Articolo metodologico

Ferritinofagia: Valutazione della degradazione selettiva del ferro mediante autofagia nei fibroblasti umani

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DOI:

10.3791/65110

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23 febbraio 2024

 , 
1Interfaculty Institute of Cell Biology, Eberhard Karls University Tübingen

In questo articolo

Sommario

Questo protocollo fornisce istruzioni dettagliate per l'esecuzione di valutazioni della ferritinofagia ad alto rendimento basate sull'immunofluorescenza in fibroblasti umani primari di origine cutanea.

Abstract

Le mutazioni nel gene dell'autofagia WDR45/WIPI4 sono la causa della neurodegenerazione associata al beta-propulsore (BPAN), un sottotipo di malattie umane note come neurodegenerazione con accumulo di ferro cerebrale (NBIA) a causa della presenza di depositi di ferro nel cervello dei pazienti. I livelli intracellulari di ferro sono strettamente regolati da una serie di meccanismi cellulari, tra cui il meccanismo critico della ferritinofagia. Questo articolo descrive come la ferritinofagia può essere valutata in fibroblasti umani primari di origine cutanea. In questo protocollo, utilizziamo condizioni di modulazione del ferro per indurre o inibire la ferritinofagia a livello cellulare, come la somministrazione di bafilomicina A1 per inibire la funzione lisosomiale e i trattamenti con citrato di ammonio ferrico (FAC) o deferasiox (DFX) per sovraccaricare o esaurire il ferro, rispettivamente. Tali fibroblasti trattati vengono quindi sottoposti a imaging ad alto rendimento e all'analisi quantitativa di localizzazione basata su CellProfiler di ferritina endogena e marcatori autofagososomali/lisosomiali, qui LAMP2. Sulla base del livello di ferritina autofagosomica/lisosomiale, si possono trarre conclusioni sul livello di ferritinofagia. Questo protocollo può essere utilizzato per valutare la ferritinofagia in fibroblasti primari derivati da pazienti BPAN o in altri tipi di cellule di mammifero.

Introduzione

Le proteine WIPI (WD-repeat interacting with phosphoinositides) sono effettori PI3P evolutivamente conservati con ruoli distinti nell'autofagia1. Le quattro proteine WIPI umane (da WIPI1 a WIPI4) si ripiegano in β-eliche a sette pale con due regioni evolutivamente conservate in cui amminoacidi omologhi e invarianti si raggruppano su siti opposti dell'elica. Un sito è allineato con la regione di legame del fosfoinositide nella pala dell'elica 5 e nella pala 6. L'altro sito è allineato con la regione di interazione proteina-proteina in cui le WIPI si associano a membri distinti del meccanismo dell'autofagia o fattori regolatori dell'autofagia2.

WIPI4 funziona nel controllo della regolazione dell'autofagia guidata dall'energia e a livello di controllo delle dimensioni dell'autofagosoma3 nascente in crescita. Una mutazione nel gene WIPI4 , nota come WDR45, è la causa della neurodegenerazione associata al beta-propulsore (BPAN), un sottotipo di neurodegenerazione con accumulo di ferro cerebrale (NBIA) nei pazienti umani che è caratterizzata da un alone di ferro ipointenso nella substantia nigra e nel globus pallidus4. La presenza di depositi anormali di ferro nei pazienti con BPAN provoca danni neuronali che si traducono in encefalopatia, ritardo dello sviluppo globale, convulsioni e, infine, parkinsonismo, demenza e spasticità5.

L'omeostasi del ferro è strettamente regolata da molteplici meccanismi cellulari, con la concentrazione di ferro citosolico controllata dai livelli di espressione e dalla funzionalità dei trasportatori di ferro, dei trasportatori di ferro e delle proteine di stoccaggio del ferro6 . La concentrazione di ferro citosolico, a sua volta, determina se sono coinvolte vie di degradazione come la ferritinofagia7 o la clearance proteasomica della ferritina8 ossidata.

Durante la ferritinofagia, la ferritina viene reclutata selettivamente negli autofagosomi dal recettore cargo NCOA4 e mirata alla degradazione lisosomiale in risposta a bassi livelli intracellularidi ferro 7. Dato il ruolo di WIPI4 nella regolazione delle dimensioni delle membrane autofagosomiali3, è ragionevole prevedere che la perdita di questa specifica funzione possa influenzare il sequestro selettivo della ferritina negli autofagosomi e, quindi, la ferritinofagia. Lo studio di questo passaggio chiave nel metabolismo del ferro può aprire le porte a opzioni terapeutiche per i pazienti con BPAN; Tuttavia, i protocolli comunemente usati per studiare la ferritinofagia nelle cellule umane sono in fase di sviluppo solo ora.

Questo articolo descrive un metodo ad alto rendimento basato sulla fluorescenza per valutare la ferritinofagia nelle cellule umane. L'applicazione di questo test alle cellule BPAN derivate da pazienti può fornire preziose informazioni su come la ferritinofagia differisce rispetto alle cellule umane sane e può servire come punto di riferimento per comprendere i meccanismi molecolari alla base di questa rara malattia umana.

Protocollo

1. Coltura e semina delle cellule primarie

  1. Prendi la fiala con le cellule congelate dal serbatoio dell'azoto liquido e tienila in ghiaccio fino a raggiungere la stanza di coltura cellulare. In un cappuccio precedentemente sterilizzato, tenere la fiala in mano in modo che la sospensione cellulare si scongeli. Risospendere le cellule e trasferirle in una piastra di coltura cellulare di 10 cm con 9 ml di DMEM preriscaldato con il 10% di siero fetale di vitello (FCS) e l'1% di penicillina-streptomicina (P/S). Agitare delicatamente in modo che le cellule si distribuiscano uniformemente sulla piastra e incubare per una notte a 37 °C e 5% di CO2
  2. La mattina seguente, guarda le celle per confermare che sono attaccate. Cambia il terreno in DMEM fresco + 10% FCS + 1% P/S e lascia che le cellule crescano fino a raggiungere l'80% di confluenza.
  3. Rimuovere il terreno di coltura, lavare 2 volte con DPBS, aggiungere 1 mL di tripsina alla piastra e incubarla a 37 °C e 5% di CO2 per 10 minuti. Aggiungere 9 mL di DMEM + 10% FCS alla piastra e risospendere le cellule.
  4. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga da 15 mL. Determinare manualmente la conta cellulare utilizzando una camera Neubauer e diluire la sospensione cellulare in DMEM + 10% FCS fino a raggiungere una concentrazione cellulare di 40.000 cellule/mL.
  5. In una piastra a 96 pozzetti con fondo di vetro, seminare 100 μL/pozzetto della sospensione cellulare. Incubare a 37 °C e 5% CO2 per 16 ore.

2. Trattamenti

  1. Preparare i seguenti trattamenti secondo la Tabella dei Materiali: terreno di controllo, terreno di controllo più deferasiox (DFX) per la chelazione del ferro o mezzo di controllo più citrato di ammonio ferrico (FAC) per il caricamento del ferro. Preparare tutti i trattamenti sia in presenza che in assenza di un inibitore lisosomiale (bafilomicina A1) per la valutazione del flusso ferritinofagico.
  2. Rimuovere il terreno di coltura dalla piastra e sostituirlo con il trattamento corrispondente (100 μL/pozzetto).
  3. Incubare a 37 °C e 5% CO2 per 6 ore.

3. Fissazione e colorazione

  1. Aspirare il mezzo di trattamento e lavare 2 volte con DPBS (Table of Materials).
  2. Aggiungere 100 μl di paraformaldeide al 3,7% (PFA, Table of Materials) per pozzetto. Fissare le celle per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
  3. Rimuovere il PFA e lavare le celle 2 volte con PBS/T (Tabella dei materiali).
  4. Blocco in PBS/T contenente l'1% di albumina sierica bovina (BSA) per 1 ora a 4 °C.
  5. Preparare la miscela di anticorpi primari (Tabella dei materiali) in PBS/T (anticorpo ferritina 1:50, anticorpo LAMP2 1:50).
  6. Lavare le cellule 2 volte con PBS/T e applicare 50 μl di miscela di anticorpi per pozzetto. Avvolgere le piastre con parafilm e incubare per una notte a 4 °C.
  7. La mattina seguente, preparare la miscela di anticorpi secondari (Tabella dei materiali) (1:200) in PBS/T.
  8. Lavare le cellule 2 volte con PBS/T e applicare 50 μl della miscela di anticorpi secondari per pozzetto. Incubare a 4 °C per 1 ora al buio.
  9. Preparare una soluzione di 5 μg/μl di 4',6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, Tabella dei materiali) in PBS a temperatura ambiente.
  10. Lavare le cellule 2 volte con PBS/T e aggiungere 100 μL/pozzetto di colorante DAPI. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente al buio.
  11. Lavare le cellule 2 volte con PBS e aggiungere 50 μL di PBS a ciascun pozzetto. Avvolgere le piastre con parafilm e conservare a 4 °C al buio.

4. Imaging automatizzato mediante microscopia confocale a scansione laser

  1. Sostituire il PBS nella piastra con 50 μl di PBS fresco a temperatura ambiente.
  2. Coprite la piastra con un foglio di alluminio e portatela in sala microscopia.
  3. Accendere il microscopio confocale a scansione laser, posizionare un supporto per campioni per piastre da 96 pozzetti sul tavolo del microscopio e selezionare un obiettivo appropriato (qui: 40x). Fare riferimento alla Tabella 1 per i dettagli.
  4. Regolare le impostazioni di imaging (Tabella 1).
    1. In Smart Setup, selezionare i laser e i filtri e assegnarli alle tracce (Tracce 1-3) per ottenere una qualità e una velocità dell'immagine ottimali (Tabella 1).
    2. Quando si seleziona il tipo di esperimento, fare clic su Tessere per abilitare l'opzione di selezionare e salvare le posizioni X,Y determinate sulla piastra.
    3. Nel modulo Imaging Setup , visualizzare i canali di acquisizione, le tracce ad essi assegnate e le loro lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione (Tabella 1).
    4. Nel modulo Modalità di acquisizione, selezionare quanto segue: Velocità di scansione: 6; Direzione: bidirezionale; Media: 2x; Bit per pixel: 8.
    5. Nel modulo Canali , regolare la potenza del laser, il foro stenopeico e il guadagno master per ciascun canale individualmente (Tabella 2). Ottimizza questi parametri per ottenere immagini correttamente esposte senza saturarle eccessivamente.
    6. Fare clic sul modulo Strategia di messa a fuoco .
      1. Selezionare Combina software Autofocus e Messa a fuoco definita.
      2. In Canale di riferimento e offset, selezionare il canale più stabile/più luminoso come riferimento (normalmente DAPI o 488 nm).
      3. In Ripetizioni e frequenza degli eventi di stabilizzazione, selezionare Standard.
    7. Nel modulo Autofocus software , selezionare quanto segue: Modalità | Intensità; Ricerca | Intelligente; Campionatura | Bene; Intervallo relativo.
    8. Fare clic sul modulo Riquadri .
      1. Seleziona Posizioni | posizioni singole.
      2. In Configurazione avanzata, navigare nella piastra, identificare una posizione per l'imaging e fare clic sul pulsante + nella scheda Impostazione posizione .
      3. Etichetta ogni posizione con informazioni aggiuntive che verranno registrate sui metadati dell'immagine. Per fare ciò, apri la scheda Proprietà , fai clic sull'icona della rotellina accanto al menu a discesa Categoria e fai clic su Nuovo per aprire una nuova finestra di dialogo in cui deve essere inserito il nome della nuova categoria . Per assegnare una categoria a una determinata posizione, selezionare la posizione, fare clic sulla scheda Proprietà , andare al menu a discesa Categorie e selezionare l'etichetta corrispondente.
        NOTA: Si consiglia di creare una categoria per ogni trattamento per etichettare ogni posizione con il trattamento a cui sono state sottoposte le cellule.
      4. In Sample Carrier (Portacampioni), selezionare Multiwell 96-Cellvis glass bottom #0 (fondo in vetro Multiwell 96-Cellvis) #0. Fare clic su Calibra per calibrare il microscopio sulla superficie della piastra. Scegli tra la calibrazione a 1 punto o a 7 punti a seconda delle specifiche del sistema.
      5. In Opzioni, selezionare una sovrapposizione di tessere del 10%. In Viaggia nelle regioni delle tessere, seleziona Pettine. Selezionare le seguenti opzioni: utilizzare la velocità del tavolino dal controllo del tavolino, utilizzare l'accelerazione del tavolino dal controllo del tavolino e la piramide dell'immagine durante l'acquisizione.
  5. Eseguire l'acquisizione dell'immagine e salvare i risultati dell'immagine (file CZI) e i metadati dell'immagine (file csv) su un disco rigido portatile.
  6. Esporta le immagini come file TIFF.

5. Analisi delle immagini ad alto rendimento

  1. Crea un foglio di calcolo di metadati separato con le seguenti colonne: Posizione, Pozzetto, Condizione, Serie e Set. I dati appropriati per riempire queste colonne vengono recuperati dal file di metadati originale proveniente dalla microscopia confocale a scansione laser.
  2. Scarica il software open source CellProfiler 4.2.4 (https://cellprofiler.org/previous-releases).
  3. Avviare CellProfiler 4.2.4 facendo doppio clic e importare la pipeline di CellProfiler (file supplementare 1) mediante trascinamento della selezione.
    NOTA: Di seguito sono riportati i passaggi per compilare la pipeline CellProfiler (File supplementare 1) per il riconoscimento automatico dei fibroblasti utilizzando la colorazione DAPI (Modulo 1, riconoscimento dei nuclei, vedere la Tabella 2) e la fluorescenza di fondo in singole cellule derivate da AF488 (Modulo 2, riconoscimento cellulare, vedere la Tabella 2). Il riconoscimento dei puncta (chiamati oggetti) è determinato dalla dimensione dei puncta e dall'intensità della fluorescenza dei puncta sullo sfondo (Modulo 3, riconoscimento dei puncta, vedi Tabella 2). Infine, in base ai confini delle celle, i puncta riconosciuti dal software vengono assegnati alle celle corrispondenti (Assign relationships). Una descrizione dettagliata di come implementare una pipeline CellProfiler per gli studi sull'autofagia è stata pubblicata in precedenza9. Inoltre, la Tabella 2 contiene le impostazioni di CellProfiler utilizzate in questo studio. Inoltre, il file supplementare 2 visualizza la pipeline CellProfiler (file supplementare 1) con schermate acquisite in ordine consecutivo e che fanno riferimento ai moduli descritti nella tabella 2.
  4. Prima di adattare la pipeline CellProfiler (file supplementare 1), trascinare i singoli file di immagine con estensione czi o una cartella contenente più file di immagine con estensione czi nel modulo Image .
  5. Personalizzare la pipeline di riconoscimento delle immagini. Nel modulo Nomi e Tipi , sostituire il codice c1-c3 con un codice che permetta al software di identificare e ordinare le immagini a canale singolo da analizzare.
  6. Ottimizzare le impostazioni della pipeline per i moduli IdentifyPrimaryObjects e IdentifySecondaryObjects ottimizzando le voci numeriche nei moduli. I valori utilizzati in questo studio sono presentati nella Tabella 2.
  7. Per tenere traccia delle regolazioni, selezionare l'opzione Modalità test facendo clic sul pulsante Avvia modalità test . Quindi fare clic sul pulsante Passaggio tra i moduli. Attendi le finestre popup (l'immagine di input originale, i contorni di riconoscimento disegnati sull'immagine originale e il risultato dell'analisi) che mostrano come un'immagine verrebbe analizzata con le impostazioni appena inserite.
  8. Una volta ottimizzata la pipeline, terminare la modalità di test. Eseguire l'analisi attivando la modalità di uscita dal test, quindi fare clic sul pulsante Analizza immagini .
  9. Al termine dell'analisi, verificare l'accuratezza del rilevamento delle celle e dei punti confrontando le immagini di input con gli output di sovrapposizione (confini delle celle, punti) generati da CellProfiler. In caso di insoddisfazione, regolare i valori numerici nei diversi moduli (Tabella 2) fino a quando il risultato dell'analisi non è sufficientemente accurato.

6. Analisi dei dati

  1. Dopo aver eseguito l'analisi, attendere che il software crei un insieme di file di testo tabellari con i risultati. Se si usa la pipeline CellProfiler fornita (file supplementare 1), cercare i file di output seguenti:
    1. Il file CellProfilerOutputCells , che elenca il numero di immagine assegnato dal software, il numero di cella assegnato alle singole celle, il nome del file originale e il percorso che indica la posizione in cui sono memorizzati i file, il numero di punti (ferritina, LAMP2) per cella e l'area media dei punti (ferritina, LAMP2) per cella.
    2. Il file CellProfilerOutputExperiment, che fornisce informazioni sui dettagli tecnici relativi all'esperimento (ad esempio, la versione del software, i canali delle immagini, i tag dei metadati).
  2. Apri questi file come fogli di calcolo.
  3. Procedere con l'analisi statistica dei conteggi dei puncta e dei numeri di co-localizzazione dei puncta utilizzando il software di statistica preferito (Table of Materials).

Risultati

I fibroblasti primari derivati dalla pelle umana (F-CO-60) provenienti da donatori sani (Figura 1A) sono stati preparati per le valutazioni della ferritinofagia utilizzando il trattamento con baflomicina A1 seguita da immunocolorazione della ferritina endogena e LAMP2, analisi automatizzata delle immagini e analisi basata su CellProfiler (Figura 1B).

La colocalizzazione della ferritina endogena e della LAMP2 è aumentata dopo che la degradazione lisosomiale della ferritina è stata bloccata dall'aggiunta di bafilomicina A1, coerentemente con la sua capacità di inibire gli enzimi V-ATPasi lisosomiale e, quindi, di bloccare la ferritinofagia7 (Figura 2). Inoltre, il riconoscimento cellulare basato su software, così come il riconoscimento della ferritina e del LAMP2, sono mostrati come esempio (Figura 2).

A questo proposito, va notato che la pipeline di CellProfiler qui descritta è estremamente versatile e può essere adattata a letture aggiuntive e/o alternative, ad esempio per valutare gli effetti di alcune mutazioni BPAN sulla crescita cellulare, sui mitocondri o su altri organelli nel contesto di sistemi funzionali di marcatori a singola cellula.

figure-results-1
Figura 1: Panoramica sperimentale. Rappresentazione grafica di (A) il processo di ferritinofagia e (B) il flusso di lavoro sperimentale per valutare la ferritinofagia in fibroblasti umani primari di origine cutanea, come descritto in questo protocollo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

figure-results-2
Figura 2: Immagini rappresentative. I fibroblasti umani primari di origine cutanea in terreno di controllo (condizioni alimentate) in (A) assenza o (B) presenza di bafilomicina A1 sono stati sottoposti a un'analisi di immunofluorescenza indiretta utilizzando anticorpi anti-ferritina e anti-LAMP2, mentre i nuclei cellulari sono stati colorati con DAPI. Vengono presentate immagini di fluorescenza esemplari acquisite con l'automazione della microscopia a scansione laser confocale (barre di scala: 10 μm). Cambiamenti nell'abbondanza e nella colocalizzazione di ferritina e LAMP2 possono essere osservati in seguito all'inibizione lisosomiale in seguito alla somministrazione di bafilomicina A1. Viene inoltre visualizzata l'analisi basata su CellProfiler, che mostra le sovrapposizioni di immagini derivate dal software di riconoscimento cellulare (viola), nuclei (blu), ferritina (verde), LAMP2 (rosso) e punti di co-localizzazione ferritina/LAMP2 (giallo). (C) Sezioni dell'immagine ingrandite (barra di scala = 10 μm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Le impostazioni della microscopia a scansione laser confocale utilizzate in questo studio. Clicca qui per scaricare questa tabella.

Tabella 2: Le impostazioni numeriche di CellProfiler utilizzate in questo studio. Clicca qui per scaricare questa tabella.

File supplementare 1: La pipeline CellProfiler utilizzata in questo studio. Clicca qui per scaricare questo file.

File supplementare 2: visualizzazione della pipeline CellProfiler (vedere File supplementare 1) con screenshot acquisiti in ordine consecutivo (vedere la tabella 2). Clicca qui per scaricare questo file.

Discussione

Questo metodo, che utilizza la microscopia a fluorescenza automatizzata combinata con l'analisi delle immagini basata su CellProfilerad accesso aperto 9 per valutare la localizzazione intracellulare dei fattori chiave della ferritinofagia, è stato progettato per fornire informazioni preziose sull'efficacia della clearance della ferritina lisosomiale attraverso l'autofagia selettiva, nota come ferritinofagia7. Questo protocollo consente la gestione di grandi set di campioni con più linee cellulari e trattamenti simultanei e la valutazione delle letture desiderate, come i numeri di ferritina punta e i numeri di ferritina puntina in colocalizzazione con LAMP2, che è un tipico marcatore lisosomiale per la valutazione del flusso di ferritinofagia. Tuttavia, va sottolineato che un'analisi accurata e automatizzata delle immagini dipende dalla qualità dell'immagine, che, a sua volta, dipende dalla specificità degli anticorpi e dall'imaging ottimale. Pertanto, l'analisi delle immagini basata su software deve essere eseguita solo con immagini di alta qualità.

La modulazione dei livelli di ferro nelle cellule può fornire preziose informazioni sui meccanismi che vengono attivati per regolare l'omeostasi del ferro nel contesto della malattia. Questo articolo descrive un metodo per studiare le malattie da BPAN in cellule derivate da pazienti trattate con agenti ferro-caricanti e ferro-chelanti. Deferasiox (DFX) è un noto chelante del ferro ampiamente utilizzato nel campo10. Dopo l'applicazione, intrappola il ferro libero nel citoplasma e innesca una risposta cellulare alla carenza di ferro. Poiché lo scopo di questo studio era quello di valutare la ferritinofagia, privare le cellule del ferro era un modo semplice per promuovere la degradazione della ferritina attraverso l'autofagia come meccanismo di compensazione per ricostituire il pool di ferro cellulare. Il citrato ferrico di ammonio (FAC), al contrario, viene utilizzato per caricare le celle con ferro. Le cellule attivano la sintesi della ferritina in risposta a concentrazioni eccessive e, quindi, tossiche di ferro citosolico11. Il citrato di ammonio ferrico, quindi, favorisce la sintesi della ferritina e l'intrappolamento del ferro all'interno degli eteropolimeri della ferritina, che possono, a loro volta, attivare la ferritinofagia.

Per studiare il flusso ferritinofagico, in questo protocollo, coloriamo selettivamente i protagonisti del processo - ferritina e lisosomi (qui marcati da LAMP2) - e valutiamo la loro colocalizzazione. Un'alta percentuale di puncta colocalizzanti è indicativa di un'efficace degradazione lisosomiale della ferritina. Per massimizzare le informazioni recuperate da tali esperimenti, è possibile utilizzare coloranti aggiuntivi o anticorpi marcatori.

Da notare che questo metodo presenta sfide tecniche. I fibroblasti primari derivati da diversi donatori umani possono proliferare e crescere in modo diverso in vitro. Quindi, per risultati comparabili, cellule diverse dovrebbero essere seminate nello stesso passaggio. Pertanto, si consiglia di eseguire un esperimento di test prima di procedere con questo protocollo per esaminare i tempi di raddoppio delle cellule o delle linee cellulari che si intendono utilizzare.

Questo metodo non si limita allo studio della ferritinofagia; Semplicemente cambiando i trattamenti e gli anticorpi utilizzati, può essere riproposto per valutare varie altre vie selettive di autofagia; ad esempio, la mitofagia può essere esaminata utilizzando CCCP come induttore di stress mitocondriale e gli anticorpi optineurin, LC3 e LAMP2 per la colorazione12.

Nel complesso, la combinazione di acquisizione automatizzata di immagini e analisi CellProfiler costituisce un potente strumento per la valutazione funzionale ad alto rendimento di singoli fibroblasti umani. Ciò è particolarmente rilevante per lo studio delle malattie umane, per le quali l'analisi e il confronto di ampie coorti di cellule derivate da pazienti e cellule sane derivate da donatori sono di grande interesse.

Dichiarazioni

Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato finanziato dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondazione tedesca per la ricerca) Project-ID 259130777 - SFB 1177 (progetto E03). La Figura 1 è stata creata utilizzando BioRender.

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo
NomeAziendaNumero di catalogoCommenti
Linee cellulari
Fibroblasti umani primari derivati dalla pelle Biopsia cutanea, donatore umano sano, Biobanca Clinica Universitaria Tü bingen, Approvazione etica 389/2019BO2F-CO-60, passaggio 9
Trattamenti di coltura cellulareConcentrazione finale (composto)
Terreno di controlloDMEM 10%FCS(solo DMSO)
Terreno di controllo + bafilomicinaA1DMEM 10%FCS100 nM bafilomicina A1
Terreno di controllo + deferasiox (DFX)DMEM 10%FCS30 µ M DFX
Mezzo di controllo + DFX + bafilomicinaA1DMEM 10%FCS30 µ M DFX, 100 nM bafilomicina A1
Terreno di controllo + citrato di ammonio ferrico (FAC)DMEM 10%FCS0,05 mg/mL FAC
Terreno di controllo + FAC + bafilomicinaA1DMEM 10%FCS0,05 mg/mL FAC, 100 nM bafilomicina A1
Materiale
Albumina [BSA] Frazione VAppliChemA1391
Alexa 488 capra a-coniglioLife TechnologiesA-11008
Alexa 546 capra a-topoLife TechnologiesA-11003
Bafilomicina A1Sigma Aldrich196000
BioLite Colture cellulari trattate con piastre da 10 cmThermo Scientific130182
DAPIAppliChemA4099
Deferasiox (ICL-670)SelleckchemS1712
DMEM GlutamaxGibco31966
DMSO AppliChemA3672
DPBS senza calcio né magnesioGibco14190094
Siero fetale bovino (FCS)Gibco10437-028
Citrato di ammonio ferrico (FAC)MerckF5879
Anti-FERRITIN (Milza umana)Rockland200-401-090-0100
LAMP2 (H4B4)Santa CruzSc-18822
Paraformaldeide (PFA)Sigma-Aldrich441244
PBS 10x Dulbecco' sAppliChemA0965
PenStrep (1,00U/mL penicillina, 100 mg/mL streptomicina)Life Technologies15140-122
Tripsina-EDTA (0,05%) con fenolo rossoGibco25300
Tween20AppliChemA4974
96 piastre con fondo in vetro a 96 pozzetti #0CellvisP96-0-N
Solution
3,7% paraformaldeide (PFA)PFA disciolto in PBS, pH 7,5 
Bafilomicina A1 100 mM stockBafilomicina A1 diluita in DMSO
Citrato di ammonio ferrico (FAC) 100 mg/mL stockFAC diluito in acqua distillata doppia autoclavata
PBS/TPBS, integrato con il 10% di Tween20 
PBS/T + BSAPBS, integrato con 10% Tween20, 1% BSA 
Software
CellProfiler 4.2.4https://cellprofiler.org/
GraphPad PrismDotmatics
Microsoft Excel Versione 16.50Microsoft Office Plus 365

Riferimenti

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  2. Proikas-Cezanne, T., et al. WIPI-1α (WIPI49), a member of the novel 7-bladed WIPI protein family, is aberrantly expressed in human cancer and is linked to starvation-induced autophagy. Oncogene. 23 (58), 9314-9325 (2004).
  3. Bakula, D., et al. WIPI3 and WIPI4 β-propellers are scaffolds for LKB1-AMPK-TSC signalling circuits in the control of autophagy. Nature Communications. 8 (1), 15637(2017).
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