Descriviamo un protocollo per isolare e coltivare cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC). Forniamo anche metodi dettagliati per produrre stress di taglio e allungamento per studiare lo stress meccanico nelle hSVEC.
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Articolo metodologico
Vena safena umana Isolamento delle cellule endoteliali ed esposizione a livelli controllati di stress da taglio e allungamento
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
La chirurgia dell'innesto di bypass coronarico (CABG) è una procedura per rivascolarizzare il miocardio ischemico. La vena safena rimane utilizzata come condotto CABG nonostante la ridotta pervietà a lungo termine rispetto ai condotti arteriosi. Il brusco aumento dello stress emodinamico associato all'arterializzazione dell'innesto provoca danni vascolari, in particolare l'endotelio, che possono influenzare la bassa pervietà dell'innesto della vena safena (SVG). Qui, descriviamo l'isolamento, la caratterizzazione e l'espansione delle cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC). Le cellule isolate dalla digestione della collagenasi mostrano la tipica morfologia del ciottolo ed esprimono i marcatori delle cellule endoteliali CD31 e VE-caderina. Per valutare l'influenza dello stress meccanico, in questo studio sono stati utilizzati protocolli per studiare i due principali stimoli fisici, sforzo di taglio e allungamento, su SVG arterializzati. Le hSVEC sono coltivate in una camera di flusso a piastre parallele per produrre stress di taglio, mostrando allineamento nella direzione del flusso e una maggiore espressione di KLF2, KLF4 e NOS3. Le hSVEC possono anche essere coltivate in una membrana di silicio che consente l'allungamento cellulare controllato che imita l'allungamento venoso (basso) e arterioso (alto). Il pattern F-actina delle cellule endoteliali e la secrezione di ossido nitrico (NO) sono modulati di conseguenza dall'allungamento arterioso. In sintesi, presentiamo un metodo dettagliato per isolare le hSVEC per studiare l'influenza dello stress meccanico emodinamico su un fenotipo endoteliale.
Introduzione
La disfunzione delle cellule endoteliali (EC) è un attore chiave nel fallimento dell'innesto di vena safena 1,2,3,4. L'aumento sostenuto dello sforzo di taglio e dello stiramento ciclico induce il fenotipo proinfiammatorio delle cellule endoteliali della vena safena umana (hSVEC)3,4,5,6. I percorsi molecolari sottostanti non sono ancora completamente compresi e protocolli standardizzati per studi in vitro ....
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Protocollo
Segmenti inutilizzati di vene safene sono stati ottenuti da pazienti sottoposti a chirurgia di bypass aortocoronarico presso l'Heart Institute (InCor), University of São Paulo Medical School. Tutti gli individui hanno dato il consenso informato a partecipare allo studio, che è stato esaminato e approvato dal comitato etico locale.
1. Isolamento, coltura e caratterizzazione di cellule endoteliali primarie della vena safena umana (hSVECs)
- Preparazione
- Autoclave un paio di pinze dritte o curve e forbici di tessuto (7-8 cm).
- Preparare la gelatina sterile. Mescolare 0,1 g (0,1% p/v) o 3 g (3% p/v) di ....
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Risultati
Tipicamente, le EC aderenti possono essere osservate 3-4 giorni dopo l'estrazione. Le hSVEC formano inizialmente gruppi di cellule e mostrano una tipica morfologia "ciottolata" (Figura 1B). Esprimono i marcatori EC CD31 (Figura 1C,D) e VE-caderina (Figura 1D). Le hSVEC possono essere facilmente propagate su un piatto di coltura cellulare trattata non rivestita e mantengono il fenotipo endoteliale in coltura fino a o.......
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Discussione
Il segmento della vena safena deve essere di almeno 2 cm per isolare con successo le hSVEC. Piccoli segmenti sono difficili da gestire e legano le estremità del vaso per mantenere la soluzione di collagenasi per isolare le cellule. La ridotta superficie luminale non produce cellule sufficienti per espandere la coltura. Per ridurre al minimo il rischio di contaminazione con non-EC, la manipolazione del segmento della vena safena deve essere molto delicata durante l'intera procedura. È importante prestare attenzione quando.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Ringraziamenti
JEK è sostenuto da sovvenzioni della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo [FAPESP-INCT-20214/50889-7 e 2013/17368-0] e del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (INCT-465586/2014-7 e 309179/2013-0). AAM è sostenuto da sovvenzioni della Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2015/11139-5) e del Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico-CNPq (Universal - 407911/2021-9).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,25% tripsina-0,02% EDTA soluzione | Gibco | 25200072 | |
| 15 µ vetrino I 0,4 Luer | Ibidi | 80176 | |
| 4',6-Diamidino-2-Fenilindolo, Dilattato (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D3571 | |
| Stazione di carico equibiassiale a 6 pozzetti da 25 mm | Flexcell International Corporation | LS-3000B25. Vetrino a camera VJW | |
| a 8 pozzetti con pozzetto rimovibile | Thermo Fisher Scientific | 154453 | |
| Acido acetico (glaciale) | Millipore | 100063 | |
| Lastra acrilica Plexiglass | |||
| Anticorpo | Abcam | ab24590 | |
| Anti-CD31, anticorpo FITC | Thermo Fisher Scientific | MHCD3101 | |
| Anticorpo anti-VE-caderina | Segnalazione cellulare | 2500 | |
| Piastre Bioflex collagene I | Flexcell International Corporation | BF3001C Soluzione di | |
| albumina sierica bovina | Sigma-Aldrich | A8412 | |
| Sutura di cotone EP 3,5 15 x 45 cm | Brasuture | AP524 | |
| Primer diretto per ciclofilina | Thermo Fisher Scientific | Custom Thermo | |
| Fisher Scientific Dimetil | su misura | ||
| Sigma-Aldrich | D4540 | ||
| EBM-2 terreno basale | Lonza | CC3156 | |
| EGM-2 SingleQuots supplements | Lonza | CC4176 | |
| Siero fetale bovino (FBS) | Thermo Fisher Scientific | 2657-029 | |
| Sistema di tensione Flexcell FX-5000 | Flexcell International Corporation | FX-5000T | |
| Mezzo di montaggio acquoso Fluoromount | Sigma-Aldrich | F4680 | |
| Gelatina da pelle suina | Sigma-Aldrich | G2500 | |
| Glicerolo | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| IgG anti-topo di capra Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11001 | |
| Capra anti-Coniglio IgG Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11008 | |
| Eparina sodica da mucosa intestinale suina 5000 UI/mL | Blau Farmacê utica | SKU 68027 | |
| Sistema di pompaggio Ibidi (Pompa + Unità fluidica) | Ibidi | 10902 | |
| KLF2 primer diretto | Thermo Fisher Scientific | su misura | |
| Thermo Fisher Scientific | su misura | ||
| Thermo Fisher Scientific Primer | su misura | ||
| Thermo Fisher Scientific Analizzatore | su misura | ||
| Sievers Instruments | NOA-280i-1 | ||
| NOS3 primer diretto | Thermo Fisher Scientific | su misura | |
| Thermo Fisher Scientific | progettato | ||
| misuraSigma-Aldrich | 158127 | ||
| Set di perfusione 15 cm, ID 1,6 mm, rosso, serbatoi da 10 mL | Ibidi | 10962 | |
| Falloidina - Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Falloidina - Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A12380 | |
| Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4 | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Ioduro | di potassioKit PCR verde Sigma-Aldrich | 221945 | |
| QuanTitec SYBR | Qiagen | 204143 | |
| QuantStudio 12K flex | Applied Biosystems | 4471087 | |
| RNeasy micro kit | Quiagen | 74004 | |
| Vetrino scorrevole (24 mm x 60 mm) | Vetro Knittel | VD12460Y1D.01 | |
| Nitrito di sodio | Sigma-Aldrich | 31443 | |
| Sistema di sintesi a primo filamento SuperScript IV | Thermo Fisher Scientific | 18091200 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Trypan blu colorante 0,4% | Gibco | 15250-061 | |
| Collagenasi di tipo II da Clostridium histolyticum | Sigma-Aldrich | C6885 |
Riferimenti
- Allaire, E., Clowes, A. W. Endothelial cell injury in cardiovascular surgery: the intimal hyperplastic response. The Annals of Thoracic Surgery. 63 (2), 582-591 (1997).
- Ali, M. H., Schumacker, P. T. Endothelial responses to mechani....
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Ristampe e permessi
