Induzione della stenosi uretrale seguita da uretroplastica dell'innesto della mucosa buccale in un modello di ratto

Sommario

Nel presente protocollo, è stata sviluppata un'induzione della stenosi uretrale nei ratti Wistar, seguita da una ricostruzione uretrale con un innesto di mucosa vestibolare. Sono stati eseguiti un uretrogramma retrogrado e una valutazione laser Doppler, convalidando la ricostruzione uretrale (dopo la formazione della stenosi) e il posizionamento dell'innesto.

Abstract

La ricostruzione uretrale è un'importante area di competenza per gli urologi. La mucosa vestibolare è considerata l'opzione migliore quando è necessario l'innesto uretrale, anche se in alcuni casi è inappropriata o deve essere ottimizzata per riparare una determinata stenosi. Pertanto, lo sviluppo di procedure innovative e la valutazione del loro presunto successo in modelli sperimentali è fondamentale per soddisfare le esigenze cliniche. Con questo obiettivo, questo studio descrive un protocollo in cui la stenosi uretrale è stata indotta dall'elettrocauterizzazione nei ratti Wistar. La ricostruzione uretrale è stata eseguita 1 settimana dopo con un innesto di mucosa vestibolare, prelevato dal labbro inferiore e posizionato in modo onlay ventrale. Un uretrogramma ha mostrato un miglioramento significativo del diametro uretrale dopo l'uretroplastica rispetto al rispettivo valore dopo l'induzione della stenosi. Inoltre, il posizionamento dell'innesto è stato valutato mediante analisi di perfusione sanguigna utilizzando laser Doppler. Come previsto, un'area blu scuro corrispondeva all'innesto di mucosa buccale non vascolarizzata. Questa procedura può simulare con successo il normale processo fisiopatologico di lesione uretrale e modulazione tissutale, nonché la ricostruzione uretrale utilizzando un innesto di mucosa vestibolare in modo riproducibile e fungere da base per la ricerca futura basata sull'ingegneria tissutale o sugli innesti uretrali.

Introduzione

La ricostruzione uretrale è una delle principali sfide per i chirurghi urologici nella gestione delle lesioni uretrali nel contesto di stenosi, traumi o difetti congeniti¹. Con intento curativo, l'uretroplastica è il trattamento di scelta per la maggior parte dei pazienti, con difetti uretrali lunghi (>2 cm) e anteriori che richiedono una qualche forma di uretroplastica sostitutiva². Molti tessuti sono stati utilizzati come sostituti uretrali, tra cui innesti cutanei a pieno spessore o a spessore diviso di aree genitali o extragenitali, mucosa della parete vescicale o della mucosa vestibolare diffusa². Gli innesti di mucosa buccale presentano diversi vantaggi, come la provenire da un ambiente umido e glabro, la facilità di raccolta, la resistenza alle infezioni, un epitelio spesso, una ridotta probabilità di formazione di pseudo-diverticolo e una lamina sottile, che consente l'imbibizione e l'inosculazione precoce³. A differenza dei lembi, gli innesti non hanno afflusso di sangue, a seconda del letto vascolare del ricevente per sopravvivere⁴.

I modelli animali di innesti o lembi sono stati ampiamente utilizzati per sviluppare o perfezionare tecniche chirurgiche, studiare e comprendere la fisiologia dei tessuti, i meccanismi sottostanti e le cause di fallimento e valutare strategie di trattamento innovative ^5,6. Sebbene gli animali più grandi facilitino l'esecuzione tecnica, i roditori, in particolare ratti e topi, sono più facili da maneggiare e mantenere, resistenti alle malattie, più convenienti e, soprattutto, con gli strumenti per studiare i meccanismi molecolari, cruciali per testare terapie innovative ^5,6. Diversi modelli di lembi e innesti sono stati descritti nei ratti utilizzando diversi tessuti, vale a dire pelle, ossa, muscoli^{6, vasi} 5 e persino organi solidi⁷. Tuttavia, c'è scarsa ricerca nei modelli murini sugli innesti per la ricostruzione uretrale o l'ingegneria tissutale.

Ciononostante, i progressi della scienza traslazionale dipendono da modelli animali che imitano la malattia. Finora, l'ambiente fisiopatologico locale non è stato affrontato, poiché la ricostruzione uretrale viene eseguita immediatamente dopo la sua stenosi. In questo studio, questo studio si propone di eseguire una ricostruzione uretrale utilizzando un innesto di mucosa vestibolare in un ambiente fisiopatologico locale. Con questo obiettivo, la stenosi uretrale è stata indotta 1 settimana prima della sua ricostruzione. Questo modello sperimentale, eseguito sui ratti, permette di testare terapie innovative e di studiarne in futuro i meccanismi molecolari e i vantaggi clinici.

Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità alla direttiva 2010/63/UE. Le procedure sono state approvate dall'Ente istituzionale per il benessere degli animali, autorizzato dalla DGAV, l'autorità portoghese competente per la protezione degli animali (numero di licenza 0421/000/000/2021). Per il presente studio sono stati utilizzati ratti maschi Wistar Han IGS (Crl:WI(Han) (400-500 g) a 12-14 settimane di età. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali).

1. Preparazione delle soluzioni

1. Soluzione anestetica
   1. Riempire una siringa da 3 mL con 2,3 mL di medetomidina (1 mg/mL; 0,715 mg/kg di peso corporeo) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   2. Riempire una siringa da 3 mL con 1,55 mL di fentanil (0,05 mg/mL; 0,02 mg/kg di peso corporeo) e trasferire nella stessa provetta da centrifuga da 15 mL.
   3. Riempire una siringa da 10 mL con 6,15 mL di midazolam (5 mg/mL; 9,5 mg/kg di peso corporeo) e trasferire nella stessa provetta da centrifuga da 15 mL, ottenendo così una soluzione anestetica da 10 mL.
   4. Etichettare la provetta e conservarla a 4 °C al buio.
      NOTA: Questa combinazione di anestetici (medetomidina, fentanil e midazolam) fornisce una finestra chirurgica anestetica fino a 3 ore. La somministrazione di atipamezolo e flumazenil può invertire l'effetto.
2. Soluzione anti-sedativa
   1. Riempire una siringa da 1 mL con 0,7 mL di atipamezolo (5 mg/mL; 3,72 mg/kg di peso corporeo) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   2. Riempire una siringa da 10 mL con 9,3 mL di flumazenil (0,1 mg/mL; 1,56 mg/kg di peso corporeo) e trasferire nella stessa provetta da centrifuga da 15 mL, ottenendo così una soluzione antisedativa da 10 mL.
   3. Etichettare la provetta e conservarla a 4 °C al buio.
3. Soluzioni per l'analgesia postoperatoria
   1. Riempire una siringa da 1 mL con 0,5 mL di carprofene (50 mg/mL; 5 mg/kg di peso corporeo) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   2. Aggiungere 9,5 mL di soluzione di NaCl (0,9%), ottenendo una soluzione di 10 mL di carprofene.
   3. Riempire una siringa da 1 mL con 1 mL di buprenorfina (0,3 mg/mL; 0,01-0,05 mg/kg di peso corporeo) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   4. Aggiungere 9 mL di soluzione di NaCl (0,9%), ottenendo una soluzione di buprenorfina da 10 mL.
   5. Etichettare le provette e conservarle al buio a 4 °C.
4. Antibiotico perioperatorio
   1. Riempire una siringa da 2,5 mL con 2,5 mL di enrofloxacina (25 mg/mL; 10 mg/kg di peso corporeo) e trasferire in una provetta da centrifuga da 15 mL.
   2. Aggiungere 7,5 mL di soluzione di NaCl (0,9%), ottenendo una soluzione di enrofloxacina da 10 mL.
   3. Etichettare la provetta e conservarla a 4 °C al buio.
      NOTA: I dettagli di tutti i reagenti per preparare le soluzioni di cui sopra sono elencati nella Tabella dei materiali.

2. Induzione chirurgica della stenosi uretrale

NOTA: Le procedure chirurgiche sono state eseguite utilizzando uno stereomicroscopio (10x) (vedi Tabella dei materiali).

1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici prima dell'uso: lama del bisturi (numero 11), pinza appuntita, forbici a molla, pinza chirurgica, porta aghi oftalmici, forbici chirurgiche e un porta aghi. Utilizzare batuffoli di cotone sterili per pulire il campo operatorio.
2. Caricare la siringa con la soluzione anestetica prima di tenere in braccio il ratto.
3. Trattieni l'animale usando un tubo o un asciugamano e solleva la coda per esporre l'addome.
4. Tenere l'animale trattenuto ed eseguire un'iniezione intraperitoneale della soluzione anestetica (preparata al punto 1.1).
5. Testare i riflessi di ritiro del pedale del ratto per valutare l'anestesia.
6. Applicare il gel protettivo per gli occhi in entrambi gli occhi dell'animale. Eseguire un'iniezione sottocutanea della soluzione antibiotica (preparata al punto 1.1), a 10 mg/kg di peso corporeo.
7. Posizionare il ratto in posizione di decubito dorsale su un cuscinetto riscaldato e utilizzare un microscopio da dissezione con ingrandimento 10x o 20x per eseguire la procedura chirurgica.
8. Pulire il pene e la pelle addominale circostante con iodio povidone (100 mg/ml).
9. Ritrarre manualmente il prepuzio e posizionare una sutura superficiale (sutura 7.0; vedere la tabella dei materiali) nella faccia dorsale del glande del pene per applicare trazione al pene, lasciando il supporto dell'ago in posizione per mantenere il pene retratto.
10. Posizionare un catetere venoso da 22 G nell'uretra per il cateterismo utilizzando un gel lubrificante.
11. Utilizzando una lama di bisturi chirurgico (numero 11), eseguire un'incisione ventrale longitudinale di 1 cm nella pelle del pene.
12. Usando la pinza appuntita e le forbici a molla, sezionare gli strati di tessuto del pene fino a esporre l'uretra a livello dell'asta centrale.
13. Con un dispositivo di elettrocauterizzazione (vedi Tabella dei materiali), applicare una corrente con 10 W, per 1 s, negli aspetti laterali dell'uretra (in un punto su ciascun lato), ventralmente a livello dell'asta mediana del pene.
14. Chiudere l'incisione con una sutura da corsa riassorbibile 6.0 (vedi Tabella dei materiali).
15. Rimuovere il catetere uretrale. Rimuovere la sutura di trazione del pene.
16. Eseguire l'iniezione sottocutanea di analgesia: Carprofene a 5 mg/kg di peso corporeo e buprenorfina a 0,03 mg/kg di peso corporeo.
17. Caricare la siringa con la soluzione antisedativa (preparata al punto 1.2) e, con l'animale in decubito ventrale, tendere la pelle flaccida per somministrare un'iniezione sottocutanea della soluzione antisedativa.

3. Procedura chirurgica di uretroplastica con innesto di mucosa vestibolare

NOTA: Le procedure chirurgiche sono state eseguite utilizzando uno stereomicroscopio (10x) (vedi Tabella dei materiali).

1. Sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici necessari per questo intervento: pinza appuntita, forbici a molla, porta aghi oftalmici, forbici chirurgiche, porta aghi, tre pinze per zanzare e una lama per bisturi (numero 11). Utilizzare piccole spugne per pulire il campo operatorio.
2. Somministrare l'anestetico, l'antibiotico, il trattenimento e posizionare l'animale come descritto in precedenza (passaggi 2.2-2.8).
3. Pulire la mucosa buccale del labbro inferiore, il pene e la pelle addominale circostante con iodio povidone (100 mg/ml).
4. Posizionare tre punti di sutura (7.0 suture) nel labbro inferiore, su entrambi i lati e al centro, e lasciare una zanzara in ciascuno di essi per ritrarre il labbro inferiore ed esporre la mucosa interna.
5. Utilizzando forbici a molla e pinze appuntite, prelevare un innesto di 4 mm di diametro della mucosa buccale interna del labbro inferiore e posizionarlo in un piccolo recipiente con soluzione fisiologica sterile (0,9% NaCl).
6. Applicare la compressione nell'area donatrice con una spugna per l'emostasi.
7. Rimuovere i punti di sutura del labbro inferiore.
8. Esporre il pene come descritto in precedenza (passaggio 2.9).
9. Posizionare un catetere venoso da 22 G nell'uretra per il cateterismo utilizzando un gel lubrificante.
10. Usando le forbici a molla, eseguire un'incisione circonferenziale sub-coronale e deglove il pene alla base.
11. Usando la pinza appuntita e le forbici a molla, sezionare gli strati rimanenti ed esporre l'uretra.
12. Utilizzando una lama di bisturi chirurgico (numero 11) e forbici a molla, eseguire un'incisione ventrale longitudinale, partendo da 3 mm distale al solco coronale in un'estensione di 4 mm, spatolando l'uretra a livello della stenosi precedentemente indotta (fase 2).
13. Posizionare due suture di materiale 7.0, una su ciascun lato della spatolazione, e lasciare una zanzara in ciascuna di esse per ritrarre l'uretra.
14. Posizionare due punti di sutura 7.0 non assorbibili, uno a ciascuna estremità della spatola.
15. Posizionare l'innesto di mucosa vestibolare in modo onlay ventrale con il lato della mucosa rivolto verso il lume uretrale.
16. Passare una delle suture attraverso l'estremità dell'innesto ed eseguire una mezza ellisse con una sutura corrente.
17. Ripetere i passaggi 3.15 e 3.16 con l'altra sutura sull'altro lato dell'innesto.
18. Rimuovere il catetere uretrale. Riposizionare la pelle del pene.
19. Chiudere l'incisione circonferenziale sub-coronale con una sutura interrotta riassorbibile 6.0.
20. Rimuovere la sutura di trazione del pene.
21. Somministrare l'analgesia seguita dalla soluzione antisedativa, come descritto nei passaggi 2.16-2.17.

4. Monitoraggio postoperatorio

1. Osserva i ratti tre o quattro volte ogni ora, confermando il loro recupero dall'anestesia. Monitora la respirazione e valuta i riflessi dei pedali e degli occhi.
2. Iniettare analgesia per via sottocutanea ogni 12 ore per 48 ore.
   NOTA: Il carprofene è stato somministrato a 1 ml/500 mg di peso corporeo e la buprenorfina è stata somministrata a 0,5 ml/500 mg di peso corporeo (vedere Tabella dei materiali).
3. Somministrare cibo morbido per 48 ore dopo ogni procedura e acqua ad libitum.
4. Monitorare i ratti quotidianamente dopo l'intervento chirurgico e registrare il loro stato di salute e l'aspetto del sito operatorio. I segni valutati includono l'espressione facciale, la vocalizzazione, lo stato di attività, qualsiasi segno di dolore, l'ingestione di cibo e bevande, lo svuotamento e il sanguinamento.

5. Valutazione della perfusione sanguigna

NOTA: Il flusso sanguigno viene misurato immediatamente prima dell'induzione della stenosi, immediatamente prima dell'uretroplastica e immediatamente dopo l'uretroplastica.

1. Eseguire l'imaging di perfusione laser Doppler.
   1. Anestetizzare i ratti usando la soluzione anestetica (passaggio 1.1).
   2. Mettere il ratto in posizione supina su un termoforo a 37 °C con trazione peniena, come descritto al punto 2.9.
   3. Avviare l'imager di perfusione laser Doppler (vedere la tabella dei materiali) per ottenere i dati. Preimpostare l'area di interesse che deve essere letta dal raggio laser.
   4. Applicare la soluzione antisedativa (passaggio 1.2) per invertire l'anestesia.
   5. Utilizzando il software di analisi delle immagini, disegna la regione di interesse (ROI) intorno all'area del pene e registra i valori di flusso nel tempo.

6. Valutazione radiografica

NOTA: La conferma dell'induzione della stenosi e la risoluzione della stenosi dopo l'uretroplastica sono confermate con un uretrogramma retrogrado. Questa valutazione viene eseguita 1 settimana dopo l'induzione della stenosi (prima dell'uretroplastica) e 2 settimane dopo l'uretroplastica.

1. Eseguire un uretrogramma utilizzando un sistema angiografico monopiano (vedere la tabella dei materiali).
   1. Anestetizzare i ratti usando la soluzione anestetica.
   2. Posizionare l'animale sul materasso dell'angiografia in un decubito obliquo destro, con trazione peniena, come descritto al punto 2.9.
   3. Focalizzare il fascio conico sull'area pelvica dell'animale, compreso il pene.
   4. Posizionare un catetere venoso da 22 G avanzato di 2 mm nell'uretra distale.
   5. Iniziare a instillare 1 mL di mezzo di contrasto radiografico allo iodio (rapporto 1:1 di 623 mg/mL di soluzione di iopromide e 0,9% di NaCl) nell'uretra.
   6. Contemporaneamente, eseguire una radiografia semplice per identificare il contrasto radiografico che soddisfa il lume uretrale e valutare il diametro uretrale.
   7. Al termine dell'imaging, invertire l'anestesia con la soluzione antisedativa.

7. Eutanasia

NOTA: L'eutanasia viene eseguita 3 settimane dopo l'uretroplastica (4 settimane dopo l'induzione della stenosi), immediatamente dopo l'ultima valutazione della perfusione.

1. Riempire una siringa da 2,5 mL con 2 mL/kg di pentobarbital sodico (400 mg/mL).
2. Eseguire un'iniezione intraperitoneale della soluzione per l'eutanasia dell'animale.

Risultati

Un totale di 12 ratti Wistar maschi, del peso di 400-500 g e di 12-14 settimane, sono stati utilizzati per l'induzione della stenosi uretrale. Un uretrogramma retrogrado (RUG1) è stato eseguito 1 settimana dopo⁸, confermando il successo della tecnica. Il diametro uretrale è stato misurato in millimetri a livello dell'induzione della stenosi. Successivamente, è stata eseguita un'uretroplastica con innesto di mucosa vestibolare nella faccia ventrale dell'uretra di ratto. Gli stessi ratti sono stati ...

Discussione

L'uretroplastica con innesti di mucosa vestibolare è una pietra miliare nella ricostruzione uretrale. Tuttavia, dovrebbero essere sviluppate procedure innovative per ottimizzare quelle già descritte e stabilirne di nuove, come i materiali di ingegneria tissutale e gli innesti biologici, per ridurre le complicanze e la morbilità. Sono state pubblicate diverse procedure per stabilire modelli preclinici e definire le tecniche chirurgiche. Souza et ^al.1 hanno condotto uno studio su 12 conigli neozelan...

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Atipamezolo	OrionPharma		L'ANTISEDANO (atipamezolo) è indicato per l'inversione degli effetti sedativi e analgesici.
Buprenorfina	RichterPharma		La buprenorfina è un derivato dell'alcaloide oppioide tebaina, un analgesico più potente (25-40 volte) e di lunga durata rispetto alla morfina.
Carl Zeiss Opmi-1 FC Microscopio Chirurgico Stereo	Microscopia Carl Zeiss, Germania		OPMI 1 FC di ZEISS simboleggia qualità, precisione e affidabilità. Il sistema manuale è facile da usare e offre immagini ad alta fedeltà con le leggendarie ottiche ZEISS.
Carprofen	Zoetis		Il carprofene è un farmaco antinfiammatorio (FANS) non steroideo appartenente alla classe dell'acido propionico.
Catetere 22 G. x 1''	B Braun	Introcan Safety	Catetere IV di etilene propilene fluorurato (FEP) con costruzione più solida per accesso arterioso.
Enrofloxacina	Bayer		L'enrofloxacina è un antibiotico fluorochinolonico.
Fentanil	Braun	3644960	Il fentanyl è un potente analgesico oppioide sintetico.
Flumazenil	Fresenius Kabi		L'antagonista benzodiazepino è utilizzato per l'inversione completa o parziale degli effetti sedativi causati dalle benzodiazepine.
Cauterizzazione ad alta temperatura	Fiab	F7244	Cauteri usa e getta, sterili, alta temperatura (1200 °C; C), punta fine da 28 mm.
Gel Instillagel	Farco-pharma		Lubrificante a base di cellulosa con proprietà anestetiche locali e disinfettanti.
Iopromide	Bayer		Mezzo di contrasto iniettabile non ionico, con iodio.
Sistema di imaging laser Doppler (imager a perfusione moorLDI2-HIR e software dedicato)	MoorLDI-V6.0, Moor Instruments Ltd, Axminster, Regno Unito	5710	I modelli di angiogenesi utilizzano immagini Doppler laser per valutare la perfusione sanguigna negli arti posteriori, uno dei quali è legato chirurgicamente. Un software dedicato alla misurazione e al confronto consente di definire le regioni di interesse per la valutazione del flusso sanguigno sull'arto ischemico rispetto a quello non ischemico, stabilendo un "rapporto di reperfusione" che può essere valutato tutte le volte che necessario e per diversi giorni sullo stesso soggetto.
Gel Occhi Lubrithal	Dechra		Gel per gli occhi usato negli animali per prevenire la secchezza oculare durante l'anestesia. Azione lubrificante e idratante su cornea e congiuntiva.
Maschi di ratti Wistar Han IGS (Crl:WI(Han))	Charles River Laboratories, Spagna		Dodici o quattordici settimane
Metedomidina	Virbac	037/01/07RFVPT	La medetomidina è un farmaco sintetico utilizzato come anestetico chirurgico.
Midazolam	Labesfal		I farmaci a base di benzodiazepini vengono utilizzati per l'anestesia e la sedazione procedurale.
Sistema di Angiografia Monoplan	Philips Medical Systems	Azurion 7 M20	Un sistema radiografico fluoroscopico diagnostico stazionario progettato specificamente per ottimizzare la capacità degli utenti di valutare visivamente e quantitativamente l'anatomia e la funzione dei vasi sanguigni del cuore, del cervello e di altri organi, nonché del sistema linfatico.
Pinze per zanzare	Henry Schein	102-4346	Pinza emostatica Hartman-Mosquito in acciaio inossidabile curva da 3-1/2"
Portaago	Henry Schein	100-2570	Portaago Mayo-Hegar, acciaio inox, 14 cm
Portaago per aghi oftalmici	Asico	AE-6143	Barranquero portaago più delicato senza bloccaggio
Pentobarbital Sodio	Ecuphar		Il sodio pentobarbitale è il sale di sodio del pentobarbital utilizzato per l'eutanasia.
Pinze appuntite	Esculap	BD335R	Microforceps, punta da 0,30 mm
Polysorb 6.0	Medtronic (Covidien)	UL-101	Sutura Assorbibile Sintetica Rivestita mirava a ridurre la reazione infiammatoria nei tessuti, seguita da un incapsulamento graduale della sutura tramite tessuto connettivo fibroso.
Providone-Iodio	Mylan		Povidone-iodio 10% è un farmaco antisettico, usato come disinfettante prima e dopo l'intervento.
Scalpell Blade nº 11	B Braun	BB511	Acciaio al carbonio, sterile
Forbici a Molla	Henry Schein	600-4826	Forbici chirurgiche 31 castroviejo
Pinze chirurgiche	Esculap	BD33R	Microforceps, punta da 0,20mm
Forbici chirurgiche	Esculap	MA873R	Forbici Micro Iris, punte curve per schegge
SurgiPro 7.0	Medtronic (Coviden)	VP-702-X	Sutura monofilamento non assorbibile in polipropilene indicata per l'uso nella legatura generale dei tessuti molli.