Arricchimento di vescicole extracellulari native e ricombinanti di micobatteri

Sommario

Questo protocollo descrive in dettaglio l'arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche native (mEV) da colture axeniche di Mycobacterium smegmatis (Msm) e come possono essere progettate e arricchite le MsmEV ricombinanti contenenti mCherry (un reporter fluorescente rosso). Infine, verifica il nuovo approccio con l'arricchimento di MsmEVs contenenti la proteina EsxA di Mycobacterium tuberculosis.

Abstract

La maggior parte dei batteri, compresi i micobatteri, genera vescicole extracellulari (EV). Poiché le vescicole extracellulari batteriche (bEV) contengono un sottoinsieme di componenti cellulari, tra cui metaboliti, lipidi, proteine e acidi nucleici, diversi gruppi hanno valutato le versioni native o ricombinanti delle bEV per la loro potenza protettiva come candidati vaccini a subunità. A differenza delle vescicole extracellulari native, le vescicole extracellulari ricombinanti sono molecolarmente ingegnerizzate per contenere uno o più immunogeni di interesse. Nell'ultimo decennio, diversi gruppi hanno esplorato diversi approcci per la generazione di bEV ricombinanti. Tuttavia, qui, riportiamo la progettazione, la costruzione e l'arricchimento di vescicole extracellulari micobatteriche ricombinanti (mEV) nei micobatteri. A tal fine, utilizziamo Mycobacterium smegmatis (Msm), un micobatterio avirulento del suolo come sistema modello. Per prima cosa descriviamo la generazione e l'arricchimento di vescicole extracellulari native di Msm. Quindi, descriviamo la progettazione e la costruzione di mEV ricombinanti che contengono mCherry, una proteina reporter fluorescente rossa, o EsxA (Esat-6), un importante immunogeno di Mycobacterium tuberculosis. Raggiungiamo questo risultato fondendo separatamente mCherry ed EsxA N-termini con il C-terminale di una piccola proteina Msm Cfp-29. Cfp-29 è una delle poche proteine abbondantemente presenti delle MsmEV. Il protocollo per generare e arricchire mEV ricombinanti da Msm rimane identico alla generazione e all'arricchimento di EV native di Msm.

Introduzione

Nonostante lo sviluppo e la somministrazione di un'ampia gamma di vaccini contro le malattie infettive, ancora oggi, ~30% di tutti i decessi umani si verifica ancora a causa^{di malattie} trasmissibili. Prima dell'avvento del vaccino contro la tubercolosi (TB) - Bacillus Calmette Guerin (BCG) - la tubercolosi era il killer numero uno (~10.000-15.000/100.000 abitanti)². Con la somministrazione di BCG e il facile accesso ai farmaci antitubercolari di prima e seconda linea, entro il 2022, i decessi correlati alla tubercolosi sono drasticamente scesi a ~ 1 milione / anno entro il 2022 (cioè, ~ 15-20/100.000 popolazione

Protocollo

1. Condizioni di crescita di Mycobacterium smegmatis, Escherichia coli e loro derivati

1. Media
   1. Brodo liquido Middlebrook 7H9
      1. Preparare la soluzione madre Tween-80 al 20% preriscaldando il volume richiesto di acqua bidistillata (ddw) in un bicchiere di vetro a ~45-50 ^oC in un microonde, aggiungere il volume richiesto di Tween-80 utilizzando un cilindro graduato appropriato e agitare continuamente su un piccolo agitatore magnetico per portare il Tween-80 al 20% in soluzione uniforme. Filtrare il Tween-80 al 20% attraverso un filtro di smaltimento da 0,22 um e conservare....

Risultati

Utilizziamo M. smegmatis (Msm) come micobatterio modello per dimostrare l'arricchimento di mEV sia native che ricombinanti (R-mEV). Questo protocollo di arricchimento di mEV schematicamente riassunto (Figura 1) funziona anche per l'arricchimento di R-mEV di Msm e EV nativi di Mtb (con piccole modifiche come nelle note di protocollo di 1.2). La visualizzazione delle mEV arricchite richiede la loro colorazione negativa al microscopio elettronico^{a trasmissione 36}

Discussione

Poiché lo sviluppo di un nuovo vaccino contro la tubercolosi che sia superiore e in grado di sostituire il BCG rimane una sfida formidabile, in alternativa, diversi gruppi stanno perseguendo la scoperta di diversi vaccini contro la tubercolosi a subunità che possano aumentare la potenza del BCG e prolungarne la durata protettiva^48,49. Data la crescente attenzione alle vescicole extracellulari batteriche (bEV) come potenziali subunità e come adiuvanti naturali

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Cabina di biosicurezza di tipo A2	Thermo Fisher Scientific, USA		Centrifuga da banco serie 1300
	Eppendorf, USA		5810 R
BstB1, HindIII, HpaI	NEB, USA		NEB
Densitometro cellulare	GE Healthcare, USA		Ultraspec 10
Acido citrico	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Fosfato di potassio bibasico	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Acqua bidistillata	Merck, USA		~18,2 MW/cm @ 25 oC
Cuvette per elettroporazione	Bio-Rad, USA
Elettroporatore	Bio-Rad, USA		Elettroporatore
EsxA-specifico Abcam Abcam	, Regno Unito		Coniglio citrato di ammonio ferrico policlonale
	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Centrifuga modello da pavimento	Thermo Fisher Scientific, USA		Sorvall RC6 plus
Vetreria	Borosil, INDIA		1 L Palloni di Erlenmeyer
Glicerolo	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
HEPES e cloruro	di sodioSigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Agitatori per incubatori	Thermo Fisher Scientific, USA		MaxQ 6000 & 8000
L-Asparagina	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Luria Bertani Brodo e Agar, Miller	Hi Media, INDIA		Hi Media
Solfato di magnesio eptaidrato	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Agitatore magnetico	Tarsons, INDIA		Tarsons
mCherry-specific Abcam	, Regno Unito		Coniglio monoclonale
Microonde	LG, INDIA		MC3286BLT
Middlebrook 7H9 Brodo	BD, USA		Difco Middlebrook 7H9 Brodo
Middlebrook ADC arricchimento	BD, USA		BBL Middlebrook ADC arricchimento
Nanodrop	Thermo Fisher Scientific, USA		Spectronic 200 UV-Vis
NEB5a	NEB, USA		un derivato di DH5a
Optiprep (Iodixanol)	Merck, USA		Disponibile come soluzione madre al 60% (in acqua)
Kit di purificazione PCR	Hi Media, INDIA		Hi Media
pH Meter	Mettler Toledo, USA		Mettler Toledo
Mini kit DNA plasmidico	Hi Media, INDIA
Incubatore a piastre	Thermo Fisher Scientific, USA		Nuova serie
Plasmide pMV261	Addgene, USA * *The    plasmide    è    no    altri disponibili in questa banca		Vettore shuttle
Correzione di bozze DNA Polimerasi	Thermo Fisher Scientific, USA		Phusion DNA Plus Polimerasi
Q5 Correzione di bozze DNA Polimerasi	NEB, USA		NEB
Bagno d'acqua circolante refrigerato	Thermo Fisher Scientific, USA		R20
Middlebrock 7H11 Agar base	BD, USA		BBL Seven H11 Agar base
SOC brodo	Hi Media, INDIA		Hi Media
Idrossido di sodio	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
T4 DNA Ligasi	NEB, USA		NEB
Tween-80	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
Ultracentrifuge	Beckman Coulter, USA		Optima L100K
Provette per ultracentrifuga - 14 mL	Beckman Coulter, USA		Tipo di poliallomero - tipo ultra chiaro nel rotore SW40Ti
Provette per ultracentrifuga - 38 mL	Beckman Coulter, USA		Tipo in polipropilene - tipo torbido per rotore SW28
Sonicatore a bagno d'acqua per pulizia a ultrasuoni	Thermo Fisher Scientific, USA		Sonicator - modello da banco
0,22 & micro; m Filtri monouso	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
30-kDa Concentratori Centricon	Merck, USA		Filtri centrifughi Amicon Ultra - Anticorpo Millipore
3X FLAG	Sigma-Aldrich, Merck, USA		Sigma Aldrich
400 mL Flaconi da centrifuga	Thermo Fisher Scientific, USA		Nunc-Nalgene
Provette	da centrifuga da 50 mLCorning, USA		Sterile, preconfezionato
Batteri
Ceppo<
em>Escherichia coli	NEB, USA		NEB 5-alfa (un derivato di DH5&alfa;).
Msm esprime cfp29::mCherry	Questo studio		MC2  155
Msm che esprimono cfp29::esxA	Questo studio		MC2  155
Msm che esprimono cfp29::esxA::3X FLAG	Questo studio		MC2  155
Mycobacterium smegmatis (Msm)	Prof. Sarah M. Fortune, Harvard Univ, USA&		nbsp; MC2  155