzate utilizzando il detergente n-dodecil-beta-maltoside. Il materiale solubilizzato viene caricato su una colonna di scambio anionico per raccogliere la maggior parte dei complessi contenenti clorofilla. I complessi più grandi vengono precipitati dalla soluzione, risospesi in un piccolo volume e caricati su gradienti di saccarosio per separare i principali complessi contenenti clorofilla. Le frazioni di gradiente di saccarosio risultanti sono caratterizzate per identificare la banda di interesse contenente PSI-LHCI. Questo protocollo è molto simile al protocollo utilizzato nella cristallizzazione della pianta PSI-LHCI con alcune semplificazioni e si basa su metodi sviluppati nel corso degli anni nel laboratorio di Nathan Nelson.

Introduzione

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La fotosintesi ossigenata è una delle reazioni chimiche più importanti del nostro pianeta. La conversione della luce in energia chimica avviene nei centri di reazione di due fotosistemi, il fotosistema I (PSI) e il fotosistema II (PSII)1 (Figura 1A). Il PSI è un grande complesso multisubunità pigmento-proteina altamente conservato che si è evoluto oltre 3,5 miliardi di anni fa 2,3. Questo complesso, che contiene circa 100 molecole di clorofilla e circa 20 carotenoidi, facilita il trasferimento di elettroni attraverso la membrana tilacoide dalla plastocianina alla ferredossina fungendo da accettore terminale di elettroni della catena di trasporto degli elettroni fotosintetici 1,4,5 (Figura 1B, C). Nelle piante, questa separazione di carica guidata dalla luce è il risultato dell'energia luminosa trasferita sia dai pigmenti dell'antenna del nucleo PSI che dai pigmenti dell'antenna periferica del complesso di raccolta della luce I (LHCI) al centro di reazione PSI (Figura 1D). LHCI è un complesso antenna specifico per PSI all'interno della membrana tilacoide composto da quattro proteine antenna LHCA leganti la clorofilla a/b 6,7.

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Figura 1: La catena di trasporto degli elettroni fotosintetici e la struttura complessiva del complesso PSI-LHCI. (A) La catena di trasporto degli elettroni fotosintetici contiene quattro principali complessi fotosintetici legati alla membrana e tre trasportatori di elettroni solubili. Il flusso di elettroni (frecce rosse) attraverso la catena di trasporto e il pompaggio di protoni (frecce nere) nel lume vengono utilizzati per creare potenza riducente (NADPH) e produrre ATP per la fissazione del carbonio 37,38,39,40. Creato con Biorender.com. (B) La struttura della pianta PSI-LHCI dal lato lumenale. PsaA e PsaB sono le più grandi subunità di PSI e costituiscono il nucleo del complesso. LHCI è il complesso di antenne per la raccolta della luce associato al PSI ed è composto da quattro antenne, LHCA1-4. (C) Il complesso PSI-LHCI coordina oltre 150 ligandi. Qui sono mostrate le clorofille (verde), i carotenoidi (rosa), i chinoni (viola), i lipidi (arancione) e i cluster FeS del centro di reazione in giallo/arancione. (D) Il centro di reazione del PSI è diviso in due rami (A e B), a partire da P700, la coppia speciale di clorofilla del centro di reazione, passando a due clorofille accessorie (A-1A/B) seguite da un'altra coppia di clorofille (A0A/B). Queste clorofille sono seguite da un fillochinone (A1A/B o QA/B in alcune pubblicazioni) in ogni ramo prima di unirsi nel cluster ferro-zolfo Fx seguito da altri due cluster, FA e FB, coordinati dalla subunità PsaC. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Il primo isolamento di PSI da piante nel 1966 ha fatto luce sulle differenze nel contenuto di pigmenti che raccolgono la luce tra PSI e PSII, dimostrando che il PSI era altamente arricchito in β-carotene rispetto al PSII e che i citocromi f e b6 (parte dei complessi del citocromo b6f) non sono strettamente legati al PSI ma debolmente associati all'interno della membrana tilacoide8. Nove anni dopo, con la parziale denaturazione del PSI isolato tramite trattamento SDS, è stato dimostrato che la dissociazione di piccole subunità PSI estingue la fotoriduzione del NADP+ mediante PSI, mentre il segnale P700 e la maggior parte delle clorofille rimanevano all'interno della rimanente particella PSI a grande peso molecolare, identificando la necessità di alcune delle piccole subunità del PSI per la piena funzione biologica e la posizione del centro di reazione del PSI9. La ricerca sull'associazione tra il nucleo del PSI e l'LHCI è stata pubblicata per la prima volta nei primi anni '80, quando sono stati osservati isolamenti di specie di PSI di diverse dimensioni contenenti rapporti diversi di clorofilla A e P700, suggerendo l'associazione del PSI con un sistema di antenne periferiche contenente clorofilla 10,11,12,13. Tuttavia, è stato solo nel 2003 che è stata pubblicata la prima struttura cristallina della pianta PSI14. La struttura cristallina della pianta PSI-LHCI ha evidenziato la notevole conservazione tra il nucleo PSI delle piante e i cianobatteri e ha fornito la prima immagine della disposizione della clorofilla all'interno del nucleo PSI della pianta e dell'antenna LHCI, favorendo la comprensione delle vie di trasferimento di energia all'interno del complesso PSI-LHCI14 della pianta. Nell'ultimo decennio sono state determinate altre strutture PSI-LHCI delle piante, aggiungendo dettagli sui livelli atomici alla descrizione strutturale del supercomplesso 15,16,17,18,19.

Il PSI non solo ha un'efficienza quantica vicina a uno, ma vanta il potenziale di riduzione più negativo in natura20,21. Una comprensione completa di PSI-LHCI e delle sue proprietà è essenziale per comprendere il trasferimento di energia guidato dalla luce e applicare soluzioni bio-ispirate alla futura tecnologia di raccolta della luce. Per approfondire la comprensione di come PSI-LHCI e le sue numerose subunità possano raggiungere una conversione di energia così efficiente, i complessi isolati per lo studio devono essere attivi e interi. Questo protocollo consente la purificazione delicata del complesso in questo stato attivo22,23.

In questo metodo i tessuti vegetali vengono distrutti meccanicamente e i cloroplasti contenenti la catena di trasporto degli elettroni fotosintetici vengono isolati mediante centrifugazione. Le membrane tilacoidi vengono separate dopo la lisi ipotonica dei cloroplasti e vengono quindi solubilizzate utilizzando il detergente n-dodecil-beta-maltoside (β-DDM). I complessi di membrana contenenti clorofilla solubilizzata vengono separati mediante cromatografia a scambio anionico e PSI-LHCI viene ulteriormente separato mediante centrifugazione a gradiente di saccarosio. Dopo la rimozione dal gradiente e dopo la caratterizzazione mediante spettroscopia e utilizzando l'elettroforesi su gel di poliacrilammide dodecil solfato di sodio (SDS-PAGE), il complesso può essere preparato per ulteriori esperimenti. Questa procedura viene utilizzata per purificare il complesso PSI-LHCI dalle piante senza l'uso di alcun tag di affinità. Con piccole modifiche può essere adattato per preparazioni del complesso da altri organismi, stabilizzare complessi PSI alternativi o altri complessi della catena di trasporto degli elettroni fotosintetici. Protocolli simili sono stati utilizzati per ottenere un complesso PSI adatto all'analisi strutturale ad alta risoluzione 23,24,25,26,27,28,29,30.

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Protocollo

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1. Preparazione delle membrane tilacoidi dalle foglie di spinaci

  1. Lavorare sul ghiaccio ed evitare l'esposizione alla luce ove possibile in questa preparazione. Un ambiente con scarsa illuminazione è sufficiente se vengono mantenute alte concentrazioni di clorofilla e si presta attenzione a mantenere i campioni coperti il più possibile. Eseguire tutte le fasi di centrifugazione a 4 °C, se non diversamente specificato.
  2. Togliete i gambi alle foglie di spinaci (500 g) con le forbici, premete delicatamente le foglie in un frullatore e copritele completamente con saccarosio ghiacciato, tricina, tampone NaCl (STN) (Tabella 1). Omogeneizzare il tessuto vegetale in tampone STN per 10 s due volte (totale 20 s), lasciando 10 s tra gli impulsi per evitare il surriscaldamento utilizzando l'impostazione dell'impulso.
    NOTA: Un tipico rapporto tra tampone e foglie è di 1 L di tampone STN per 500 g di foglie di spinaci.
  3. Filtra i detriti cellulari attraverso otto strati di garza fissando gli strati di garza su un grande bicchiere raffreddato o un altro recipiente e versando la miscela miscelata attraverso il panno. Usa una bacchetta di vetro o un cucchiaio per mescolare i detriti cellulari nel filtro per consentire il passaggio del lisato.
  4. Cloroplasti in pellet dal lisato cellulare mediante centrifugazione a 1000 x g per 9 min. Risospendere i cloroplasti in 1 L di tampone ipotonico (Tabella 1). Per risospendere i cloroplasti, utilizzare una pipetta o un pellet di cloroplasto a spirale in tampone e trasferirlo in un trituratore di tessuti o in un omogeneizzatore simile di dimensioni adeguate.
    NOTA: L'esposizione a una soluzione ipotonica e la risospensione in un trituratore di tessuti lisa i cloroplasti.
  5. Centrifugare per 2 minuti a 500 x g per eliminare l'amido (raccolto sotto forma di pellet bianco). Risospendere delicatamente il materiale verde che è stato rimescolato nel surnatante utilizzando una pipetta o un piccolo pennello, evitando il più possibile la risospensione dell'amido. Centrifugare la soluzione a 12.000 x g per 10 minuti per pellettare le membrane tilacoidali.
  6. Risospendere le membrane pellettate in quantità minime del tampone di risospensione ad alto contenuto di sale (Tabella 1), sufficiente solo per risospendere le membrane, utilizzando una pipetta o un pennello per vernice e omogeneizzare utilizzando un omogeneizzatore come al punto 1.4. Centrifugare a 8000 x g per 10 min.
  7. Risospendere come prima in quantità minime di tampone STN2 (Tabella 1), sufficiente solo per risospendere le membrane e misurare il contenuto di clorofilla utilizzando uno spettrofotometro UV-Vis. Determinare la concentrazione di clorofilla diluendo il campione 1/1000 in una soluzione di acetone all'80% e utilizzando il metodo di Porra et al.31.
  8. Regolare la concentrazione di clorofilla desiderata, in genere 3 mg/mL, aggiungendo il tampone STN2 e aliquotare uniformemente in due o tre provette da centrifuga. La resa attesa da 500 g di foglie è di circa 200 mg di clorofilla, ma è prevista una variazione in base allo stato del materiale di partenza. Congelare a -80 °C fino al momento della solubilizzazione su membrana. Le membrane congelate in questa fase sono stabili per almeno 6 mesi.

2. Solubilizzazione della membrana

  1. Solubilizzare le membrane tilacoidi con β-DDM. Aggiungere una quantità sufficiente di detersivo da un β-DDM al 10% per ottenere un rapporto 6:1 β-DDM/clorofilla. Incubare con ghiaccio per 30 min. Mescolare delicatamente ogni 5-10 minuti capovolgendo lentamente il tubo più volte.
  2. Centrifugare a 120.000 x g per 30 minuti utilizzando un'ultracentrifuga per rimuovere il materiale insolubile. Scartare il pellet e conservare il surnatante per i passaggi successivi.

3. Eluizione mediante colonna dietilamminoetile (DEAE)

  1. Preparare la colonna di scambio anionico utilizzando 1,5 mL di volume del letto per 1 mg di clorofilla totale nel campione solubilizzato. Preparare la colonna e farla funzionare a 4 °C. Versare la resina in una colonna fissata su un supporto ad anello. Lasciare depositare la resina aggiungendo acqua o tampone a basso contenuto di sale della colonna per evitare che la colonna si asciughi. Assicurarsi che la colonna sia priva di bolle e che la parte superiore sia piatta e livellata.
  2. Lavare la colonna utilizzando due volumi di colonna (CV) di tampone a basso contenuto di sale (Tabella 1) e caricare il surnatante del passaggio 2.2 sulla colonna. Lasciare che il surnatante penetri completamente nella colonna prima di proseguire.
  3. Lavare la colonna in un CV di tampone a basso contenuto di sale della colonna.
  4. Eluire utilizzando un gradiente lineare di NaCl con i tamponi a basso contenuto di sale e ad alta colonna di sale (5-250 mM di NaCl; Tabella 1) prodotto in un volume totale di sei CV (cioè, se il volume del letto della colonna è di 30 mL, utilizzare 90 mL di tampone a basso contenuto di sale e 90 mL di tampone ad alto contenuto di sale).
    1. Riempire due bicchieri con i tamponi a basso e alto contenuto di sale. Mentre si gocciola il tampone a basso contenuto di sale nella colonna, creare un ponte salino tra i tamponi ad alto e basso contenuto di sale utilizzando un tubo riempito d'acqua per mescolarli gradualmente. Utilizzare una barra di agitazione per assicurarsi che il tampone ad alto contenuto di sale che si sposta nel tampone a basso contenuto di sale venga miscelato prima di essere gocciolato nella colonna. In questo modo si garantisce che il gradiente NaCl sia lineare. Inizia a raccogliere le frazioni.
  5. Raccogliere 4 mL di frazioni (per un tipico esperimento che inizia con circa 35 mg di clorofilla) e combinare le frazioni verde scuro eluendo circa l'ultimo terzo del gradiente (Figura 2A).

4. Precipitazione del polietilenglicole (PEG)

  1. Alle frazioni clorofilliane combinate, aggiungere lentamente PEG6000 fino a una concentrazione finale dell'8%. La concentrazione di PEG può variare leggermente; se le precipitazioni non si vedono dopo aver raggiunto l'8%, aumentare la concentrazione di PEG con incrementi del 2% fino a quando non si vedono precipitazioni (la soluzione diventerà torbida).
  2. Centrifugare a 3,214 x g per 5 min. Scartare completamente il surnatante; la rimozione completa di tutti i residui di PEG è essenziale per ottenere una buona solubilizzazione nella fase successiva. Risospendere il precipitato verde in 2-5 mL di tampone di risospensione post-colonna (Tabella 1).
  3. Per verificare che i tilacoidi siano stati completamente lavati dal PEG, centrifugare una piccola aliquota del materiale risospeso in una centrifuga da banco a 18.407 x g a 4 °C per 5 minuti per garantire che il materiale sia solubile. Un piccolo precipitato verde è accettabile in questa fase, ma la maggior parte, se non tutta, la clorofilla dovrebbe rimanere nella soluzione. Conservare la frazione solubile.

5. Preparazione dei gradienti di saccarosio

  1. Preparare gradienti di saccarosio discontinui al 10%-30% in cinque strati (strati 10%, 15%, 20%, 25% e 30%) con tampone di gradiente di saccarosio (Tabella 1). Assemblare i gradienti di saccarosio stratificando accuratamente le frazioni di saccarosio in una provetta da centrifuga in poliallomero, iniziando con lo strato del 30% e terminando con lo strato del 10%. Regolare il volume di ogni strato in modo che ci sia abbastanza spazio di testa nella parte superiore del tubo per caricare il volume di campione desiderato.
  2. Caricare i campioni dal materiale solubile dal passaggio 4.2 in gradienti di saccarosio. Caricare una quantità di campione sufficiente a 170 μg di clorofilla in una provetta e a 420 μg di clorofilla in un'altra per ottenere gradienti a diverse concentrazioni per valutare l'omogeneità di ciascuna banda (Figura 3A).
    NOTA: La quantità di campione aggiunta è arbitraria, ma di solito è appropriato un intervallo compreso tra circa 150 e 500 μg di clorofilla.
  3. Centrifugare i gradienti a 100.000 x g per 16 ore per separare i diversi complessi all'interno del campione.

6. Rimozione delle frazioni di saccarosio e precipitazione del PEG

  1. Dopo la centrifugazione, rimuovere i gradienti dal rotore e scattare foto delle provette utilizzando una fotocamera digitale o un telefono cellulare. Isolare le frazioni forando i tubi sul fondo con un ago e poi drenando lentamente il contenuto. Raccogliere le diverse frazioni contenenti clorofilla in provette da centrifuga.
    NOTA: I campioni possono essere aliquotati e congelati per analisi successive, se lo si desidera.
  2. Per alcune applicazioni è auspicabile la rimozione del saccarosio. Per rimuovere il saccarosio, utilizzare una seconda fase di precipitazione PEG (o filtrazione su gel). Regolare la concentrazione di NaCl nella frazione PSI-LHCI a 120 mM e aggiungere PEG6000 a una concentrazione finale del 10%.
  3. Centrifugare il campione in una centrifuga da banco a 18.407 x g a 4 °C per 5 minuti. Risospendere il pellet verde in 30 mM di Tricine-NaOH pH 8,0, 50 mM di NaCl e 0,05% di β-DDM.
  4. Centrifugare il campione in una centrifuga da banco a 18.407 x g a 4 °C per 5 minuti per assicurarsi che tutto il materiale rimanga in soluzione.

7. Misurazione del contenuto di P700 di PSI

NOTA: Questo metodo può essere utilizzato per saggiare rapidamente il PSI.

  1. Diluire i campioni a un OD680 di 1-1,5 e incubare al buio con 10 mM di acido ascorbico per 1 ora per ridurre completamente P700.
  2. Misurare lo spettro di assorbimento del campione utilizzando uno spettrometro UV-Vis. Misura l'assorbanza da soli 650 nm a 750 nm con un intervallo dati di 0,50 nm e una velocità di scansione di 60 nm/min per il dosaggio del contenuto di P700.
  3. Esporre il campione a una luce intensa (350 μmol di fotoni/m2/s) e misurare nuovamente lo spettro durante l'esposizione.
  4. Sottrai lo spettro scuro dallo spettro luminoso per osservare lo sbiancamento di P700 a circa 702 nm nelle piante.
  5. Determinare il contenuto di P700 utilizzando l'assorbimento a 700 nm e un coefficiente di estinzione di 64/mM/cm come descritto in Hiyama e Ke 32,33,34.
  6. Misurare la quantità totale di clorofilla (clorofilla A e clorofilla B) utilizzando il metodo descritto in Porra et al.31. Utilizzare queste concentrazioni per determinare il rapporto tra clorofilla e P700.

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Risultati

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Questo protocollo viene utilizzato per isolare e caratterizzare PSI-LHCI attivi da tessuti vegetali nell'arco di tre giorni. PSI-LHCI viene purificato isolando prima le membrane tilacoidi delle piante che vengono poi solubilizzate con β-DDM. Le rese tipiche della fase di preparazione della membrana sono 200 mg di clorofilla da 500 g di foglie. Questo può variare in base al materiale iniziale utilizzato.

Il secondo e il terzo giorno dell'esperimento utilizzano la cromatografia a scambio anionic...

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Discussione

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Utilizzando questo protocollo, il complesso PSI-LHCI dei tessuti vegetali può essere purificato nel suo stato attivo. Qui venivano utilizzate foglie di spinaci, ma questi metodi possono essere applicati a preparazioni di varie piante 23,40. In tutti i casi, è necessario prestare attenzione durante l'esecuzione di questo protocollo per proteggere il complesso da eventuali danni. Questa preparazione deve essere eseguita al buio o s...

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Dichiarazioni

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Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.

Ringraziamenti

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Y.M. riconosce il sostegno della National Science Foundation nell'ambito del premio n. 2034021 e del Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti, Ufficio della Scienza, Ufficio delle Scienze dell'Energia di Base, Divisione di Scienze Chimiche, Geoscienze e Bioscienze nell'ambito del Premio n. DE-SC0022956. C.G. è sostenuto dalla National Science Foundation con il premio n. 00036806.

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Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
15 mL Falcon tuboVWR62406-200Utilizzato per la conservazione dei tilacoidi
Bio rad Econo-Column 1,5 X 30 cmbiorad7374153
Garza grado 50, 100% cotoneArkwright LLCB07D1FZZMBDa Amazon
Aste di vetroMillipore SigmaBR135825Qualsiasi asta simile sarà sufficiente
Frullatore vitamix a basso profilo da 64 onceVitamix
NaClSigma-AldrichS7653
Provette per centrifugazione in poliallomero a cielo apertoSeton Scientific5030
Optima XE Ultracentrifugebeckman coultroA94471
Polietilenglicole 6.000Hampton ResearchHR2-533
Potter-Elvehjen Grinder per tessuti, 30 ml.WHEATON358049
SaccarosioSigma-AldrichS7903
SW 40 Coltro Tibeckman331301
TOYOPEARL DEAE-650CTosoh Bioscience7988
TricineSigma-AldrichT0377
β-DDMGlycon - Biochemicals GmbHD97002Immagazzinato come scorte del 10% a -20 ° E

Riferimenti

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