Questo articolo dimostra un metodo standardizzato per la costruzione di sferoidi tumorali tridimensionali. Viene inoltre descritta una strategia per l'osservazione degli sferoidi e l'analisi di apprendimento profondo basata su immagini utilizzando un sistema di imaging automatizzato.
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Articolo metodologico
Generazione di sferoidi tumorali 3D per studi di valutazione dei farmaci
* These authors contributed equally
In questo articolo
Sommario
Abstract
Negli ultimi decenni, oltre alle cellule coltivate monostrato, gli sferoidi tumorali tridimensionali sono stati sviluppati come uno strumento potenzialmente potente per la valutazione dei farmaci antitumorali. Tuttavia, i metodi di coltura convenzionali non hanno la capacità di manipolare gli sferoidi tumorali in modo omogeneo a livello tridimensionale. Per affrontare questa limitazione, in questo articolo, presentiamo un metodo conveniente ed efficace per costruire sferoidi tumorali di medie dimensioni. Inoltre, descriviamo un metodo di analisi basato su immagini utilizzando un software di analisi basato sull'intelligenza artificiale in grado di scansionare l'intera lastra e ottenere dati sugli sferoidi tridimensionali. Sono stati studiati diversi parametri. Utilizzando un metodo standard di costruzione sferoidale tumorale e un sistema di imaging e analisi ad alto rendimento, l'efficacia e l'accuratezza dei test farmacologici eseguiti su sferoidi tridimensionali possono essere notevolmente aumentate.
Introduzione
Il cancro è una delle malattie più temute dagli esseri umani, anche a causa del suo alto tasso di mortalità1. Negli ultimi anni, la possibilità di curare il cancro è aumentata con l'introduzione di nuove terapie 2,3,4,5. I modelli in vitro bidimensionali (2D) e tridimensionali (3D) vengono utilizzati per studiare il cancro in un ambiente di laboratorio. Tuttavia, i modelli 2D non possono valutare immediatamente e accuratamente tutti i parametri importanti che indicano la sensibilità antitumorale; pertanto, no....
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Protocollo
1. Costruzione sferoidale
- Trattamento antiadesione della piastra di coltura
- Pipettare 100 μL di reagente anti-adesione in ciascun pozzetto di una piastra a 48 pozzetti con un fondo a forma di U e conservare per 10 minuti. Dopo 10 minuti, aspirare il reagente di rivestimento e lavare due volte con PBS sterilizzato.
- Mettere la piastra di coltura in un incubatore (37 °C in aria umidificata con 5% di CO2) fino all'uso.
- Preparazione, raccolta e conteggio delle cellule
- Utilizzare il terreno di coltura specifico delle cellule per la coltura delle cellule in palloni di coltura cellulare (
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Risultati
La Figura 1A,B mostra il processo utilizzato per la costruzione di sferoidi tumorali in questo studio. Per prima cosa abbiamo seminato le cellule in una piastra inferiore a U a 48 pozzetti. Questo passaggio è quasi lo stesso di quello utilizzato nella coltura cellulare 2D. Abbiamo tenuto la piastra in un incubatore comune con acqua che circonda i pozzi in modo che le cellule depositate iniziassero a formare sferoidi in un processo di auto-assemblaggio. In condizioni operati.......
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Discussione
Il microambiente svolge un ruolo importante nella crescita del tumore. Può influenzare la fornitura di matrici extracellulari, gradienti di ossigeno, nutrizione e interazione meccanica e, quindi, influenzare l'espressione genica, le vie del segnale e molte funzioni delle cellule tumorali 19,20,21. In molti casi, le cellule 2D non producono tali effetti o addirittura producono effetti opposti, influenzando così la valutazione dei.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo tutti i membri dei nostri laboratori per il loro contributo critico e suggerimenti. Questa ricerca è stata sostenuta dal Key Project della Jiangsu Commission of Health (K2019030). La concettualizzazione è stata condotta da C.W. e Z.C., la metodologia è stata eseguita da W.H. e M.L., l'indagine è stata eseguita da W.H. e M.L., la cura dei dati è stata eseguita da W.H., Z.Z., S.X. e M.L., la preparazione della bozza originale è stata eseguita da Z.Z., J.Z., S.X., W.H., e X.L., la revisione e l'editing sono stati eseguiti da Z.C., l'amministrazione del progetto è stata eseguita da C.W. e Z.C. e l'acquisizione dei finanziamenti è stata condotta da C.W. Tutti ....
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| 0,5-10 μ L Puntali per pipette | AXYGEN | T-300 | |
| 1.5 mL Microprovette a prova di ebollizione | Axygen | MCT-150-C | |
| 100-1000μ L Puntali per pipette | KIRGEN | KG1313 | |
| 15 mL Tubo da centrifuga | Nest | 601052 | |
| 200 μ L Puntali per pipette | AXYGEN | T-200-Y | |
| Gel 3D | Avatarget | MA02 | |
| Piastra inferiore a 48 pozzetti Avatarget | P02-48UWP | ||
| 50 mL Centrifuga Tube Nest | 602052 | ||
| Alamar Blue | Thermo | ||
| Soluzione di risciacquo antiaderente | STEMCELL | #07010 | |
| Certificato FBS | BI | 04-001-1ACS | |
| Acqua deionizzata | aladdin | W433884-500ml | |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco | 11965-092 | |
| DMSO | sigma | D2650-100ML | |
| Excel sofware | Microsoft Office | ||
| Graphpad prisma sofware | Software GraphPad | ||
| Imager ad alto contenuto e sistema SMART | Avatarget | 1-I01 | |
| Image J software | National Institutes of Health | ||
| Integratore di insulina-transferrina-selenio-A (100X) | Gibco | 51300-044 | |
| Parafilm | Bemis | PM-996 | |
| PBS | Solarbio | P1020 | |
| Penicillina / streptomicina Sol | Gibco | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875-093 | |
| Scientific Fluoroskan Ascent | Thermo | Fluoroskan Ascent | |
| T25 Flask | JET Biofil | TCF012050 | |
| Tripsina, 0,25% (1X) | Hyclone | SH30042,01 |
Riferimenti
- Carioli, G., et al. European cancer mortality predictions for the year 2021 with focus on pancreatic and female lung cancer. Annals of Oncology. 32 (4), 478-487 (2021).
- Katti, A., Diaz, B. J., Caragine, C. M., Sanjana, N. E., Dow, L. E. CRISPR in cancer ....
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Ristampe e permessi
