Arricchimento di vescicole extracellulari native e ricombinanti di micobatteri

Summary

Questo protocollo descrive in dettaglio l'arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche native (mEV) da colture axeniche di Mycobacterium smegmatis (Msm) e come possono essere progettate e arricchite le MsmEV ricombinanti contenenti mCherry (un reporter fluorescente rosso). Infine, verifica il nuovo approccio con l'arricchimento di MsmEVs contenenti la proteina EsxA di Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

La maggior parte dei batteri, compresi i micobatteri, genera vescicole extracellulari (EV). Poiché le vescicole extracellulari batteriche (bEV) contengono un sottoinsieme di componenti cellulari, tra cui metaboliti, lipidi, proteine e acidi nucleici, diversi gruppi hanno valutato le versioni native o ricombinanti delle bEV per la loro potenza protettiva come candidati vaccini a subunità. A differenza delle vescicole extracellulari native, le vescicole extracellulari ricombinanti sono molecolarmente ingegnerizzate per contenere uno o più immunogeni di interesse. Nell'ultimo decennio, diversi gruppi hanno esplorato diversi approcci per la generazione di bEV ricombinanti. Tuttavia, qui, riportiamo la progettazione, la costruzione e l'arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche ricombinanti (mEV) nei micobatteri. A tal fine, utilizziamo Mycobacterium smegmatis (Msm), un micobatterio avirulento del suolo come sistema modello. Per prima cosa descriviamo la generazione e l'arricchimento di vescicole extracellulari native di Msm. Quindi, descriviamo la progettazione e la costruzione di mEV ricombinanti che contengono mCherry, una proteina reporter fluorescente rossa, o EsxA (Esat-6), un importante immunogeno di Mycobacterium tuberculosis. Raggiungiamo questo risultato fondendo separatamente mCherry ed EsxA N-termini con il C-terminale di una piccola proteina Msm Cfp-29. Cfp-29 è una delle poche proteine abbondantemente presenti delle MsmEV. Il protocollo per generare e arricchire mEV ricombinanti da Msm rimane identico alla generazione e all'arricchimento di EV native di Msm.

Introduction

Nonostante lo sviluppo e la somministrazione di un'ampia gamma di vaccini contro le malattie infettive, ancora oggi, ~30% di tutti i decessi umani si verifica ancora a causa^{di malattie} trasmissibili. Prima dell'avvento del vaccino contro la tubercolosi (TB) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - la tubercolosi era il killer numero uno (~10.000-15.000/100.000 abitanti)². Con la somministrazione di BCG e il facile accesso ai farmaci antitubercolari di prima e seconda linea, entro il 2022, i decessi correlati alla tubercolosi sono drasticamente scesi a ~ 1 milione / anno entro il 2022 (cioè, ~ 15-20/100.000 popolazione¹). Tuttavia, nelle popolazioni endemiche di tubercolosi del mondo, i decessi correlati alla tubercolosi continuano a attestarsi a ~100-550/100.000 abitanti¹. Sebbene gli esperti riconoscano diverse ragioni che portano a questi numeri distorti, la protezione mediata da BCG che non dura nemmeno per la prima decade di vita sembra essere la ragione principale 3,4,5,6,7. Di conseguenza, dati i rinnovati "Obiettivi di Sviluppo Sostenibile" delle Nazioni Unite e la "Strategia End TB" dell'OMS, c'è uno sforzo globale concertato per sviluppare un vaccino alternativo molto superiore al BCG che forse fornisca una protezione permanente dalla tubercolosi.

A tal fine, diversi gruppi stanno attualmente valutando ceppi di BCG modificati/ricombinanti, specie micobatteriche non patogene e attenuate diverse dal BCG e candidati subunità 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18 . Tipicamente, i vaccini a subunità sono liposomi caricati selettivamente con poche proteine immunogeniche purificate (~1-6) a lunghezza intera o troncate del patogeno. Tuttavia, a causa del loro ripiegamento spurio in conformazioni non native e/o interazioni casuali non funzionali tra le proteine caricate, le subunità spesso mancano di epitopi nativi e germanici e, quindi, non riescono a innescare sufficientemente il sistema immunitario^14,19,20.

Di conseguenza, le vescicole extracellulari (EV) dei batteri hanno preso piede come alternativa promettente 21,22,23,24,25,26. Tipicamente, le vescicole extracellulari batteriche (bEV) contengono un sottoinsieme dei loro componenti cellulari, tra cui alcune porzioni di acidi nucleici, lipidi e centinaia di metaboliti e proteine^27,28. A differenza dei liposomi in cui poche proteine purificate sono caricate artificialmente, le bEV contengono centinaia di proteine caricate naturalmente e ripiegate in modo nativo con una migliore propensione a innescare il sistema immunitario, specialmente senza la spinta / aiuto di adiuvanti e agonisti del recettore Toll-like (TLR)^27,28,29. È in questa linea di ricerca che noi e altri abbiamo esplorato l'utilità delle vescicole extracellulari micobatteriche come potenziali booster di subunità per BCG³⁰. Nonostante le preoccupazioni che le vescicole extracellulari manchino di carichi antigenici uniformi, le vescicole extracellulari di Neisseria meningitidis attenuata hanno protetto con successo gli esseri umani contro il meningococco di sierogruppo^{B 31,32}.

Almeno in teoria, le migliori vescicole extracellulari che potrebbero aumentare bene il BCG sono le vescicole extracellulari arricchite da batteri patogeni. Tuttavia, l'arricchimento delle vescicole extracellulari generate da micobatteri patogeni è costoso, dispendioso in termini di tempo e rischioso. Inoltre, le vescicole extracellulari generate da agenti patogeni possono essere più virulente che protettive. Dati i potenziali rischi, riportiamo qui un protocollo ben collaudato per l'arricchimento di vescicole extracellulari generate da Msm coltivato assinicamente, un micobatterio avirulento.

Tuttavia, nonostante codifichino diversi ortologhi di proteine patogene, i micobatteri avirulenti mancano di diversi antigeni vaccinali/epitopi proteici patogeni necessari per preparare sufficientemente il sistema immunitario verso la protezione³³. Pertanto, abbiamo anche esplorato la costruzione e l'arricchimento di vescicole extracellulari ricombinanti di Msm attraverso l'ingegneria molecolare, in modo tale che una porzione significativa di qualsiasi proteina patogena di interesse espressa e tradotta in Msm, debba raggiungere le sue vescicole extracellulari. Abbiamo ipotizzato che una o più delle prime 10 proteine abbondanti delle vescicole extracellulari Msm, una volta fuse con la proteina di interesse, aiutino in tale traslocazione.

Mentre stavamo iniziando a standardizzare l'arricchimento delle vescicole extracellulari micobatteriche (mEV) nel nostro laboratorio, nel 2011, Prados-Rosales et al. hanno riportato per la prima volta la visualizzazione e l'arricchimento delle mEV in vitro³⁰. Successivamente, nel 2014, lo stesso gruppo ha pubblicato una versione modificata del metodo³⁴ del 2011. Nel 2015, Lee et al. hanno anche riportato un metodo standardizzato in modo indipendente per l'arricchimento di mEV sempre da colture axeniche di micobatteri³⁵. Combinando entrambi i protocolli^34,35 e incorporando alcune delle nostre modifiche dopo un'accurata standardizzazione^, descriviamo qui un protocollo che aiuta ad arricchire regolarmente le mEV da colture axeniche di micobatteri³⁶.

Qui, descriviamo in dettaglio l'arricchimento delle vescicole extracellulari specifiche per Msm, che è un'estensione di un protocollo^{pubblicato 36} per l'arricchimento delle vescicole extracellulari micobatteriche in generale. Descriviamo anche in dettaglio come costruire mEV ricombinanti (R-mEVs) che contengono la proteina mCherry (come reporter fluorescente rosso) ed EsxA (Esat-6)^37,38,39, un immunogeno predominante e una potenziale subunità vaccinogeno di Mycobacterium tuberculosis. Il protocollo per l'arricchimento delle R-mEV rimane identico a quello che abbiamo descritto per l'arricchimento delle EV native da Msm.

Protocol

1. Condizioni di crescita di Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli e loro derivati

1. Media
   1. Brodo liquido Middlebrook 7H9
      1. Preparare la soluzione madre Tween-80 al 20% preriscaldando il volume richiesto di acqua bidistillata (ddw) in un bicchiere di vetro a ~45-50 ^oC in un microonde, aggiungere il volume richiesto di Tween-80 utilizzando un cilindro graduato appropriato e agitare continuamente su un piccolo agitatore magnetico per portare il Tween-80 al 20% in soluzione uniforme. Filtrare il Tween-80 al 20% attraverso un filtro di smaltimento da 0,22 um e conservare la soluzione madre giallo pallido a 4 ^oC.
         NOTA: Tutte le tracce di Tween-80 nel cilindro graduato devono essere trasferite nel becher per un'accurata concentrazione finale. Non sterilizzare in autoclave il materiale Tween-80 preparato. Filtrare (utilizzare 0,22 μM), sterilizzare e conservare a 4 ^oC.
      2. Seguire le istruzioni del produttore per la preparazione del brodo 7H9. Sospendere 4,7 g di polvere 7H9 in 900 mL di ddw. Aggiungere 2 mL di glicerolo, mescolare il contenuto e sterilizzare in autoclave a 121 ^°C, 15 psi per 20 minuti.
         NOTA: Non aggiungere l'arricchimento ADC Middlebrook (ADC) e Tween-80 prima della sterilizzazione in autoclave.
      3. Dopo che il terreno sterilizzato in autoclave si è raffreddato a temperatura ambiente (RT, cioè ~25 ^oC), in una cabina di biosicurezza standard di tipo A2, aggiungere in modo asettico 10 ml di 100 mL di ADC (1 finale) e 2,5 ml (0,05 mL finali) di Tween-80 al 20%. Filtrare la miscela attraverso un'unità filtrante monouso da 0,22 μm e conservare la soluzione madre trasparente di colore verde giallastro molto chiaro a 4 ^oC.
         NOTA: Il pH del terreno deve essere compreso tra ~6,6 e 6,8 (se <6,4 o >7,0, scartare e rinfrescare). Conservare a 4 ^oC (stabile per 3-4 settimane). Si consiglia vivamente di filtrare il materiale filtrante 7H9 (dopo l'aggiunta di ADC e Tween-80) due volte attraverso due unità filtranti monouso indipendenti da 0,22 μm.
   2. Brodo liquido (media minima) di Sauton
      1. Sciogliere L-asparagina (0,4% p/v) e acido citrico (0,2% p/v) in 950 mL di ddw. Aggiungere 1 mL ciascuno di 1.000 stock (in ddw) di fosfato di potassio bibasico appena preparato (incolore; brodo 10 g/20 mL; finale 1x 0,5 g/L); solfato di magnesio eptaidrato (incolore; brodo 10 g/20 mL; finale 1x 0,5 g/L); e citrato di ammonio ferrico (marrone molto chiaro; brodo 1,6 g/40 mL; finale 1x 0,04 g/L) e mescolare bene su un agitatore magnetico.
         NOTA: Nella migliore delle ipotesi, le azioni 1.000x possono avere 2 settimane; se più vecchio, preparare brodi freschi; conservarli a RT al buio (ad es. all'interno di un armadio/scaffale). Se il citrato di ammonio ferrico è marrone scuro, scartalo e rendilo fresco. È meglio aggiungere i tre sali nell'ordine indicato al punto 1.1.2.1. Agitare la soluzione ogni volta prima di aggiungere ogni soluzione salina.
      2. Misurare e annotare il pH utilizzando un pHmetro; Assicurati che sia compreso tra 3,1 e 3,2. Se il pH è superiore a 3,7, scartare i brodi e prepararli freschi. Per regolare il pH a 7,4, utilizzare tutte le gocce di idrossido di sodio 10 N necessarie. Monitorare il pH finale agitando continuamente la soluzione/il terreno su un agitatore magnetico.
      3. Aggiungere 4,76 mL di glicerolo, 0,25 mL di 20% Tween-80 (0,005% finale, vedere anche la nota per il passaggio 2.2.1.3) e solo allora portare il volume a 1 L. Quindi, sterilizzare con il filtro il doppio di 1 litro di terreno con due filtri separati per lo smaltimento da 0,22 μm. Conservare il terreno limpido e incolore a 4 ^oC (stabile per 2 settimane).
         NOTA: Solo dopo che il pH è stato regolato a 7,4, aggiungere glicerolo. In caso contrario, il supporto diventerà bianco torbido. Se è torbido, scartatelo (non provate a riscaldarlo) e preparatelo fresco. Per tutte le preparazioni di mEVs, usa Sauton's appena preparato.
   3. Base in agar Middlebrook 7H11
      1. Seguire le istruzioni del produttore per la preparazione. Sospendere 19 g di polvere 7H11 in 900 mL di ddw. Aggiungere 5 mL di glicerolo, agitare su un agitatore magnetico per ottenere una sospensione uniforme (verde pallido; pH da 6,6 a 6,8; se >7,2, scartare e preparare fresco) e autoclavare a 121 ^oC, 15 psi e per 20 min.
         NOTA: Non aggiungere ADC e 0.05% Tween-80 prima della sterilizzazione in autoclave.
      2. Quando il mezzo si raffredda a ~50 ^°C, in modo asettico in una cabina di biosicurezza di tipo A2, aggiungere 100 mL di ADC (portato a RT) e 2,5 mL di Tween-80 al 20% (0,05% finale (portato a RT). Erogare immediatamente in modo asettico in piastre di Petri.
         NOTA: Le piastre sono stabili a 4 ^°C per almeno 4-6 settimane. Assicurarsi che le piastre siano a RT durante la notte prima di avvolgerle per la conservazione a 4 ^°C. In caso contrario, l'umidità rimarrà intrappolata nelle piastre durante l'incubazione a 37 ^°C.
   4. Brodo Miller Luria Bertani (LB) e base di Agar
      1. Seguire le istruzioni del produttore per la preparazione. Per preparare LB Broth, sospendere 25 g di polvere in 1.000 ml di ddw e mescolare delicatamente per 5 minuti in un bicchiere di vetro su un agitatore magnetico. In caso di sospensione uniforme, aliquotare i volumi richiesti in flaconi di terreno (ad esempio, 300 ml in un flacone di terreno da 500 ml) e in autoclave. Per preparare LB Agar, sospendere 40 g di polvere in 1.000 mL di ddw e in autoclave (12 g di polvere in 300 mL ddw in un flacone di vetro da 500 mL).
2. Condizioni di crescita
   NOTA: Tutte le fasi del lavoro di coltura batterica devono essere eseguite in una cabina di biosicurezza (tipo A2). Tutte le colture devono essere processate con provette, flaconi e puntali di pipette sterili.
   1. Giorno 1
      1. Aggiungere 1 mL ciascuno di scorta di glicerolo di Msm (da -80 o C congelatore) a 2 x 10 mL (in provette centrifugate coniche sterili da 50 mL) di brodo 7H9 appena sterilizzato, raffreddato e preriscaldato (~37 o C), agitare tre volte, chiudere i coperchi e incubare le provette per una notte a 37 ^oC e 200-220 giri/min (agitatore dell'incubatrice).
         NOTA: Per coltivare Mycobacterium tuberculosis (Mtb), seguire passaggi simili ma incubare le provette da 50 mL per 4-6 giorni a 37 ^oC e 120-150 rpm (agitatore dell'incubatrice) in impostazioni BSL3. Seguire TUTTE le linee guida internazionali e le pratiche di biosicurezza dei patogeni BSL3 e del gruppo di rischio 3 durante la manipolazione e lo scarto di Mtb e delle sue colture. Utilizzare una cabina di biosicurezza di tipo B2 per la manipolazione di Mtb e delle sue colture.
   2. Giorno 2
      1. Quando OD 600 (A 600nm; densitometro cellulare) raggiunge ~1,0, centrifugare le colture Msm per 10 minuti a 3.200 × g e RT (centrifuga da banco). Scartare i surnatanti utilizzando puntali sterili per pipette da 1 mL.
         NOTA: Il passaggio precedente rimane lo stesso per le culture Mtb, tranne per il fatto che il numero di giorni è 4-7. Assicurarsi di non toccare il pellet batterico con il puntale della pipetta.
      2. Lavaggio: A ciascun pellet di Msm, aggiungere 1 mL di terreno Sauton preriscaldato (a RT) (passaggio 1.1.2) e risospendere delicatamente con puntali per pipette da 1 mL per ottenere una sospensione uniforme. Utilizzando puntali per pipette sterili, portare i volumi a 10 mL (in ciascuno) con lo stesso terreno. Centrifugare le sospensioni per 10 minuti a 3.200 × g e RT ed eliminare i surnatanti. Ripeti questo passaggio ancora una volta.
         NOTA: Il passaggio precedente rimane lo stesso per le culture Mtb.
      3. Risospendere le cellule Msm lavate due volte in 20 mL (ciascuna) di Sauton preriscaldato (preriscaldato in un incubatore a piastre o agitatore) e misurare la densità ottica delle cellule a 600 nm. Inoculare il volume richiesto di colture di Msm in matracci sterili di Erlenmeyer da 1 L contenenti ~330 mL di Sauton sterili in modo che l'OD_{finale di 600} sia ~0,05.
         NOTA: Le risospensioni devono sempre iniziare in un piccolo volume. Se il volume finale viene aggiunto direttamente al pellet in un unico passaggio, le celle rimarranno come pellet diffusi (un indicatore di scarsa risospensione). L'unico modo per risolvere il problema consiste nel ridurre le impostazioni cultura e ripetere la risospensione come consigliato. Il passaggio di cui sopra rimane lo stesso per le culture Mtb.
   3. Giorno 2/3
      1. Incubare la coltura da 330 mL nell'agitatore dell'incubatore a 200 giri/min e 37 ^°C fino a quando il diametro esterno della coltura₆₀₀ raggiunge ~0,3. Quindi, lavare le celle una volta (simile al passaggio 1.2.2.2 ma con lo stesso volume) e quindi risospendere il pellet nello stesso volume. Distribuire 50 mL delle colture risospese ciascuna in sei palloni sterili di Erlenmeyer da 1 L, ciascuno contenente 280 mL di Sauton sterile preriscaldato con 1/10 di Tween-80 normalmente utilizzato (0,05%), cioè 0,005% (vedere anche la nota del passaggio 2.2.1.3. per capire perché 1/10^{di th}). Il diametro esterno finale_{di 600} deve essere di circa 0,05.
         NOTA: Per le colture Mtb, al posto dei flaconi Erlenmeyer, utilizzare bottiglie a rullo (di capacità 1/2/4 L). Regolare il volume di coltura per flacone in modo tale che, una volta conservato sull'apparecchio a rulli, il prodotto non raggiunga l'imboccatura del flacone. Il volume effettivo della bottiglia a rulli dipenderà dalla capacità della bottiglia a rulli.
      2. Incubare ciascuna delle colture da 330 mL nell'agitatore dell'incubatore a 200 giri/min e 37 ^°C fino a quando OD₆₀₀ raggiunge 2,0-2,5 (~15-18 h).
         NOTA: Per le colture Mtb, assicurarsi che l'OD₆₀₀ finale sia ~1.0-1.2 (richiede ~5-8 giorni).

2. Arricchimento di mEV Msm mediante centrifugazione a gradiente di densità

1. Giorno 4
   1. Centrifugare i ~2 L di colture Msm in stadio esponenziale medio in 6 flaconi da centrifuga sterile da 400 ml a 4 ^°C per 20 minuti a ~8.000 × g (centrifuga da pavimento). Raccogliere il surnatante di coltura esaurito in due matracci Erlenmeyer da 1 L pre-raffreddati e sterilizzati in autoclave e conservare un'aliquota del pellet per eventuali procedure analitiche (come SDS-PAGE e western blotting, non dettagliate qui).
      NOTA: Tutti i passaggi successivi devono essere eseguiti a freddo (~ 4 °C) per mantenere al meglio l'integrità delle mEV. Gli mEV sono abbastanza stabili a RT, ma la refrigerazione è un must per la stabilità a lungo termine (si sconsiglia il congelamento e lo scongelamento ripetuti). Durante la crescita della coltura axenica, le mEV si dissociano dalla superficie di Msm/Mtb e si accumulano nel surnatante della coltura/terreno esausto.
   2. Filtrare il surnatante di coltura Msm prima attraverso l'unità filtrante di smaltimento da 0,45 μm e poi attraverso l'unità filtrante di smaltimento da 0,22 μm per rimuovere tutte le tracce di batteri.
      NOTA: La filtrazione diretta attraverso i filtri da 0.22 μm spesso soffoca le unità filtranti (poiché il pellet batterico potrebbe essere disturbato durante l'esecuzione del passaggio 2.1.1.). Per generare surnatanti di coltura Mtb, eseguire tre filtrazioni di colture Mtb (ad esempio, prima fase di filtrazione con un'unità filtrante monouso da 0,45 μm; due fasi di filtrazione consecutive con unità filtranti monouso da 0,22 μm) prima di spostare i filtrati di coltura in impostazioni BSL-2.
2. Giorno 4/5
   1. Utilizzare i concentratori a membrana da 30 kDa per concentrare il filtrato di coltura Msm (~2 L) fino a ~ 38 mL centrifugando il filtrato di coltura a 4 ^°C, 20 min e a 3.200 × g.
      1. Prelavare prima i concentratori con liquido sterile freddo (~15 mL) (lavare a 4 ^°C, 5 min e a 3.200 × g).
      2. Lavare con ~15 mL di Sauton's freddo prefiltrato (stesse condizioni dell'acqua (2.2.1.1.)) per rimuovere ogni traccia di sostanze chimiche (utilizzate durante la produzione).
      3. Poiché sono tecnicamente necessari ~130 centricon (se un solo utilizzo) per concentrare ~2 L di filtrato di coltura, riutilizzare i centricon almeno 3-4 volte, se necessario. Procedere come descritto di seguito: concentrare da 15 mL a 0,5-1,0 mL (seguire il passaggio 2.2.1), trasferire il concentrato in una provetta per ultracentrifuga pulita, sterilizzata in autoclave e fredda da 38 mL, quindi trasferire nuovamente il filtrato di coltura non concentrato rimanente nei centricon utilizzati per ripetere la concentrazione.
         NOTA: L'uso di concentratori da 24, 30 kDa per concentrare 2 L di filtrato di coltura richiederà fino a 6 ore. Dopo aver concentrato il filtrato di coltura, anche il Tween-80 si concentra e può bloccare il concentratore. L'uso di Tween-80 allo 0,005% finale (anziché allo 0,05%) nei terreni di Sauton aiuta a prevenire questo blocco. La ridotta concentrazione di Tween-80 non influisce sulla sospensione uniforme di Msm durante la crescita e non causa l'aggregazione delle cellule Msm. Tuttavia, poiché le cellule Mtb si aggregano allo 0,005% Tween-80, utilizzare lo 0,05% Tween-80 per i veicoli elettrici specifici per Mtb.
   2. Trasferire il filtrato di coltura concentrato di Msm (~38 mL) in una provetta da centrifuga in polipropilene da 40-50 mL pulita, lavata (con ddw) e pre-raffreddata e sottoporla a una centrifugazione in due fasi, prima a 4.000 × g e poi a 15.000 × g, entrambe le fasi a 4 ^oC per 20 minuti (per rimuovere tutti i detriti). Utilizzare una centrifuga da pavimento per lo stesso.
3. Giorno 5/6
   1. Trasferire il surnatante di coltura in una provetta per ultracentrifuga in polipropilene preraffreddato da 38,5 mL e centrifugarlo in un'ultracentrifuga a 100.000 × g per 4 ore a 4 ^°C.
      NOTA: Una benna oscillante funziona meglio a questa velocità. Assicurarsi di riempire la provetta per ultracentrifuga fino all'orlo e di disporre di una provetta per ultracentrifuga bilanciata di peso equivalente. Se uno dei tubi è attaccato al secchio oscillante dopo la centrifugazione (che si verifica a causa della condensa), utilizzando una pinza, rimuoverlo delicatamente dal rotore. Rimuovendo l'umidità condensata presente sulla superficie esterna dell'ultracentrifuga prima dell'ultracentrifugazione si evita che si attacchi.
   2. Conservare il surnatante in una provetta preraffreddata da 50 mL (vedi nota). Capovolgere la provetta dell'ultracentrifuga su una carta assorbente fresca e priva di lanugine per rimuovere le tracce del surnatante. Risospendere il pellet in 600 μL di soluzione tampone HEPES (50 mM HEPES e 150 mM NaCl, pH 7,4; filtrare prima dell'uso).
      NOTA: Salvare il surnatante solo come backup. Il pellet nativo mEV si presenta come una macchia gelatinosa, di 5-7 mm di diametro, da giallo grigiastro opaco a traslucido. Se non è visibile alcun pellet, ripetere il passaggio 2.3.1 riutilizzando il surnatante salvato. Se dopo aver ripetuto il passaggio 2.3.1 non viene visualizzato alcun pellet, scartare e ricominciare dal passaggio 1.2. Il pellet impiega tempo per riessere sospeso. Si consiglia di aggiungere il tampone HEPES e lasciarlo per una notte a 4 ^°C per una facile risospensione. Risospendere delicatamente ma con pipettaggio ripetuto (utilizzare i puntali P200 per una migliore risospensione) fino a una risospensione uniforme.
4. Giorno 6
   1. Sottoporre il pellet risospeso a centrifugazione a gradiente di densità a base di "iodixanolo".
      1. Stratificare il pellet risospeso sul fondo della provetta per ultracentrifuga in polipropilene ultratrasparente da 13 mL pulita, lavata (con ddw) e pre-raffreddata e miscelare delicatamente (utilizzare una pipetta da 1 mL) con ~4 mL di soluzione di "iodixanolo" a gradiente di densità inerte (disponibile in commercio come soluzione ~60% p/v). Dopo aver stratificato il pellet risospeso sul fondo della provetta (fino a un massimo di 5 mL), quindi rivestire con 1 mL (p/v) ciascuno di 40%, 30%, 20% e 10% di sottoscorte di "iodixanolo" nel rispettivo ordine (preparare le sottoscorte (con tampone HEPES) dal 60% di scorte). Quindi, aggiungere 4 ml di sottostock al 6% (preparato dal 60% di stock con tampone HEPES) nella parte superiore per riempire la provetta.
         NOTA: Preparare la sfumatura appena prima dell'uso; Non conservare e utilizzare mai.
      2. Con cautela (senza agitare), pesare il tubo in un bicchiere di vetro e trasferirlo delicatamente nel rotore del secchio oscillante.
         NOTA: La pesatura è necessaria per bilanciare con un tubo fittizio (anch'esso pesato).
      3. Sottoporlo ad ultracentrifugazione a 141.000 × g per 16 ore a 4 ^oC.
5. Giorno 7
   1. Rimuovere con cautela la provetta (vedere la nota del passaggio 2.3.1) e raccogliere le frazioni da 1 mL in provette per microcentrifuga appena sterilizzate in autoclave; prestare attenzione alle frazioni^dalla 4a alla^6a , che in genere contengono le mEV Msm.
      NOTA: Le mEV di queste frazioni normalmente si frazionano in tre o quattro bande di mEV (una è la banda principale) che sono di colore bianco opaco. Gli R-mEV contenenti mCherry si frazionano tra la 5a^{e la 7a} frazione e appaiono dal viola scuro al magenta. Le Mtb EV in genere si frazionano tra la 5a^{e la 7a} frazione. La separazione delle mEV nel gradiente dipende dalla concentrazione del gradiente utilizzata e dal livello di stratificazione del gradiente. Se le mEV si rompono parzialmente, possono frezzarsi in frazioni precedenti. In alternativa, se il pellet ottenuto dopo il passaggio 2.3.2 non viene risospeso bene, le vescicole formano micropellet densi che si frazionano come frazioni successive. Si consiglia di raccogliere con precisione le frazioni solo quando l'utente desidera valutare quale delle frazioni da 1 mL contiene le mEV. Gli utenti possono voler aliquotare in frazioni più piccole o più grandi in base alla loro convenienza. Quando li utilizziamo per determinate applicazioni, ad esempio testandoli come potenziale richiamo del vaccino a subunità di BCG, limitiamo la nostra raccolta delle mEV a meno di 250 μL delle frazioni (dove le mEV si frazionano) in modo da poter raccogliere in modo specifico solo le bande e il processo delle mEV come indicato al punto 2.7.5. Questo aiuta a rimuovere in modo più efficace tutte le tracce di iodixanolo che possono interferire nel modo dei nostri esperimenti a valle.
6. Giorno 8
   1. Raggruppare le frazioni contenenti mEVs, diluire con tampone HEPES a 38 mL e ripetere l'ultracentrifugazione a 4 ^oC per 16 ore a 100.000 × g. Risospendere il pellet (come al punto 2.3.2 con le stesse precauzioni) nel tampone HEPES o in qualsiasi tampone richiesto dagli esperimenti a valle (non dettagliati qui) come la stima delle proteine, le analisi di nano-tracciamento, la colorazione negativa, la microscopia elettronica a trasmissione, il western blotting e la marcatura immuno-oro.
      NOTA: Per una migliore risospensione, sonicare il tubo contenente mEV per 10 minuti utilizzando un sonicatore a bagno d'acqua ad ultrasuoni. La sonicazione per un tempo più lungo può avviare la rottura e la perdita di mEV intatte. Se ben sospesi, la sonicazione non è necessaria. Tutti i passaggi da 2.1 a 2.6 sono identici arricchendo i veicoli elettrici generati da Mtb.

3. Costruzione e arricchimento di mEV ricombinanti.

NOTA: Una delle 10 proteine più abbondanti (identificate mediante spettrometria di massa) delle vescicole extracellulari Msm è Cfp-29³⁰. Date le sue piccole dimensioni (29 kDa), la struttura secondaria semplice 40, la localizzazione alla membrana⁴¹ e la propensione ad essere secreta in terreni esausti in colture axeniche (ad esempio, come proteina filtrata di coltura; secreta sia da Msm che da Mtb^42,43), qui^, è stata sfruttata per veicolare un reporter fluorescente rosso e una proteina di interesse (EsxA_Mtb) in mEV. Per raggiungere questo obiettivo,

1. Impiegare primer diretti e inversi appropriati (Tabella 1; compatibili per essere clonati direttamente in un vettore navetta come pMV261) per amplificare cfp-29 da Msm. Utilizzando ~50 ng di DNA genomico Msm ad alto peso molecolare (~>20 kb) come stampo, amplificare con PCR il frammento del gene cfp-29 con una DNA polimerasi ad alta fedeltà (come Phusion o Q5). Seguire le raccomandazioni del produttore per la PCR.
   NOTA: Progettare i siti di restrizione necessari in primer per una facile clonazione in qualsiasi vettore shuttle alternativo di interesse. Le condizioni e il volume della PCR variano a seconda del tipo e della marca della DNA polimerasi utilizzata per la correzione di bozze. Il volume della miscela di reazione varierà a seconda della quantità di DNA stampo e della quantità di DNA polimerasi per la correzione di bozze. Seguire le raccomandazioni del produttore per le condizioni della PCR, il successo dell'amplificazione e l'eliminazione della ricottura non specifica dei primer.
2. La PCR purifica l'amplicone eluito con qualsiasi kit di purificazione PCR disponibile in commercio e verifica la lunghezza dell'amplicone mediante elettroforesi standard su gel di agarosio. Digerire l'amplicone purificato.
   1. Stimare la quantità di amplicone purificato su uno spettrofotometro. Utilizzare almeno 2 μg di amplicone cfp-29 per la digestione.
   2. Digerire prima con BstB1 a 65 o C per 1 ora (tipo e quantità di tampone ed enzima, secondo le raccomandazioni del produttore), portare la temperatura di reazione a RT, quindi digerire con HindIII per 1 ora a 37 ^oC (tipo e quantità di tampone ed enzima, secondo le raccomandazioni del produttore).
   3. La PCR purifica ed eluisce l'amplicone digerito in 50 μL di ddw autoclavato privo di nucleasi.
   4. Stimare la concentrazione e la resa dell'amplicone digerito utilizzando uno spettrofotometro. Conservare a -20 ^oC fino all'impostazione della legatura. NOTA: Dopo la PCR, verificare la lunghezza dell'amplicone (~798 + 50 bp) e la resa elettroforando 10 μL della miscela di reazione PCR su un gel di agarosio all'1%. Sebbene la doppia digestione non sia possibile con questa combinazione di enzimi, un tampone compatibile impedirà la purificazione ripetuta della PCR e la successiva perdita dell'amplicone digerito. La concentrazione dell'amplicone digerito varia a seconda del kit utilizzato per la purificazione PCR. Varia anche con la lunghezza (in bp) di qualsiasi vettore alternativo di scelta.
3. Impiega i primer diretti e inversi (Tabella 1), una DNA polimerasi per la correzione di bozze e ~50 ng di DNA genomico Mtb, la PCR amplifica l'amplicone specifico del tag FLAG esxA o esxA-3X. Utilizzare ~5 ng di DNA plasmidico appropriato per amplificare mCherry con PCR. I dettagli del plasmide e della sequenza si trovano nel file supplementare 1.
   NOTA: Utilizzare un linker Glycine, Glycine, Glycine, Glycine, Serine ^44,45(^G4S) tra cfp-29 e mCherry/esxA/esxA-3X FLAG; prima dell'inizio di mCherry, il linker G4S aiuta mCherry a non subire pieghe spurie non funzionali (comprese quelle guidate da Cfp-29). Fare riferimento alle sequenze cfp-29, hsp60 promoter, mCherry ed esxA nel file supplementare 1. I plasmidi che fungono da modelli per mCherry sono disponibili in diversi repository/banche di plasmidi. Sono disponibili diverse versioni (sequenze leggermente alterate) di mCherry che richiedono sequenze di primer avanti e indietro modificate. I primer (Tabella 1) aiutano ad amplificare l'mCherry menzionato nel file supplementare 1. La fusione dell'N-terminale di mCherry/esxA/esxA::3XFLAG all'estremità C-terminale di Cfp-29 funziona bene.
4. Digerire 1 μg di DNA degli ampliconi mCherry/esxA/esxA::3XFLAG e purificare il DNA digerito.
   1. Digerire due volte ogni amplicone con HindIII e HpaI per 1 ora a 37 o C ( ^osecondo le raccomandazioni del produttore).
   2. Utilizzare un kit di purificazione PCR disponibile in commercio e le raccomandazioni del produttore per purificare l'amplicone digerito. Eluire l'amplicone digerito in 50 μL di ddw autoclavato privo di nucleasi.
   3. Stimare la concentrazione e la resa dell'amplicone digerito utilizzando uno spettrofotometro. Conservare a -20 ^oC fino all'impostazione della legatura.
5. Digerire 2 μg di pMV261-Kan^R (file supplementare 1) o un vettore di clonaggio adatto con l'enzima o gli enzimi di scelta.
   1. Digerire prima con BstB1 a 65 o C per 1 ora (tipo e quantità di tampone ed enzima, secondo le raccomandazioni del produttore), portare la temperatura di reazione a RT, quindi digerire con HindIII per 1 ora a 37 ^oC (tipo e quantità di tampone ed enzima, secondo le raccomandazioni del produttore).
   2. Gel purificare ed eluire in 50 μL di ddw autoclavato privo di nucleasi.
   3. Stimare la concentrazione e la resa del vettore digerito utilizzando uno spettrofotometro. Conservare a -20 ^oC fino all'impostazione della legatura.
      NOTA: La clonazione di due frammenti in un solo passaggio è possibile con i primer di cui sopra per pMV261. Qualsiasi vettore navetta alternativo che sopravvive come episoma funzionerà. Anche i plasmidi integrativi funzioneranno, ma la resa proteica ricombinante sarà relativamente inferiore per base cellulare.
6. Liga e si trasforma in un ceppo compatibile di E. coli.
   1. Per la legatura, utilizzare 125 ng del vettore. Utilizzare ampliconi mCherry/esxA/esxA::3XFLAG opportunamente digeriti con un rapporto molare di 1:3. Eseguire la legatura durante la notte utilizzando T4 DNA Ligasi (quantità secondo le raccomandazioni del produttore) a 16 °C in un bagno d'acqua circolante refrigerato.
      NOTA: Utilizzare controlli appropriati come il vettore solo con e senza T4 DNA ligasi per valutare l'efficienza della digestione e prevedere l'efficienza del successo della clonazione.
   2. Trasformazione
      1. Scongelare le aliquote di cellule NEB5α chimicamente competenti (~100 μL per trasformazione) su ghiaccio per 15 min. Mescolare delicatamente due volte con un puntale sterile per pipetta. Aggiungere la miscela di legatura (fino a 20 μL) alle celle fredde competenti.
      2. Mescolare delicatamente le cellule della pipetta + il DNA legato. Incubare la miscela su ghiaccio per altri 30 minuti.
      3. Fornire uno shock termico a 42 °C (a bagnomaria circolante) per 60 s e trasferire immediatamente nel ghiaccio per altri 15 min.
      4. Recuperare le cellule trasformate aggiungendo 1 mL di brodo SOC (2% di triptone, 0,5% di estratto di lievito, 10 mM di NaCl, 2,5 mM di KCl, 10 mM di MgCl₂, 10 mM di MgSO₄ e 20 mM di glucosio) e incubare a 37 °C per 1 ora a 200 giri/min.
      5. Centrifugare i batteri recuperati in una provetta per microcentrifuga da 1,5 mL (3000 × g, RT e 10 min), scartare il surnatante, risospendere il pellet in 200 μL di terreno LB sterile, preriscaldato e appena preparato e distribuire la sospensione su piastre di agar LB Miller appena versate contenenti gli antibiotici necessari a concentrazioni appropriate.
      6. Incubare le piastre di Petri in un'incubatrice a piastre preimpostata a 37 ^°C.
7. Eseguire lo screening (non dettagliato qui) per potenziali cloni, verificare (mediante PCR/enzimi di restrizione delle colonie)⁴⁶ e sequenziarli (sequenziamento con metodo Sanger) per confermare la fusione.
8. Estrarre il DNA plasmidico (~200 ng/1-2 μL; qualsiasi kit disponibile in commercio) del clone confermato (E. coli background) e trasformarlo in cellule elettrocompetenti di Msm appena realizzate.
9. Preparazione di celle elettrocompetenti Msm
   1. Coltiva appena Msm (come nei passaggi 1.2.1 e 1.2.2). Lavare l'Msm appena cresciuto come nei passaggi 1.3.3 e 1.3.4 (tranne che per l'uso di 7H9 + ADC + Tween-80 (ricco) al posto di Sauton).
   2. Aggiungere un'aliquota delle cellule Msm lavate a un OD finale 600 di ~0,05 in un matraccio sterile da₅₀₀ mL contenente 150 mL di terreno ricco.
   3. Incubare nell'agitatore dell'incubatore a 200 giri/min e 37 ^oC fino a quando il diametro esterno della coltura₆₀₀ raggiunge ~0,8-1,0 (~12-14 h).
   4. Trasferire la coltura in un flacone da centrifuga prerefrigerato da 400 ml e incubare su ghiaccio per 60-90 minuti. Quindi, pellettare le cellule a 4 ^oC per 15 minuti a 4.000 × g.
   5. Lavare le cellule due volte (ogni lavaggio con 150 ml, a 4.000 × g, 4 ^oC e 15 min) con glicerolo ghiacciato, sterile (autoclavato) al 10%.
      NOTA: Ad ogni lavaggio, il pellet si allenta. Prestare attenzione quando si getta l'intero surnatante (dopo ogni lavaggio). In caso contrario, la maggior parte delle cellule andrà persa nel surnatante scartato.
   6. Lavare ancora una volta le cellule con 75 ml di glicerolo sterile al 10% contenente lo 0,005% di Tween-80.
   7. Risospendere il pellet cellulare in 7,5 mL di glicerolo al 10% con Tween-80 allo 0,005% e aliquote in aliquote da 400 μL.
      NOTA: Sebbene le celle elettrocompetenti Msm siano competenti per almeno 4 mesi, le celle elettrocompetenti appena preparate danno i migliori risultati. Quando si utilizzano vecchie cellule competenti, alcune colonie non rosa (bianche) appaiono come falsi trasformanti. Più vecchie sono le cellule competenti, più sono le colonie bianche.
10. Trasformazione di Msm
    1. Scongelare le cellule competenti Msm aliquote su ghiaccio.
       NOTA: Lo scongelamento a RT e la trasformazione di tali celle produce una minore efficienza.
    2. Aggiungere 1-2 μL di DNA plasmidico (~200 ng in totale) alle cellule fredde competenti, mescolare delicatamente con un puntale per pipetta sterile da 1 mL e trasferire in una cuvetta sterile per elettroporazione da 2 mm pre-raffreddata.
    3. Trasferire la cuvetta chiusa con la miscela di cellule competenti Msm + DNA plasmidico nel topo dell'elettropomoratore, chiudere delicatamente il coperchio e applicare un impulso (tipo di decadimento esponenziale) a 2,5 kV (tensione), 25 μF (capacità) e 1000 Ω (resistenza).
    4. Aggiungere immediatamente 1 mL di terreno ricco sterile preriscaldato (7H9 + ADC + Tween-80) alla cuvetta, mescolare delicatamente con un puntale per pipetta sterile da 1 mL e trasferire l'intero contenuto in una provetta sterile da 10 mL.
    5. Incubare il contenuto per 3 ore in un agitatore incubatore impostato a 37 ^°C e 200 giri/min. Centrifugare il contenuto in una provetta per microcentrifuga (4.000 × g, RT e 10 min), scartare il surnatante, risospendere il pellet in 200 μL di terreno ricco sterile preriscaldato e distribuire la sospensione su piastre di agar 7H11 appena versate contenenti ADC, Tween-80 e gli antibiotici richiesti a concentrazioni appropriate.
       NOTA: Per l'Msm, quando necessario, utilizzare igromicina, kanamicina e apramicina alle concentrazioni finali di 50 μg/mL, 25 μg/mL e 50 μg/mL, rispettivamente. L'Msm di per sé NON è resistente a questi antibiotici. Utilizzare questi antibiotici solo quando si utilizzano plasmidi con i geni resistenti appropriati per la selezione/crescita di colonie di Msm ricombinanti/trasformanti.
    6. Incubare le piastre di Petri in un'incubatrice a piastre preimpostata a 37 ^°C. In genere, i trasformanti compaiono tra i 3 e i 5 giorni.
       NOTA: Se una proteina di interesse è tossica per Msm, i trasformanti possono emergere più tardi o non emergere. In questi casi, clonare le versioni troncate dell'intera lunghezza.
    7. Effettuare le scorte di glicerolo delle colonie di Msm emergenti dopo aver verificato la presenza di cloni positivi (come al punto 3.7)
11. Per arricchire le R-mEV contenenti proteine mCherry o EsxA, far crescere prima R-Msm che esprime mCherry o exsA o esxA::3X FLAG seguendo i passaggi da 1.2.1 a 1.2.3 e quindi seguire i passaggi da 2.1 a 2.6. per arricchire gli R-mEV. Le R-mEV eluiscono nella^4ª-7ª frazione dopo lo spin del gradiente di densità (passo 2.5). Il pellet di R-mEVs dopo la prima fase di ultracentrifugazione (2.3.1). Dopo aver eseguito l'identica operazione 2.3.1, verificare che gli R-mEV siano visibili come un pellet di 5-7 mm di diametro da viola scuro a magenta in basso al centro dell'ultracentrifuga.
12. Eseguire analisi occidentali⁴⁷ (non dettagliate qui) per rilevare proteine di interesse all'interno delle R-mEV arricchite.

Results

Utilizziamo M. smegmatis (Msm) come micobatterio modello per dimostrare l'arricchimento di mEV sia native che ricombinanti (R-mEV). Questo protocollo di arricchimento di mEV schematicamente riassunto (Figura 1) funziona anche per l'arricchimento di R-mEV di Msm e EV nativi di Mtb (con piccole modifiche come nelle note di protocollo di 1.2). La visualizzazione delle mEV arricchite richiede la loro colorazione negativa al microscopio elettronico^{a trasmissione 36}

Discussion

Poiché lo sviluppo di un nuovo vaccino contro la tubercolosi che sia superiore e in grado di sostituire il BCG rimane una sfida formidabile, in alternativa, diversi gruppi stanno perseguendo la scoperta di diversi vaccini contro la tubercolosi a subunità che possano aumentare la potenza del BCG e prolungarne la durata protettiva^48,49. Data la crescente attenzione alle vescicole extracellulari batteriche (bEV) come potenziali subunità e come adiuvanti naturali

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cabina di biosicurezza di tipo A2	Thermo Fisher Scientific, USA		Centrifuga da banco serie 1300
	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Densitometro cellulare	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Acido citrico	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Fosfato di potassio bibasico	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Acqua bidistillata	Merck, USA		~18,2 MW/cm @ 25 oC
Cuvette per elettroporazione	Bio-Rad, USA
Elettroporatore	Bio-Rad, USA		Elettroporatore
EsxA-specifico Abcam Abcam	, Regno Unito		Coniglio citrato di ammonio ferrico policlonale
	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Centrifuga modello da pavimento	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Vetreria	Borosil, INDIA		1 L Palloni di Erlenmeyer
Glicerolo	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES e cloruro	di sodioSigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Agitatori per incubatori	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagina	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Brodo e Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Solfato di magnesio eptaidrato	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Agitatore magnetico	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Abcam	, Regno Unito		Coniglio monoclonale
Microonde	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Brodo	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Brodo
Middlebrook ADC arricchimento	BD, USA		BBL Middlebrook ADC arricchimento
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		un derivato di DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Disponibile come soluzione madre al 60% (in acqua)
Kit di purificazione PCR	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Mini kit DNA plasmidico	Hi Media, INDIA
Incubatore a piastre	Thermo Fisher Scientific, USA		Nuova serie
Plasmide pMV261	Addgene, USA * *The    plasmide    è    no    altri disponibili in questa banca		Vettore shuttle
Correzione di bozze DNA Polimerasi	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polimerasi
Q5 Correzione di bozze DNA Polimerasi	NEB, USA		NEB
Bagno d'acqua circolante refrigerato	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC brodo	Hi Media, INDIA		Hi Media
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligasi	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Provette per ultracentrifuga - 14 mL	Beckman Coulter, USA		Tipo di poliallomero - tipo ultra chiaro nel rotore SW40Ti
Provette per ultracentrifuga - 38 mL	Beckman Coulter, USA		Tipo in polipropilene - tipo torbido per rotore SW28
Sonicatore a bagno d'acqua per pulizia a ultrasuoni	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator - modello da banco
0,22 & micro; m Filtri monouso	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Concentratori Centricon	Merck, USA		Filtri centrifughi Amicon Ultra - Anticorpo Millipore
3X FLAG	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Flaconi da centrifuga	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
Provette	da centrifuga da 50 mLCorning, USA		Sterile, preconfezionato
Batteri
Ceppo<
em>Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alfa (un derivato di DH5&alfa;).
Msm esprime cfp29::mCherry	Questo studio		MC2  155
Msm che esprimono cfp29::esxA	Questo studio		MC2  155
Msm che esprimono cfp29::esxA::3X FLAG	Questo studio		MC2  155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA&		nbsp; MC2  155