Isolamento, caratterizzazione ed estrazione totale del DNA per l'identificazione di funghi endofiti in piante micoeterotrofe

Sommario

Il presente articolo si propone di fornire protocolli dettagliati e adeguati per l'isolamento di funghi endofiti associati alle piante, la conservazione a lungo termine degli isolati, la caratterizzazione morfologica e l'estrazione del DNA totale per la successiva identificazione molecolare e analisi metagenomica.

Abstract

Le piante micoeterotrofe presentano una delle forme più estreme di dipendenza micorrizica, avendo perso totalmente la loro capacità autotrofica. Essenziali come qualsiasi altra risorsa vitale, i funghi a cui queste piante si associano intimamente sono essenziali per loro. Pertanto, alcune delle tecniche più rilevanti nello studio delle specie micoeterotrofe sono quelle che consentono di studiare i funghi associati, in particolare quelli che abitano le radici e gli organi sotterranei. In questo contesto, vengono comunemente applicate tecniche per l'identificazione di funghi endofiti coltura-dipendenti e coltura-indipendenti. L'isolamento degli endofiti fungini fornisce un mezzo per identificarli morfologicamente, analizzare la loro diversità e mantenere inoculi per applicazioni nella germinazione simbiotica dei semi di orchidea. Tuttavia, è noto che esiste una grande varietà di funghi non coltivabili che abitano i tessuti vegetali. Pertanto, le tecniche di identificazione molecolare indipendenti dalla coltura offrono una copertura più ampia della diversità e dell'abbondanza delle specie. Questo articolo si propone di fornire il supporto metodologico necessario per l'avvio di due procedure di indagine: una cultura-dipendente e una indipendente. Per quanto riguarda il protocollo coltura-dipendente, vengono descritti in dettaglio i processi di raccolta e mantenimento dei campioni vegetali dai siti di raccolta alle strutture di laboratorio, insieme all'isolamento dei funghi filamentosi dagli organi sotterranei e aerei delle piante micoeterotrofe, al mantenimento di una collezione di isolati, alla caratterizzazione morfologica delle ife mediante la metodologia di coltura a vetrino e all'identificazione molecolare dei funghi mediante estrazione totale del DNA. Comprendendo metodologie indipendenti dalla coltura, le procedure dettagliate includono la raccolta di campioni di piante per le analisi metagenomiche e l'estrazione del DNA totale dagli organi vegetali aclorofilliani utilizzando un kit commerciale. Infine, per le analisi vengono suggeriti anche protocolli di continuità (ad esempio, reazione a catena della polimerasi [PCR], sequenziamento) e vengono qui presentate tecniche.

Introduzione

I funghi endofiti sono, per definizione, quelli che abitano l'interno degli organi e dei tessuti vegetali in caso di infezioni poco appariscenti (cioè senza causare danni al loro ospite)^1,2. Questi funghi possono interagire in modo neutro o benefico con le piante ospiti, possono conferire resistenza agli agenti patogeni e alle condizioni ambientali sfavorevoli e possono contribuire alla sintesi di composti benefici per la pianta (ad esempio, fattori di crescita e altri fitormoni)^1,3. Gli endofiti micorrizici sono funghi che stabiliscono associazioni mi....

Protocollo

1. Raccolta di campioni di piante

1. Raccolta di campioni per metodi dipendenti dalle impostazioni cultura
   1. Scava con cura gli organi sotterranei; Questi possono essere radici, steli, rizomi o organi di deposito della pianta da raccogliere. Oltre ai terreni molto compatti, raccogli questi campioni a mano.
      NOTA: L'uso di strumenti come cazzuole o palette in questa fase è sconsigliato, in quanto può danneggiare le fragili strutture delle piante micoeterotrofe e può causare la contaminazione dei tessuti da parte di funghi non endofiti.
   2. Raccogli il maggior numero possibile di organi sotterranei. Conservare i campioni in sacchett....

Risultati

Nel protocollo di isolamento, considerando che c'è contaminazione dall'acqua utilizzata nell'ultimo lavaggio e che la contaminazione viene rilevata anche nelle piastre di Petri con frammenti inoculati, possono essere intraprese azioni diverse, a seconda del tipo di contaminante (Tabella 1). Questa procedura deve essere ripetuta fin dall'inizio in caso di contaminanti fungini altamente sporulanti, che presentano anche una crescita accelerata, e batteri a moltiplicazione in.......

Discussione

La disinfestazione superficiale dei campioni vegetali è una delle fasi più critiche del protocollo presentato. È altamente auspicabile che non si contaminino le stoviglie PDA con gocce dell'ultimo lavaggio. I batteri sono spesso osservati come contaminanti nelle piastre di isolamento, di solito più dei funghi sporulanti presenti nell'aria, considerando che i batteri endofiti sono comuni anche all'interno dei tessuti vegetali ^3,11. Pertanto, l'aggiunta di antibiot.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Nastro			(di qualsiasi azienda, per il montaggio di nastri adesivi in analisi micromorfologiche)
Ampicillina	Sigma-Aldrich	A5354	(per l'installazione di frammenti vegetali; possono essere utilizzati altri antibiotici - controllare il passaggio 2.2.1)
Autoclave			(di qualsiasi azienda, per la sterilizzazione dei materiali in molti passaggi)
Agari batteriologici	Sigma-Aldrich	A1296	(per molti passaggi)
Soluzioni C1, C2, C3, C4, C5 e C6	Qiagen	12888-50	(acquistabile con il kit DNeasy PowerSoil)
Centrifuga	Merck/Eppendorf	5810 G	(per l'estrazione totale del DNA da isolati fungini)
Provette da centrifuga	Merck	CLS430828	(per la raccolta di campioni)
Cloroformio	Sigma-Aldrich	C2432	(per l'estrazione totale del DNA da isolati fungini)
Congo red	Supelco	75768	(per colorazione delle ife)
Cryotube	Merck	BR114831	(per molti passaggi)
Etanolo	Supelco	100983	Sarà necessario effettuare le diluizioni appropriate (per molti passaggi)
Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)	Sigma-Aldrich	3609	(per l'estrazione totale del DNA da isolati fungini)
Carta da filtro	Merck	WHA10010155	(per molti passaggi)
Provette in vetro	Merck	CLS7082516	(per la crioconservazione in chicchi di riso non decorticati)
Lana di vetro	Supelco	20411	(per la crioconservazione in chicchi di riso non decorticati)
Glucosio	Sigma-Aldrich	G8270	O destrosio (per crioconservazione in vermiculite)
Glicerolo	Sigma-Aldrich	G5516	O glicerina (per la crioconservazione in vermiculite, per la preparazione di LPCB)
Isopropanolo	Sigma-Aldrich	563935	(per l'estrazione totale del DNA da funghi isolati)
Acido lattico	Sigma-Aldrich	252476	(per la preparazione di LPCB - colorazione delle ife)
Soluzione di blu di lattofenolo (LPCB)	Sigma-Aldrich	61335	(per la colorazione delle ife)
Cappa			(classe I, di qualsiasi azienda, per molti passaggi)
Microscopio			(di qualsiasi azienda, per l'osservazione delle ife)
MB Spin Colonne	Qiagen	12888-50	(acquistabile con il kit DNeasy PowerSoil)
Blu metilico (blu cotone)	Sigma-Aldrich	M5528	(per la preparazione di LPCB - colorazione ife)
Provetta per microcentrifuga (1,5 mL)	Merck	HS4323	(per l'estrazione totale di DNA da isolati fungini)
Provetta per microcentrifuga (2 mL)	Merck	BR780546	(per molti passaggi)
Olio minerale			(per la conservazione di isolati fungini)
Sacchetti			Dimensioni medie 150 mm x 200 mm (per la raccolta dei campioni)
Piastra di Petri (vetro, 120 mm x 20 mm)	Merck/Pyrex	SLW1480/10D	(autoclavabile, per coltura di funghi su vetrino, preferire quelli più alti)
Piastra di Petri (vetro, 50 mm x 17 mm)	Merck/Aldrich	Z740618	(per la purificazione di isolati fungini); in alternativa: piastre di Petri in polistirene (sterili, irradiate con γ, non autoclavabili)
Piastre di Petri (vetro, 80 mm x 15 mm)	Merck/Brand	BR455732	(per l'installazione di frammenti vegetali); in alternativa: piastre di Petri in polistirene (sterili, irradiate con γ, non autoclavabili)
Fenolo	Sigma-Aldrich	P1037	(per l'estrazione totale del DNA da isolati fungini, per la preparazione di LPCB)
Porcellana mortaio	Sigma-Aldrich	Z247464	(per l'estrazione totale del DNA da isolati fungini)
Pestello in porcellana	Sigma-Aldrich	Z247502	(per l'estrazione totale del DNA da isolati fungini)
Destrosio di patate agar (PDA)	Millipore	P2182	(per molti passaggi)
Tubi PowerBead	Qiagen	12888-50	(acquistato con il kit DNeasy PowerSoil)
Montaggio rapido medium (Entellan)	Sigma-Aldrich	1.0796	(per coltura di vetrini per funghi)
Gel di silice	Supelco	717185	(per la crioconservazione in chicchi di riso non decorticati)
Cloruro di sodio (NaCl)	Sigma-Aldrich	S9888(	per l'estrazione totale del DNA da isolati fungini)
Sodio dodecil solfato (SDS)	Sigma-Aldrich	L3771	Lauryl sulfate sale sodico (per l'estrazione totale del DNA da isolati fungini)
Ipoclorito di sodio (con cloro			(prodotto commerciale, per disinfestazione superficiale)
Kit per l'estrazione del DNA nel suolo (kit DNeasy PowerSoil)	Qiagen	12888-50	(per l'estrazione totale del DNA dagli organi delle piante)
Spettrofotometro - Nanodrop 2000/2000c	ThermoFisher Scientific ND2000CLAPTOP		(per l'estrazione totale del DNA dagli organi delle piante)
Stereomicroscopio			(=microscopio da dissezione, di qualsiasi azienda, per analisi macromorfologiche)
Tetraciclina	Sigma-Aldrich	T7660	(per l'installazione di frammenti vegetali)
Thermoblock	Merck/Eppendorf	EP5362000035	(o di altre aziende)
Omogeneizzatore tissutale e lizzatore cellulare	SPEX SamplePrep		2010 Geno/Grinder - Omogeneizzatore Tissutale Automatizzato e Lizere Cellulare (per l'estrazione totale di DNA da organi vegetali)
Blu di toluidina O	Sigma-Aldrich/Harleco	364-M	(per la colorazione delle ife)
Trealosio	Sigma-Aldrich	T9531	(per crioconservazione in vermiculite)
Tris Base Solution (Tris)	Sigma-Aldrich	T1699	(per l'estrazione totale di DNA da isolati fungini)
Chicchi di			(per la crioconservazione)
Bacchetta			(o un adattamento - controllare il passaggio 5.4.1, per la coltura di vetrini per funghi)
vermiculite			(per la crioconservazione in vermiculite)
Vortexer	Sigma-Aldrich/BenchMixer	BMSBV1000	(per l'estrazione totale del DNA da isolati fungini)
Estratto di lievito	Sigma-Aldrich	Y1625	(per la crioconservazione in vermiculite)